Atomic force microscopy of biomimetic systems

This thesis was driven by the ambition to create suitable model systems that mimic complex processes in nature, like intramolecular transitions, such as unfolding and refolding of proteins, or intermolecular interactions between different cell compo-nents. Novel biophysical approaches were adopted by employing atomic force mi-croscopy (AFM) as the main measurement technique due to its broad diversity. Thus, high-resolution imaging, adhesion measurements, and single-molecule force distance experiments were performed on the verge of the instrumental capabilities. As first objective, the interaction between plasma membrane and cytoskeleton, me-diated by the linker protein ezrin, was pursued. Therefore, the adsorption process and the lateral organization of ezrin on PIP2 containing solid-supported membranes were characterized and quantified as a fundament for the establishment of a biomimetic model system. As second component of the model system, actin filaments were coated on functionalized colloidal probes attached on cantilevers, serving as sensor elements. The zealous endeavor of creating this complex biomimetic system was rewarded by successful investigation of the activation process of ezrin. As a result, it can be stated that ezrin is activated by solely binding to PIP2 without any further stimulating agents. Additional cofactors may stabilize and prolong the active conformation but are not essentially required for triggering ezrin’s transformation into an active conformation. In the second project, single-molecule force distance experiments were performed on bis-loop tetra-urea calix[4]arene-catenanes with different loading rates (increase in force per second). These macromolecules were specifically designed to investigate the rupture and rejoining mechanism of hydrogen bonds under external load. The entangled loops of capsule-like molecules locked the unbound state of intramolecular hydrogen bonds mechanically, rendering a rebinding observable on the experimental time scale. In conjunction with Molecular Dynamics simulations, a three-well potential of the bond rupture process was established and all kinetically relevant parameters of the experiments were determined by means of Monte Carlo simulations and stochastic modeling. In summary, it can be stated that atomic force microscopy is an invaluable tool to scrutinize relevant processes in nature, such as investigating activation mechanisms in proteins, as shown by analysis of the interaction between F-actin and ezrin, as well as exploring fundamental properties of single hydrogen bonds that are of paramount interest for the complete understanding of complex supramolecular structures.

Fyn kinase targets in oligodendroglial physiology and myelination

In the central nervous system (CNS), oligodendrocytes form the multilamellar and compacted myelin sheath by spirally wrapping around defined axons with their specialised plasma membrane. Myelin is crucial for the rapid saltatory conduction of nerve impulses and for the preservation of axonal integrity. The absence of the major myelin component Myelin Basic Protein (MBP) results in an almost complete failure to form compact myelin in the CNS. The mRNA of MBP is sorted to cytoplasmic RNA granules and transported to the distal processes of oligodendrocytes in a translationally silent state. A main mediator of MBP mRNA localisation is the trans-acting factor heterogeneous nuclear ribonucleoprotein (hnRNP) A2 which binds to the cis-acting A2 response element (A2RE) in the 3’UTR of MBP mRNA. A signalling cascade had been identified that triggers local translation of MBP at the axon-glial contact site, involving the neuronal cell adhesion molecule (CAM) L1, the oligodendroglial plasma membrane-tethered Fyn kinase and Fyn-dependent phosphorylation of hnRNP A2. This model was confirmed here, showing that L1 stimulates Fyn-dependent phosphorylation of hnRNP A2 and a remodelling of A2-dependent RNA granule structures. Furthermore, the RNA helicase DDX5 was confirmed here acting together with hnRNP A2 in cytoplasmic RNA granules and is possibly involved in MBP mRNA granule dynamics.rnLack of non-receptor tyrosine kinase Fyn activity leads to reduced levels of MBP and hypomyelination in the forebrain. The multiadaptor protein p130Cas and the RNA-binding protein hnRNP F were verified here as additional targets of Fyn in oligodendrocytes. The findings point at roles of p130Cas in the regulation of Fyn-dependent process outgrowth and signalling cascades ensuring cell survival. HnRNP F was identified here as a novel constituent of oligodendroglial cytoplasmic RNA granules containing hnRNP A2 and MBP mRNA. Moreover, it was found that hnRNP F plays a role in the post-transcriptional regulation of MBP mRNA and that defined levels of hnRNP F are required to facilitate efficient synthesis of MBP. HnRNP F appears to be directly phosphorylated by Fyn kinase what presumably contributes to the initiation of translation of MBP mRNA at the plasma membrane.rnFyn kinase signalling thus affects many aspects of oligodendroglial physiology contributing to myelination. Post-transcriptional control of the synthesis of the essential myelin protein MBP by Fyn targets is particularly important. Deregulation of these Fyn-dependent pathways could thus negatively influence disorders involving the white matter of the nervous system.rnrn

Induktion von Pro-Autophagie-Signalen durch einen extra- oder intrazellulären Alpha-Toxin-Angriff

Autophagie ist ein konservierter, kataboler Mechanismus in allen eukaryoten Zellen. Unter anderem wird ihm eine wichtige Rolle als zellautonomer Abwehrmechanismus gegen Mikroorganismen zugeschrieben; von manchen Infektionserregern wird er jedoch unterlaufen oder sogar genutzt. Der stärkste Auslöser der Autophagie ist ein Mangel an Nährstoffen, insbesondere Aminosäuren. Über die Deaktivierung der Kinase mTORC1 und die Phosphorylierung des eukaryoten Translationsinitiationsfaktors eIF2α hemmt die Nährstoffknappheit die Proteinbiosynthese und aktiviert gleichzeitig Autophagie. Wie Mikroorganismen, insbesondere Bakterien, Autophagie auslösen oder manipulieren, ist derzeit Gegenstand intensiver Forschung. Modifikationen an Mikroben oder Phagosomen und Adapterproteine, die diese Veränderungen und Komponenten des Autophagieapparates erkennen, scheinen jedenfalls bei der selektiven Erkennung durch die Autophagie-Maschinerie wichtig zu sein. rnIn der vorliegenden Dissertationsarbeit wird die Rolle des membranporenbildenden α-Toxins von Staphylococcus aureus für die Induktion von Autophagie beleuchtet. Zum einen erwies sich die Akkumulation von (EGFP)-LC3(II), einem Marker der Autophagosomen, um intrazelluläre S. aureus als abhängig von α-Toxin. Zweitens, genügt extrazellulär appliziertes α-Toxin um (EGFP)-LC3(II)-positive Endosomen zu induzieren. Während der Angriff aus dem extrazellulären Raum jedoch binnen kurzer Zeit eine fokale Kumulation von phosphoryliertem eIF2α an der Plasmamembran induziert, die an der Internalisierung des Toxins beteiligt ist, findet sich am phagosomalen Kompartiment keine Toxin-abhängige Anhäufung von p-eIF2α oder proximalen Autophagieregulatoren. Dies impliziert, dass Toxin-Angriff auf die Plasmamembran, nicht aber auf das Phagosom, zu einer Reaktion führt, wie sie bei massivem Nährstoffmangel zu beobachten ist. Obwohl keine α-Toxin-abhängige Kumulation von p-eIF2α bei einem Angriff aus dem Phagosom erfolgt, findet sich um α-Toxin-produzierende Bakterien eine massive Kumulation von LC3 und Adapterprotein p62/Sequestosome1. Dies deutet daraufhin, dass der Ort des Angriffs - Plasmamembran oder Phagosom – für den Autophagie-induzierenden Mechanismus wichtig sein könnte. Der unterschiedliche Effekt auf die zellulären Ionenkonzentrationen, den ein Angriff auf die Plasmamembran oder auf ein Phagosom auslösen würde, bietet hierfür eine mögliche Erklärung. Die Aktivierung der Autophagie über Adapterproteine könnte dann als back-up Mechanismus fungieren, der auch dann greift, wenn eine Invasion ohne Schädigung der Plasmamembran erfolgt. Ein cross-talk der beiden Induktionswege ist angesichts der Bedeutung von p62 für die selektive und die Hunger-assoziierte Autophagie gut möglich; sezerniertes Toxin könnte durch die Aktivierung der basalen Autophagie Adapter-basierte Mechanismen verstärken.

Funktionelle Analyse der Plasmamembran-Ca 2+-ATPase 2 -PMCA2- in Modellen der Neurodegeneration

Calcium (Ca2+) ist ein ubiquitär vorkommendes Signalmolekül, das an der Regulation zahlreicher zellulärer Prozesse, von der Proliferation bis zum programmierten Zelltod, beteiligt ist. Daher müssen die intrazellulären Ca2+-Spiegel streng kontrolliert werden. Veränderungen der Ca2+-Homöostase während der altersassoziierten Neurodegeneration können dazu beitragen, dass Neuronen vulnerabler sind. So wurden erhöhte Ca2+-Konzentrationen in gealterten Neuronen, begleitet von einer erhöhten Vulnerabilität, beobachtet (Hajieva et al., 2009a). Weiterhin wird angenommen, dass der selektive Untergang von dopaminergen Neuronen bei der Parkinson Erkrankung auf eine erhöhte Ca2+-Last zurückzuführen sein könnte, da diese Neuronen einem ständigen Ca2+-Influx,rnaufgrund einer besonderen Isoform (CaV 1.3) spannungsgesteuerter Ca2+-Kanäle des L-Typs, ausgesetzt sind (Chan et al., 2007). Bislang wurden die molekularen Mechanismen, die einem Ca2+-Anstieg zu Grunde liegen und dessen Auswirkung jedoch nicht vollständig aufgeklärt und daher in der vorliegenden Arbeit untersucht. Um Veränderungen der Ca2+-Homöostase während der altersassoziiertenrnNeurodegeneration zu analysieren wurden primäre Mittelhirnzellen aus Rattenembryonen und SH-SY5Y-Neuroblastomazellen mit dem Neurotoxin 1-Methyl-4-Phenyl-Pyridin (MPP+), das bei der Etablierung von Modellen der Parkinson-Erkrankung breite Anwendung findet, behandelt. Veränderungen der intrazellulären Ca2+-Konzentration wurden mit einem auf dem grün fluoreszierenden Protein (GFP)-basierten Ca2+-Indikator,rn„Cameleon cpYC 3.6“ (Nagai et al., 2004), ermittelt. Dabei wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass MPP+ die Abregulation der neuronenspezifischen ATP-abhängigen Ca2+-Pumpe der Plasmamembran (PMCA2) induziert, die mit der Ca2+-ATPase des endoplasmatischen Retikulums (SERCA) und dem Na+/Ca2+-Austauscher (NCX) das zelluläre Ca2+-Effluxsystem bildet, was zu einer erhöhten zytosolischen Ca2+-Konzentration führt. Die PMCA2-Abnahme wurde sowohl auf Transkriptionsebene als auch auf Proteinebene demonstriert, während keine signifikanten Veränderungen der SERCA- und NCX-Proteinmengen festgestellt wurden. Als Ursache der Reduktion der PMCA2-Expression wurde eine Abnahme des Transkriptionsfaktors Phospho-CREB ermittelt, dessen Phosphorylierungsstatus abhängig von der Proteinkinase A (PKA) war. Dieser Mechanismus wurde einerseits unter MPP+-Einfluss und andererseits vermittelt durch endogene molekulare Modulatoren gezeigt. Interessanterweise konnten die durch MPP+ induzierte PMCA2-Abregulation und der zytosolische Ca2+-Anstieg durch die Aktivierung der PKA verhindert werden. Parallel dazu wurde eine MPP+-abhängige verringerte mitochondriale Ca2+-Konzentration nachgewiesen, welche mit einer Abnahme des mitochondrialen Membranpotentials korrelierte. Darüber hinaus kam es als Folge der PMCA2-Abnahme zu einem verminderten neuronalen Überleben.rnVeränderungen der Ca2+-Homöostase wurden auch während der normalen Alterung inrnprimären Fibroblasten und bei Mäusen nachgewiesen. Dabei wurden verringerte PMCA und SERCA-Proteinmengen in gealterten Fibroblasten, einhergehend mit einem Anstieg der zytosolischen Ca2+-Konzentration demonstriert. Weiterhin wurden verringerte PMCA2-Proteinmengen im Mittelhirn von gealterten Mäusen (C57B/6) detektiert.rnDer zelluläre Ca2+-Efflux ist somit sowohl im Zuge der physiologischen Alterung als auch in einem altersbezogenen Krankheitsmodell beeinträchtigt, was das neuronale Überleben beeinflussen kann. In zukünftige Studien soll aufgeklärt werden, welche Auswirkungen einer PMCA2-Reduktion genau zu dem Verlust von Neuronen führen bzw. ob durch eine PMCA2-Überexpression neurodegenerative Prozesse verhindert werden können.

3D-ultrastructure, functions and stress responses of rhogocytes from the freshwater gastropods Biomphalaria glabrata and Lymnaea stagnalis

Rhogocytes, also termed ‘pore cells’, exist free in the hemolymph or embedded in the connective tissue of different body parts of molluscs, notably gastropods. These unique cells can be round, elongated or irregularly shaped, and up to 30 μm in diameter. Their hallmark is the so-called slit apparatus: i.e. pocket-like invaginations of the plasma membrane creating extracellular lacunae, bridged by cytoplasmic bars. These bars form distinctive slits of ca. 20 nm width. A slit diaphragm composed of proteins establishes a molecular sieve with holes of 20 x 20 nm. Different functions have been assigned to this special molluscan cell type, notably biosynthesis of the hemolymph respiratory protein hemocyanin. It has further been proposed, but not proven, that in the case of red-blooded snail species rhogocytes might synthesize the hemoglobin. However, the secretion pathway of these hemolymph proteins, and the functional role of the enigmatic slit apparatus remained unclear. Additionally proposed functions of rhogocytes, such as heavy metal detoxification or hemolymph protein degradation, are also not well studied. This work provides more detailed electron microscopical, histological and immunobiochemical information on the structure and function of rhogocytes of the freshwater snails Biomphalaria glabrata and Lymnaea stagnalis. By in situ hybridization on mantle tissues, it proves that B. glabrata rhogocytes synthesize hemoglobin and L. stagnalis rhogocytes synthesize hemocyanin. Hemocyanin is present, in endoplasmic reticulum lacunae and in vesicles, as individual molecules or pseudo-crystalline arrays. The first 3D reconstructions of rhogocytes are provided by means of electron tomography and show unprecedented details of the slit apparatus. A highly dense material in the cytoplasmic bars close to the diaphragmatic slits was shown, by immunogold labeling, to contain actin. By immunofluorescence microscopy, the protein nephrin was localized at the periphery of rhogocytes. The presence of both proteins in the slit apparatus supports the previous hypothesis, hitherto solely based on similarities of the ultrastructure, that the molluscan rhogocytes are phylogenetically related to mammalian podocytes and insect nephrocytes. A possible secretion pathway of respiratory proteins that includes a transfer mechanism of vesicles through the diaphragmatic slits is proposed and discussed. We also studied, by electron microscopy, the reaction of rhogocytes in situ to two forms of animal stress: deprivation of food and cadmium contamination of the tank water. Significant cellular reactions to both stressors were observed and documented. Notably, the slit apparatus surface and the number of electron-dense cytoplasmic vesicles increased in response to cadmium stress. Food deprivation led to an increase in hemocyanin production. These observations are also discussed in the framework of using such animals as potential environmental biomarkers.