Systematic studies of the interaction between amyloid beta-protein and lipids

The amyloid peptide (Aß), a normal constituent of neuronal and non-neuronal cells, has been shown to be a major component of the extracellular plaque of Alzheimer’s disease (AD). The interaction of Aß peptides with the lipid matrix of neuronal cell membranes plays an important role in the pathogenesis of AD. In this study, we have developed peptide-tethered artificial lipid membranes by the Langmuir-Blodgett and Langmuir-Schaefer methods. Anti-Aß40-mAb labeled with a fluorophore was used to probe the Aß40 binding to the model membrane system. Systematic studies on the antibody or Aß-membrane interactions were carried out in our model systems by Surface Plasmon Field-Enhanced Fluorescence Spectroscopy (SPFS). Aß adsorption is critically determined by the lipid composition of the membranes. Aß specifically binds with membranes of sphingomyelin, and this preferential adsorption was markedly amplified by the addition of sterols (cholesterol or 25-OH-Chol). Fluorescence microscopy indicated that 25-OH-Chol could also form micro-domains with sphingomyelin as cholesterol does at the conditions used for the built-up of the model membranes. Our findings suggest that micro-domains composed of sphingomyelin and the sterols could be the binding sites of Aß and the role of sphingomyelin in AD should receive much more attention. The artificial membranes provide a novel platform for the study on AD, and SPFS is a potential tool for detecting Aß-membrane interaction. Numerous investigations indicate that the ability of Aß to form fibrils is considerably dependent upon the levels of ß-sheet structure adopted by Aß. Membrane-mediated conformational transition of Aß has been demonstrated. In this study, we focus on the interaction of Aß and the membranes composed of POPC/SM/25-OH-Chol (2:1:1). The artificial membrane system was established by the methods as described above. Immunoassy based on a pair of monoclonal antibodies (mAbs) against different epitopes was employed to detect the orientation of the Aß at the model membranes. Kinetics of antibody-Aß binding was determined by surface plasmon field-enhanced fluorescence spectroscopy (SPFS). The attempt has also been made to probe the change in the conformation of Aß using SPFS combined with immunoassay. Melatonin was employed to induce the conformational change of Aß. The orientation and the conformational change of Aß are evaluated by analysing kinetic/affinity parameters. This work provides novel insight into the investigation on the structure of Aß at the membrane surface.

Cholesterin-Interaktion mit G-Protein-gekoppelten Rezeptoren und intrazelluläre Verteilung

ZusammenfassungIn dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass neben dem Oxytocinrezeptor auch die anderen Rezeptoren der Familie der Neurohypophysenhormone, die Vasopressinrezeptoren, in der gleichen Weise in ihren Bindungseigenschaften von Cholesterin beeinflusst werden. Im Gegensatz dazu zeigt der Cholecystokininrezeptor Typ B keine direkte Wechselwirkung mit Cholesterin. Durch Austausch der Transmembranhelices 6 und 7 des Oxytocinrezeptors mit entsprechenden Bereichen des Cholecystokininrezeptors wurde ein Rezeptor erzeugt, der bezüglich Bindungsverhalten und Cholesterinabhängigkeit keine Unterschiede zu dem Wildtyp-Oxytocinrezeptor zeigte. Durch den Einsatz von computergestütztem 'Modeling' wurde für die Interaktion des Oxytocinrezeptors mit Cholesterin eine Stelle zwischen den Transmembranhelices 5 und 6 vorgeschlagen. Um die Verteilung des Cholesterins in der Zelle zu untersuchen, wurde ein selbst synthetisiertes, fluoreszierendes Cholesterinderivat (Fluochol) eingesetzt. Die Komplexierung in Cyclodextrinen ermöglichte die Einlagerung von Fluochol in die Plasmamembran von Zellen. Der Einstrom des Fluochol in das ER erfolgte innerhalb von Minuten und war energieunabhängig. Schließlich wurde Fluochol in Lipidtröpfchen transportiert, die in fast allen Zellen für die Speicherung überschüssiger intrazellulärer Lipide dienen. Die Tröpfchen werden aus dem endoplasmatischen Retikulum gebildet und enthalten neben Phospholipiden auch Cholesterin, das durch das Enzym ACAT mit langkettigen Fettsäuren verestert wird.

Systematic studies of protein immobilization by surface plasmon field-enhanced fluorescence spectroscopy

The research interest of this study is to investigate surface immobilization strategies for proteins and other biomolecules by the surface plasmon field-enhanced fluorescence spectroscopy (SPFS) technique. The recrystallization features of the S-layer proteins and the possibility of combining the S-layer lattice arrays with other functional molecules make this protein a prime candidate for supramolecular architectures. The recrystallization behavior on gold or on the secondary cell wall polymer (SCWP) was recorded by SPR. The optical thicknesses and surface densities for different protein layers were calculated. In DNA hybridization tests performed in order to discriminate different mismatches, recombinant S-layer-streptavidin fusion protein matrices showed their potential for new microarrays. Moreover, SCWPs coated gold chips, covered with a controlled and oriented assembly of S-layer fusion proteins, represent an even more sensitive fluorescence testing platform. Additionally, S-layer fusion proteins as the matrix for LHCII immobilization strongly demonstrate superiority over routine approaches, proving the possibility of utilizing them as a new strategy for biomolecular coupling. In the study of the SPFS hCG immunoassay, the biophysical and immunological characteristics of this glycoprotein hormone were presented first. After the investigation of the effect of the biotin thiol dilution on the coupling efficiently, the interfacial binding model including the appropriate binary SAM structure and the versatile streptavidin-biotin interaction was chosen as the basic supramolecular architecture for the fabrication of a SPFS-based immunoassay. Next, the affinity characteristics between different antibodies and hCG were measured via an equilibrium binding analysis, which is the first example for the titration of such a high affinity interaction by SPFS. The results agree very well with the constants derived from the literature. Finally, a sandwich assay and a competitive assay were selected as templates for SPFS-based hCG detection, and an excellent LOD of 0.15 mIU/ml was attained via the “one step” sandwich method. Such high sensitivity not only fulfills clinical requirements, but is also better than most other biosensors. Fully understanding how LHCII complexes transfer the sunlight energy directionally and efficiently to the reaction center is potentially useful for constructing biomimetic devices as solar cells. After the introduction of the structural and the spectroscopic features of LHCII, different surface immobilization strategies of LHCII were summarized next. Among them the strategy based on the His-tag and the immobilized metal (ion) affinity chromatography (IMAC) technique were of great interest and resulted in different kinds of home-fabricated His-tag chelating chips. Their substantial protein coupling capacity, maintenance of high biological activity and a remarkably repeatable binding ability on the same chip after regeneration was demonstrated. Moreover, different parameters related to the stability of surface coupled reconstituted complexes, including sucrose, detergent, lipid, oligomerization, temperature and circulation rate, were evaluated in order to standardize the most effective immobilization conditions. In addition, partial lipid bilayers obtained from LHCII contained proteo-liposomes fusion on the surface were observed by the QCM technique. Finally, the inter-complex energy transfer between neighboring LHCIIs on a gold protected silver surface by excitation with a blue laser (λ = 473nm) was recorded for the first time, and the factors influencing the energy transfer efficiency were evaluated.

From lipid bilayers to synaptic vesicles: atomic force microscopy on lipid-based systems

The aim of this thesis was to apply the techniques of the atomic force microscope (AFM) to biological samples, namely lipid-based systems. To this end several systems with biological relevance based on self-assembly, such as a solid-supported membrane (SSM) based sensor for transport proteins, a bilayer of the natural lipid extract from an archaebacterium, and synaptic vesicles, were investigated by the AFM. For the characterization of transport proteins with SSM-sensors proteoliposomes are adsorbed that contain the analyte (transport protein). However the forces governing bilayer-bilayer interactions in solution should be repulsive under physiological conditions. I investigated the nature of the interaction forces with AFM force spectroscopy by mimicking the adsorbing proteoliposome with a cantilever tip, which was functionalized with charged alkane thiols. The nature of the interaction is indeed repulsive, but the lipid layers assemble in stacks on the SSM, which expose their unfavourable edges to the medium. I propose a model by which the proteoliposomes interact with these edges and fuse with the bilayer stacks, so forming a uniform layer on the SSM. Furthermore I characterized freestanding bilayers from a synthetic phospholipid with a phase transition at 41°C and from a natural lipid extract of the archaebacterium Methanococcus jannaschii. The synthetic lipid is in the gel-phase at room temperature and changes to the fluid phase when heated to 50°C. The bilayer of the lipid extract shows no phase transition when heated from room temperature to the growth temperature (~ 50°C) of the archeon. Synaptic vesicles are the containers of neurotransmitter in nerve cells and the synapsins are a family of extrinsic membrane proteins, that are associated with them, and believed to control the synaptic vesicle cycle. I used AFM imaging and force spectroscopy together with dynamic light scattering to investigate the influence of synapsin I on synaptic vesicles. To this end I used native, untreated synaptic vesicles and compared them to synapsin-depleted synaptic vesicles. Synapsin-depleted vesicles were larger in size and showed a higher tendency to aggregate compared to native vesicles, although their mechanical properties were alike. I also measured the aggregation kinetics of synaptic vesicles induced by synapsin I and found that the addition of synapsin I promotes a rapid aggregation of synaptic vesicles. The data indicate that synapsin I affects the stability and the aggregation state of synaptic vesicles, and confirm the physiological role of synapsins in the assembly and regulation of synaptic vesicle pools within nerve cells.

Molecular interaction of the human metalloprotease meprin beta with the amyloid precursor protein, ADAM10, and ADAM17 based on proteomics

Die Zinkendopeptidasen Meprin α und β sind Schlüsselkomponenten in patho(physiologischen) Prozessen wie Entzündung, Kollagenassemblierung und Angiogenese. Nach ihrer Entdeckung in murinen Bürstensaummembranen und humanen Darmepithelien, wurden weitere Expressionsorte identifiziert, z.B. Leukozyten, Krebszellen und die humane Haut. Tiermodelle, Zellkulturen und biochemische Analysen weisen auf Funktionen der Meprine in der Epithelialdifferenzierung, Zellmigration, Matrixmodellierung, Angiogenese, Bindegewebsausbildung und immunologische Prozesse hin. Dennoch sind ihre physiologischen Substrate weitgehend noch unbekannt. Massenspektrometrisch basierte Proteomics-Analysen enthüllten eine einzigartige Spaltspezifität für saure Aminosäurereste in der P1´ Position und identifizierten neue biologische Substratkandidaten. Unter den 269 extrazellulären Proteinen, die in einem Substratscreen identifiziert wurden, stellten sich das amyloid precursor protein (APP) and ADAM10 (a disintegrin and metalloprotease 10) als sehr vielversprechende Kandidaten heraus. Mehrere Schnittstellen innerhalb des APP Proteins, hervorgerufen durch verschiedenen Proteasen, haben unterschiedlichen Auswirkungen zur Folge. Die β-Sekretase BACE (β-site APP cleaving enzyme) prozessiert APP an einer Schnittstelle, welche als initialer Schritt in der Entwicklung der Alzheimer Erkrankung gilt. Toxische Aβ (Amyloid β)-Peptide werden in den extrazellulären Raum freigesetzt und aggregieren dort zu senilen Plaques. Membran verankertes Meprin β hat eine β-Sekretase Aktivität, die in einem Zellkultur-basierten System bestätigt werden konnte. Die proteolytische Effizienz von Meprin β wurde in FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)-Analysen bestimmt und war um den Faktor 104 höher als die von BACE1. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass Meprin β die ersten zwei Aminosäuren prozessiert und somit aminoterminal einen Glutamatrest freisetzt, welcher nachfolgend durch die Glutaminylzyklase in ein Pyroglutamat zykliert werden kann. Trunkierte Aβ-Peptide werden nur in Alzheimer Patienten generiert. Aufgrund einer erhöhten Hydrophobie weisen diese Peptide eine höhere Tendenz zur Aggregation auf und somit eine erhöhte Toxizität. Bis heute wurde keine Protease identifiziert, welche diese Schnittstelle prozessiert. Die Bildung der Meprin vermittelten N-terminalen APP Fragmenten wurde in vitro und in vivo detektiert. Diese N-APP Peptide hatten keine cytotoxischen Auswirkungen auf murine und humane Gehirnzellen, obwohl zuvor N-APP als Ligand für den death receptor (DR) 6 identifiziert wurde, der für axonale Degenerationsprozesse verantwortlich ist. rnIm nicht-amyloidogenen Weg prozessiert ADAM10 APP und entlässt die Ektodomäne von der Zellmembran. Wir konnten das ADAM10 Propeptid als Substrat von Meprin β identifizieren und in FRET Analysen, in vitro und in vivo zeigen, dass die Meprin vermittelte Prozessierung zu einer erhöhten ADAM10 Aktivität führt. Darüber hinaus wurde ADAM10 als Sheddase für Meprin β identifiziert. Shedding konnte durch Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) oder durch das Ionophor A23187 hervorgerufen werden, sowie durch ADAM10 Inhibitoren blockiert werden. rnDiese Arbeit konnte somit ein komplexes proteolytisches Netwerk innerhalb der Neurophysiologie aufdecken, welches für die Entwicklung der Alzheimer Demenz wichtig sein kann.rn

Protein-Protein- und Protein-Lipid-Wechselwirkungen beeinflussen die Oligomerisierung und Funktion des E. coli Aquaglyceroporins GlpF

Aquaporine sind hochselektive Transmembrankanäle, die in allen Lebensformen den Fluss von Wasser und kleinen, polaren Molekülen wie Glycerol über Lipidmembranen ermöglichen. Obwohl die Kanalpore für den Substratfluss im Monomer lokalisiert ist, liegen Aquaporine innerhalb biologischer Membranen als Homotetramere vor. Im Rahmen dieser Arbeit wurden proteinbezogene und lipidmembranassoziierte Einflüsse auf die Oligomerisierung und Funktion des bakteriellen Aquaglyceroporins GlpF sowohl in vitro als auch in vivo untersucht. rnDie erhöhte Stabilität der Aquaporinpore sowie Interaktion zwischen den GlpF-Monomeren sind Triebkräfte der Aquaporin-Tetramerisierung. Ferner erfordern die GlpF-Tetramerisierung und -Aktivität bei Abschirmung der Ladung anionischer Lipide und einer minimalen Membrandicke von 27 Å keine spezielle Lipidumgebung. Da anionische Lipide die GlpF-Funktion jedoch störten, kann die GlpF-Aktivität in vivo möglicherweise durch die selektive Anreicherung von anionischen Lipiden in der unmittelbaren Proteinumgebung reguliert werden. Ungünstige Lipid-GlpF-Interaktionen können jedoch in Lipidumgebungen mit hoher Ordnung in der Acylkettenregion entstehen, die zu einer Aggregation der GlpF-Tetramere und reduzierten Aktivität führen. rnFerner wurde die Auswirkung der nephrogenen Diabetes insipidus verursachenden Aquaporin 2-Punktmutation V71M auf die Oligomerisierung und Funktion des homologen, bakteriellen Aquaglyceroporins GlpF untersucht. Da weder die Oligomierisierung noch die Aktivität des homologen, bakteriellen Aquaglyceroporins eingeschränkt sind, beruht der Krankheitsmechanismus der Aquaporin 2-Mutante V71M vermutlich auf einem defekten Transportmechansimus im Menschen. rn