Untersuchung zur endogenen Bildung von oxidativen DNA-Schäden in vivo und in vitro

In dieser Arbeit sollte der Einfluss einer Überproduktion von humaner Superoxiddismutase 1 (hSOD1) auf die Spiegel der DNA-Schäden in verschiedenen Geweben von transgenen Mäusen untersucht werden. Tiere die eine Defizienz des Ogg1- und Csb- Proteins aufweisen und deshalb oxidative Purinmodifikationen nicht oder nur schwer reparieren können, akkumulieren 8-oxoG im Laufe ihres Lebens (Osterod, et al. 2001). Aus diesem Grund sind diese ein gutes Modell, um protektive Eigenschaften von Antioxidantien wie z.B. Substanzen oder Enzymen zu untersuchen. Fusser, et al. 2011 konnten beispielsweise zeigen, dass das pflanzliche Polyphenol Resveratrol die endogenen Spiegel an 8-oxoG sowie die spontanen Mutatiosraten im Lac I - Gen senken kann. Um den Einfluss von hSOD1 in vivo zu untersuchen, wurden in zwei Zuchtschritten 4 Mausgenotypen generiert, nämlich (Csb -/- Ogg1 -/- und Csb +/- Ogg1 +/- Mäuse jeweils mit ohne hSOD1 Überexpression). Diese wurden in verschiedenen Altersstufen auf die Basalspiegel an oxidativen Schäden (Einzelstrangbrüche und Fpg-sensitive Läsionen) in der Leber, der Niere und der Milz untersucht. Die Genotypen wurden zunächst charakterisiert und die hSOD1-Überexpression mittels qRT-PCR, Western Blot und Enzymaktivitätsbestimmung verifiziert. Es konnte an diesen Tieren erstmalig gezeigt werden, dass SOD die Generierung von DNA-Schäden in vivo mit zunehmendem Alter der Tiere senkt und dass deshalb Superoxid eine der reaktiven Sauerstoffspezies ist, die unter physiologischen Bedingungen für die DNA-Schäden verantwortlich ist. Außerdem kann ein möglicher toxischer Effekt der Überproduktion von SOD ausgeschlossen werden. Erhöhte Spiegel an oxidativen DNA-Schäden durch womöglich erhöhte Spiegel an H2O2 konnten in dieser Studie nicht beobachtet werden. Eine Messung der Genexpression anderer antioxidativer Enzyme wie Katalase, SOD2 und SOD3, GPX oder HO1 sind an diesem Effekt nicht beteiligt. Auch konnte kein Einfluss des redoxsensitiven Transkriptionsfaktors Nrf2 gezeigt werden. rnUm mögliche Quellen der für die oxidativ gebildeten DNA-Schäden verantwortlichen ROS zu identifizieren, wurde der Einfluss des Dopaminstoffwechsels untersucht. Während des Dopaminmetabolismus werden intrazellulär Reaktive Sauerstoffspezies (H2O2 und O2.-) gebildet und tragen sehr wahrscheinlich zur Entstehung von neurodegenerativen Erkrankungen wie Parkinson bei. In dem gängigen Parkinson-Zellkulturmodell SH-SY5Y konnte keine Erhöhung von oxidativen Schäden in nukleärer DNA nach Dopaminbehandlung nachgewiesen werden. Eine Überexpression der Dopaminmetabolisierenden Enzyme MAO-A und MAO-B zeigen bei niedrigen Dosen Dopamin eine leichte jedoch nicht signifikante Erhöhung der Fpg-sensitiven Modifikationen. Die Überproduktion des Dopamintransporters zeigte keinen Effekt nach Dopaminzugabe. Es kann geschlussfolgert werden, dass durch erhöhte MAO-A und MAO-B endogen ROS gebildet werden, die die Bildung Fpg-sensitiver Läsionen hervorrufen. Bei hohen Dosen und langer Inkubationszeit steht die Dopaminautoxidation, anschließende Neuromelaninbildung und als Konsequenz Apoptose im Vordergrund.rn

Dynamics of small interfering RNA - FRET based integrity measurements of siRNA in the cuvette & inside cells

RNAi ist ein bedeutendes Werkzeug zur Funktionsanalyse von Genen und hat großes Potential für den Einsatz in der Therapie. Obwohl effiziente Knockdowns in der Zellkultur erzielt werden, erweist sich eine in vivo Anwendung als schwierig. Die großen Hürden sind dabei der Transport der siRNA ins Zielgewebe und deren voranschreitende Degradierung.rnMarkierte siRNA kann sowohl zur eigenen Integritätsmessung als auch zur Lokalisierung verwendet werden. Zwei Farbstoffe an den jeweiligen 3’- bzw. -5’-Enden des Sense- bzw. Antisense-Stranges erzeugen ein robustes FRET-System (Hirsch et al. 2012). Das Verhältnis von FRET- zu Donor-Signal, das R/G-Ratio, dient zur sensitiven Klassifizierung des Integritätslevels einer siRNA Probe (Järve et al. 2007; Hirsch et al. 2011; Kim et al. 2010). Mit diesem System kann eine Degradierung von weniger als 5 % in der Küvette und in Zellen nachgewiesen werden.rnDie vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Evaluierung von potentiellen FRET Farbstoffpaaren hinsichtlich deren Eignung für in vitro und in vivo Anwendung. Verschiedenste FRET-Paare, die das gesamte sichtbare Spektrum abdecken, wurden evaluiert und ermöglichen nun die Auswahl eines geeigneten Paares für die jeweilige Anwendung oder Kombination mit anderen Farbstoffen.rnMit Hilfe von Alexa555/Atto647N siRNA wurde ein erfolgreicher Einschluss von siRNA in Liposomen beobachtet. Eine anschließende Evaluierung der RNase-Protektion ergab für Liposomen, Nanohydrogele und kationische Peptide hervorragende protektive Eigenschaften. Basierend auf den Ergebnisse können diese und andere Transportsysteme nun für eine zelluläre Aufnahme optimiert werden.rnAtto488/Atto590 zeigte die besten Eigenschaften für Echtzeit-Integritätsmessungen in der Lebendzellmikroskopie. Verringerte Bleicheigenschaften und minimaler spektraler “Cross-Talk” ermöglichten es, transfizierte Zellen über einen Zeitraum von bis zu 8 Stunden zu beobachten. Mittels Atto488/Atto590 siRNA wurde die Einschleusung und Freisetzung in Zellen in Echtzeit untersucht. Dabei konnten Freisetzung und Verteilung in einzelnen Zellen beobachtet und analysiert werden. rnAuf eine anfängliche Phase mit hoher Freisetzungsrate folgte eine Phase mit geringerer Rate für den restlichen Beobachtungszeitraum. Die durchschnittliche Verweildauer im Zytosol betrug 24 und 58 Minuten, wobei zwischen lang- und kurzanhaltenden Ereignissen unterschieden werden konnte. Obwohl ein Import von siRNA in den Zellkern beobachtet wurde, konnte kein Schema bzw. genauer Zeitpunkt, in Bezug auf den Transfektionszeitraum für diese Ereignisse bestimmt werden. Die beobachteten Freisetzungsprozesse fanden sporadisch statt und Änderungen in der zellulären Verteilung geschahen innerhalb von wenigen Minuten. Einmal freigesetzte siRNA verschwand mit der Zeit wieder aus dem Zytosol und es blieben nur kleine Aggregate von siRNA mit immer noch geringer Integrität zurück.rn

Functionalization and detection of RNA and its modifications

Unterschiedlich substituierte Reagenzien, basierend auf dem Cumarin Körper, wurden untersucht und Struktur-Funktions-Beziehungsstudien zeigten eine Selektivität für ein natürlich vorkommendes, modifiziertes Nukleosid, 4-Thiouridine (s4U). Im Verlauf dieser Experimente, fiel ein multifunktionales Cumarin, namens PBC, aus mehreren Gründen auf. Neben seiner 2000 fachen Selektivität für s4U gegenüber Uridin, besitzt PBC ein zusätzliches terminales Alkin für Konjugationsreaktionen mit Aziden. Es wurde zusätzlich zur Fluoreszenzmarkierung von small interfering RNA benutzt, deren Fluoreszenz in Zellen beobachtet werden konnte. Mit PBC kommt ein neues chemisches Reagenz zur Detektion von modifizierten Nukleosiden zum bereits vorhandenen Repertoire hinzu.rnDiese Arbeit zeigt zusätzlich eine neue Labelingstrategie, basierend auf einem kleinen, multifunktionalen chemischen Reagenz, welches spezifisch mit Uridinen in RNA reagiert. Dieses Cumarin-basierte Reagenz, namens N3BC, hat den Vorteil (I) post-transkriptionell gegenüber allen möglichen RNAs einsetzbar zu sein, (II) Fluoreszenz zu zeigen und (III) eine weitere funktionelle Gruppe zu besitzen, die in Biokonjugationsreaktionen einsetzbar ist. Die letzteren umfassen z.B. die durch UV ausgelösten crosslinking Experimente mit verwandten Proteinen, sowie die bioorthognale CuAAC Reaktion mit fluoreszenten Alkin-Farbstoffen.rnFür verlässliche Detektion wurden mehrere LC-MS/MS Methoden, zur Identifizierung und Quantifizierung von bis zu 21 Ribonukleosiden und 5 Deoxyribonukleosiden in einem Einzellauf, entwickelt. Zusätzlich wurden diese Methoden in mehreren Studien, hauptsächlich von Methyltransferasen, angewandt. rn