48 resultados para IFN-
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In dieser Arbeit wurde die Rolle des Epstein-Barr Virus induzierten Gens 3 in einem Mausmodel des durch B16-F10 Zellen hervorgerufenen metastasierenden Melanoms untersucht. Das von aktivierten antigenprsentierenden Zellen exprimierte EBI-3 gehrt zur Familie der lslichen Typ 1 Zytokinrezeptoren, weist eine hohe Homologie zur p40 Untereinheit des IL-12 auf und bildet zusammen mit p28 das IL-27. Die intravense Injektion der B16-F10 Zelllinie fhrte zu einer signifikanten Erniedrigung der Tumormetastasen in den EBI-3 defizienten Lungen sowie zu einer hheren Lebenserwartung dieser Muse im Vergleich zu den B6 Wildtypen. Darber hinaus habe ich in den EBI-3 defizienten Musen eine verminderte VCAM-1 Expression auf den Endothelzellen der Lunge gefunden whrend nderungen in der VEGF Expression nicht detektiert wurden. Der immunologische Hintergrund, der diesen therapeutischen Effekt hervorrief, konnte durch die T-Zellaktivierung durch die krzlich neu beschriebene DC Population, welche Interferon-produzierende Killer Dendritische Zellen genannt werden (IK-DC), die zustzlich von aktivierten und maturierten klassischen DCs untersttzt wurden, erklrt werden. IK-DCs von EBI-3 defizienten Musen produzierten hhere Mengen an IFN-g whrend die klassischen DCs MHC und co-stimulatorische Molekle exprimierten, welche die Sekretion von IL-12 initiierten. Das Zusammenspiel der genannten Faktoren induzierte eine verstrkte CD4 und CD8 T-Zellantwort in den Lungen dieser Muse. Dies wiederum resultierte im TNF- und TRAIL abhngigen programmierten Zelltod der B16-F10 Melanomzellen in den Lungen der EBI-3 defizienten Muse, wohingegen sowohl weitere anti-apoptotische Mechanismen als auch T regulatorische Zellen keinen Einfluss auf die in den EBI-3 defizienten Musen beobachtete Tumorabwehr zu spielen scheint. Schlussendlich konnten EBI-3 defiziente CD8+ T-Zellen, welche zuvor mit Tumorantigen geprimed wurden, adoptiv in B6 Wildtypmuse transferiert werden, was zeigte, dass diese Zellen in der Lage sind, die Tumormasse in den Empfngermusen signifikant zu verringern. Zusammengefasst, demonstrieren diese Daten, dass das Blockieren von EBI-3 im metastasierenden Melanom ein vielversprechender Angriffspunkt in der Tumortherapie darstellt.
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Immunantwort von immundefizienten Musen gegenber Infektionen mit Cryptosporidium parvum. Cryptosporidium parvum ist ein intrazellulrer, protozoischer Krankheitserreger, der im immunkompromittierten Wirt zu lebensbedrohender Enteritis fhren kann. CD4+ T-Zellen und Interferon (IFN)- spielen wesentliche Rollen bei der Wirtsimmunantwort gegen die Infektion. Dennoch sind die Effektormechanismen, die zur Resistenz fhren nur wenig verstanden. In dieser Studie wurde die Immunantwort von IFN-- und Interleukin (IL)-12-Defektmusen parallel zu Wildtypmusen analysiert. Die Ergebnisse identifizierten IFN- als Schlsselzytokin bei der natrlichen und erworbenen Immunitt whrend der Erst- und Folgeinfektion mit C. parvum. Tumornekrosefaktor (TNF)- ist mglicherweise ein Induktor der frhen IFN--Antwort in IL-12 Knockout-Musen. Weiterhin tragen offenbar sowohl Th1- als auch Th2-Zytokine zur berwindung der Primrinfektion bei, die ersten mehr als die letztgenannten. Zytokingene waren am Ort der Infektion (Ileum) dramatisch verndert, nicht aber in den lokalen Lymphknoten und der Milz. Nach Folgeinfektion ergab sich in Abwesenheit von IFN- eine signifikante Erhhung der Th2-Zytokine IL-5 and IL-13. Die Ergebnisse zeigten weiterhin, dass das Th1-Zytokin IL-18 zur Resistenz gegenber C. parvum beitrgt, mglicherweise durch verschiedene Immunfunktionen, wie der Regulation von Serum-IFN- whrend der Infektion und/oder der Erhaltung der Homeostase der Th1/Th2-Zytokine durch Regulation der Th2-Zytokine. Weiterhin zeigten diese Untersuchungen den Transfer von Resistenz gegenber C. parvum von infizierten auf nave Muse mittels stimulierter intraepithelialer Lymphozyten und CD4+ T-Zellen. Diese Ergebnisse weisen auf die Gegenwart von C. parvum-spezifischen CD4+ T-Zellen in anderen lymphatischen Geweben neben der Darmmukosa hin. Eine Stimulation der Spendertiere durch Infektion war notwendig fr eine bertragbare schtzende Immunitt. Dennoch konnte die bertragene Immunitt nicht die Infektion der Empfngertiere vollstndig verhindern; eine Verdopplung der Spenderzellen fhrte zu keinem besseren Ergebnis. Weiterhin ergab der Transfer von CD4+ und CD8+ T-Zellen (Pan-T-Zellen) keinen erhhten Schutz der naiven Empfngertiere als der alleinige Transfer von CD4+ T-Zellen. Dies weist auf die fehlende Bedeutung der CD8+ T-Zellen beim Schutz vor C. parvum-Infektion hin.
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Until now, therapeutic vaccination of cancer patients has mainly relied on rather few T cell epitopes processed from structurally normal shared tumor antigens and presented by frequent HLA alleles. So far the design of these studies has not addressed the individuality of tumor-host interactions, which are not only determined by the antigenic tumor phenotype or the natural HLA polymorphism, but also by the individual T cell repertoire. The procedure described herein was developed to identify the preferential targets of the individual repertoire from a panel of known shared tumor-associated antigens. Lymphocytes were isolated from the peripheral blood of cancer patients or healthy donors and stimulated twice with autologous mRNA-transfected FastDC (Dauer et al., J Immunol. 170:4069, 2003). FastDC were generated from blood monocytes and separately transfected via lipofection with in vitro transcribed mRNAs encoding the panel antigens. Responder lymphocytes were tested on day 12 in a 20-hour IFN-g ELISPOT assay for recognition of 293T cells co-transfected pairwise with plasmids encoding the stimulation antigens and the respective individuals HLA class I alleles. In a first step, stimulation parameters were optimized for the detection of anti-HCMV pp65 responses. A maximum amplification of pp65-specific CD8+ T cell responses was obtained at a rather low IL-2 concentration (25 IU/ml) and at a minimum APC-to-effector ratio of 1:10. Addition of IL-4, IL-7 or IL-15 did not substantially improve the stimulatory potential. The test was applied to the human melanoma models D05 and MZ2, in both of which multiple T cell-defined antigens had previously been identified by expression screening. Blood lymphocytes were stimulated in parallel with autologous tumor cells and with mRNA-transfected FastDC. In D05, T cell reactivities against three out of eleven epitopes induced by stimulation with tumor cells were also found after stimulation with mRNA-transfected FastDC. Two further T cell target epitopes were identified with mRNA but not with tumor cell stimulation. In MZ2, T cell responses against five distinct epitopes were detected on day 12 after stimulation with mRNA transfectants. The same responses were detectable after stimulation with tumor cells only on day 32. mRNA stimulations against 21 tumor-associated antigens in addition to HCMV pp65 were performed in four healthy individuals. In all cases, CD8+ T cells against HCMV pp65 could be expanded. Among tumor-associated antigens, only reactivity against Melan-A/MART-1 in association with HLA-A*0201 was detectable in one of the donors. The vaccination of patients with targets a priori known to be recognized by their T cell repertoire may help to improve the outcome of therapeutic vaccination.
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Pankreaskarzinome und maligne Melanome weisen eine hohe Resistenz gegenber Zytostatika und Bestrahlung in der Therapie auf. Die Behandlung eines metastasierenden Pankreaskarzinoms besteht aus einer Kombination aus 5-FU, CDDP und IR. Fr die Behandlung des malignen Melanoms ist das methylierende Agenz DTIC das Mittel erster Wahl. Das ebenfalls methylierende Agenz TMZ, welches jedoch in Deutschland noch nicht fr die Behandlung von malignen Melanomen zugelassen ist, erlangt immer grere Bedeutung. Die Ansprechrate der Tumore kann durch Kombination mit IFNs erhht werden. In der vorliegenden Arbeit wurde an Pankreaskarzinom- bzw. Melanomzelllinien untersucht, ob IFNs einen radio- bzw. chemosensibilisierender Effekt ausben und, wenn ja, welcher Mechanismus hierfr verantwortlich ist. Es wurden zehn Pankreaskarzinom-Zelllinien (Panc-1, Su8686, Capan-1, Capan-2, Bxpc-3, PA-TU 8988T, Aspc-1, HS 766T, Mia-PaCa-2 und PA-TU 8902) untersucht. Diese zeigten eine hohe Variabilitt in ihrer intrinsischen Radiosensitivitt sowie in ihrer Sensitivitt gegenber IFN-alpha und IFN-beta. IFN-beta erwies sich als toxischer im Vergleich zu IFN-alpha. Die radiosensibilisierende Wirkung der IFNs an Pankreaskarzinom-Zelllinien war moderat, wobei IFN-beta im Vergleich zu IFN-alpha effektiver war. Der radiosensibilisierende Effekt ging mit einer deutlichen Erhhung der alpha-Komponente, der berlebenskurven einher und kam durch eine IFN-beta vermittelte Verstrkung der IR-induzierten Apoptoserate zustande. Dies wurde sowohl durch SubG1 als auch durch Annexin V / PI Messungen gezeigt. Einen Einfluss von IFN-beta auf den Zellzyklus und die DSB-Reparatur konnte durch funktionelle Untersuchungen sowie durch PCR bzw. Western-Blot-Analysen als Grund fr den sensibilisierdenen Effekt ausgeschlossen werden. Ein sensibilisierender Effekt von IFN-beta auf die durch TMZ-induzierte Zytotoxizitt war fr die Pankreaskarzinom-Zelllinien weder in MGMT-profizientem noch depletiertem Zustand zu beobachten. Zur Untersuchung der sensibilisierenden Eigenschaften von IFNs gegenber TMZ in malignen Melanomzelllinien wurden p53-Wildtyp (D05 und A375) und mutierte Zelllinien (D14 und RPMI 7951) untersucht. Gegenber alleiniger TMZ-Behandlung reagierten die untersuchten p53-Wildtyp Melanomzelllinien nicht sensitiver auf eine Behandlung mit TMZ als p53-mutierte Zelllinien. Der Nachweis des Spaltprodukts der Caspase-9 lieferte einen Hinweis darauf, dass in den Melanomzelllinien unabhngig vom p53-Status nach alleiniger TMZ-Behandlung der mitochondriale Apoptoseweg aktiviert wird. Durch eine Vorbehandlung der Zellen mit IFN-alpha oder IFN-beta konnte die TMZ-induzierte Apoptoserate in malignen Melanomzellen deutlich gesteigert werden. In p53-Wildtyp Melanomzellen war der chemosensibilisierende Effekt der IFNs besonders ausgeprgt. IFN-beta erwies sich hierbei als effektiver, weshalb es fr die folgenden Versuche verwendet wurde. Durch stabile Transfektion der Zelllinie D05 mit MGMT konnte das durch TMZ-induzierte Addukt O6MeG als fr den sensibilisieredenen Effekt ausschlaggebende DNA-Schdigung charakterisiert werden. Western-Blot-Analysen und gamma-H2AX-Immunfluoreszenz Untersuchungen konnten einen Einfluss von IFN-beta auf die Prozessierung der Lsion O6MeG sowie einen Einfluss von IFN-beta auf die Induktion und Reparatur von TMZ verursachten DSBs ausschlieen. Durch Experimente mit einem Fas-aktivierenden Antikrper und durch eine stabile Transfektion der Zelllinien D05 und A375 mit DN-FADD konnte gezeigt werden, dass p53-Wildtyp Melanomzellen nicht oder nur eingeschrnkt in der Lage sind, nach TMZ-Behandlung ber den Fas-Rezeptor Signalweg Apoptose zu induzieren. Ausschlaggebend hierfr ist die geringe Pro-Caspase-8 Expression dieser Zelllinien. Eine IFN-beta Vorbehandlung bewirkte eine Reaktivierung des Fas-Rezeptor Signalweges, was mit einer verstrkten Expression der Pro-Caspase-8 einherging. Durch Experimente mit Caspase-8 siRNA konnte diese IFN-beta induzierte Verstrkung der Pro-Caspase-8 Expression als entscheidender Faktor fr den sensibilisierenden Effekt ausgemacht werden. Zum ersten Mal konnte damit in dieser Arbeit gezeigt werden, dass p53-Wildtyp Melanomzellen durch eine IFN-beta vermittelte Hochregulation der Pro-Caspase-8 ihre Fhigkeit wiedererlangen, nach TMZ-Behandlung ber den Fas-Rezeptor Signalweg Apoptose auszulsen. Diese Arbeiten weisen einen Weg, auf welchem die hohe Resistenz von malignen Melanomzellen, welche zu 80 % das nicht mutierte p53 Gen beherbergen, ber eine IFN-beta induzierte Reaktivierung der Fas-Rezeptor vermittelten Apoptosekaskade berwunden werden kann.
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Die Funktion der Th 17-Zelllinie im Lungenkarzinom wurde noch nicht vollstndig verstanden. In dieser Studie wurde darber berichtet, dass die Expression der Th17-Zellmarker (RORA, RORC2, IL-17A) in den Lungen der Patienten mit Adenokarzinom erhht ist, und diese mit dem Transkriptionsfaktor der regulatorischen T-Zellen FOXP 3 positiv korrelieren, was auf eine Beziehung dieser Zelltypen deutet. Auerdem hat man auch herausgefunden, dass IL-17A mit T-bet Trankriptionsfaktor in den Patienten entgegengesetzt korreliert. Die Blockade in einem Mausmodell fr Lungen-Adenokarzinom resultierte die Reduktion von Tumorbefall in der Lunge, lokale Expansion der IFNg produzierenden CD4+ T-Effektorzellen und Reduktion der CD4+CD25+FOXP3+ regulatorischen T-Zellen. Untersuchungen in T-bet(-/-) Musen zeigten, dass die antikarzinogenen Wirkungen der antiIL-17A-Behandlung T-bet Transkriptionsfaktor bentigen, um sowohl die FOXP3 regulatorischen T-Zellen als auch die Th17-Zellen in vivo zu supprimieren. Dementsprechend hat man herausgefunden, dass der Th17-Pfad beim Fehlen des T-bet Transkriptionsfaktors durch Hochregulierung des IL-23 Rezeptors in CD4+ T-Zellen stimuliert wurde. Bemerkenswert, dass der IL-17 Rezeptor hauptschlich auf den CD4+CD62Lhigh naiven T-Zellen exprimiert wird und sowohl auf den CD4+T-bet+ Th1- als auch auf den CD4+CD25+FOXP3+ Treg -Zellen im Tumor fehlt. Dieses resultiert den Verlust der Kontrolle der IL-17 auf Th1 und Treg-Zellentwicklung. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Blockade des IL-17A eine mgliche klinische Behandlung darstellt, weil sie die IFNg produzierenden Th1 Zellen untersttzt und die CD4+CD25+FOXP3+ regulatorischen T Zellen in Lungen Karzinom reduziert.
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Der Ausheilung von Infektionen mit Leishmania major liegt die Sekretion von IFN- von sowohl CD4+ als auch CD8+ T Zellen zugrunde.rnAktuell konnte in der Literatur nur ein Epitop aus dem parasitren LACK Protein fr eine effektive CD4+ T Zell-vermittelte Immunantwort beschrieben werden. Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand daher darin, mgliche MHC I abhngige CD8+ T Zell Antworten zu untersuchen. rnFr diesen Ansatz wurde als erstes der Effekt einer Vakzinierung mit LACK Protein fusioniert an die Protein-Transduktionsdomne des HIV-1 (TAT) analysiert. Die Effektivitt von TAT-LACK gegenber CD8+ T Zellen wurde mittels in vivo Protein-Vakzinierung von resistenten C57BL/6 Musen in Depletions-Experimenten gezeigt.rnDie Prozessierung von Proteinen vor der Prsentation immunogener Peptide gegenber T Zellen ist unbedingt erforderlich. Daher wurde in dieser Arbeit die Rolle des IFN--induzierbaren Immunoproteasoms bei der Prozessierung von parasitren Proteinen und Prsentation von Peptiden gebunden an MHC I Molekle durch in vivo und in vitro Experimente untersucht. Es konnte in dieser Arbeit eine Immunoproteasom-unabhngige Prozessierung aufgezeigt werden.rnWeiterhin wurde Parasitenlysat (SLA) von sowohl Promastigoten als auch Amastigoten fraktioniert. In weiterfhrenden Experimenten knnen diese Fraktionen auf immunodominante Proteine/Peptide hin untersucht werden. rnLetztlich wurden Epitop-Vorhersagen fr CD8+ T Zellen mittels computergesttzer Software von beiden parasitren Lebensformen durchgefhrt. 300 dieser Epitope wurden synthetisiert und werden in weiterfhrenden Experimenten zur Charakterisierung immunogener Eigenschaften weiter verwendet. rnIn ihrer Gesamtheit trgt die vorliegende Arbeit wesentlich zum Verstndnis ber die komplexen Mechanismen der Prozessierung und letztendlich zur Identifikation von mglichen CD8+ T Zell Epitopen bei. Ein detailiertes Verstndnis der Prozessierung von CD8+ T Zell Epitopen von Leishmania major ber den MHC Klasse I Weg ist von hchster Bedeutung. Die Charakterisierung sowie die Identifikation dieser Peptide wird einen mageblichen Einfluss auf die weiteren Entwicklungen von Vakzinen gegen diesen bedeutenden human-pathogenen Parasiten mit sich bringen. rn
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Die Ursachen fr die Entstehung von Lungentumoren sind vielseitig. Aus geschdigtem Drsengewebe der Lunge kann sich die Tumorart des Adenokarzinoms entwickeln, welches zu den malignen Krebserkrankungen gehrt und somit nach Etablierung eines Primrtumors metastasieren kann. Es wurde vielfach gezeigt, da das Immunsystem bei der Bekmpfung eines mutierten Gewebes im fortschreitenden Verlauf des Tumorwachstums an Effektivitt verliert. Die dahinter stehenden Mechanismen sind noch nicht ganz verstanden. Eine mgliche Ursache knnte eine fehlerhafte Regulation der Immunabwehr sein. Das Zytokin, welches bei dieser Regulation eine wichtige Rolle spielt, ist das Interleukin-2 (IL-2). Dieses aktiviert immunkompetente Zellen und gewhrleistet deren Fortbestand whrend der Immunreaktion. In der vorliegenden Arbeit ist in einem murinen Modell von Bronchioadenokarzinom die Regulation von CD4+ T-Zellen durch IL-2 untersucht worden, beziehungsweise inwieweit eine Einflunahme auf diese Regulation zur Verbesserung der Tumorabwehr beitragen kann. Die alpha-Kette des IL-2 Rezeptorkomplexes (CD25) ist neben dem Transkriptionsfaktor Foxp3 ein gngiger Marker fr die Population der so genannten regulatorischen T-Zellen. Regulatorische T-Zellen treten im Tumorgewebe in erhhtem Mae auf und inhibieren die gegen den Tumor gerichtete Effektorfunktion anderer Immunzellen. Durch intranasale Applikation eines anti-CD25 Antikrpers sollte, im speziellen bei den regulatorischen T-Zellen, das CD25 Molekl blockiert werden, um auf diese Weise die hochaffine Signalgebung zu unterbinden und die regulatorischen T-Zellen intratumoral zu depletieren. Es konnte gezeigt werden, da die Blockade des IL-2 Rezeptors nicht zur Reduktion des Tumorwachstums beitrug. Trotz Applikation des Antikrpers waren die regulatorischen T-Zellen signifikant erhht. Lediglich die Produktion des Zytokins Tumornekrosisfaktor-alpha (TNF-alpha) wurde durch die Zugabe des Antikrpers gesteigert, was aber keine Verbesserung der Tumorabwehr bewirkte. Als Alternative zur Blockade des IL-2 Rezeptors wurden verschiedene Dosen von rekombinantem IL-2 ebenfalls intranasal appliziert, um die T-Zell Populationen zustzlich zu stimulieren. In diesem Fall war bei hohen Dosierungen eine Regression des Tumors zu erreichen. Die Regression ist auf eine erhhte, durch das IL-2 aktivierte Produktion des Zytokins Interferon-gamma (IFN-gamma) zurckzufhren. Jedoch wurde sowohl bei der Blockade des IL-2 Rezeptors, als auch bei der Stimulation durch IL-2 ersichtlich, da im Zusammenhang mit Adenokarzinom dem Zytokin TNF-alpha eine besondere Position zugedacht werden mu. Es ist bekannt, da TNF-alpha in verschiedenen experimentellen Tumor-Modellen unterschiedliche Funktionen besitzt. Die Deletion des TNFs, hier dargestellt mittels TNF-knockout Musen, hatte eine kurative Wirkung. Die TNF-knockout Muse wiesen fast kein Tumorwachstum auf, die CD4+ T-Zellen aus den knockout Musen zeigten eine im Vergleich zum Wildtyp mehrfach hhere Produktion von IFN-gamma, bei gleichzeitiger Reduktion der regulatorischen T-Zellen. Es kann vermutet werden, da TNF-alpha in dem verwendeten Adenokarzinom-Modell eine tumoruntersttzende Wirkung hat. Dahingehend wre die Neutralisierung der TNF-Signalgebung bei zustzlicher Stimulation mit IL-2 als wirksamer Therapieansatz in Betracht zu ziehen.
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Das Glaukom stellt eine heterogene Gruppe von okularen Erkrankungen dar, deren Pathogenese sich durch einen langsamen, progradienten Untergang von retinalen Ganglienzellen und ihren Axonen auszeichnet. rnIn den letzten Jahren wurde im Kontext der Glaukompathogenese verstrkt die Beteiligung autoreaktiver Antikrper diskutiert. Ein Schwerpunkt dieser Arbeit bestand in dem Vergleich solcher Autoantikrper-Reaktionen in den Serum- und Kammerwasserproben einzelner Glaukompatienten. Hierdurch sollte geklrt werden, inwieweit die Immunreaktivitten dieser beiden Krperflssigkeiten miteinander bereinstimmen und ob sich Hinweise auf eine lokale Antikrperproduktion im immunprivilegierten Auge finden lassen. Mittels eines etablierten Protein-Microarray-Verfahrens wurden die Immunreaktionen gegen 40 verschiedene Antigene, wie z.B. Hitzeschock-Proteine oder neuronale Strukturproteine, untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass die detektierten Autoantikrper-Reaktionen gegen mehr als 80% der untersuchten Antigene in beiden Krperflssigkeiten miteinander bereinstimmen. Verdeutlicht wird hierdurch, dass die Antikrper-basierenden immunologischen Vorgnge im Auge bzw. Kammerwasser, trotz dessen Abschottung vom Blutkreislauf durch die Blut-Retina-Schranke, denen des Serums stark hneln. Nur vereinzelt lassen sich Hinweise auf eine lokale Antikrperproduktion im Auge finden, wodurch die Bedeutung der detektierten Serumantikrper-Reaktionen fr die Glaukomerkrankung belegt wird. rnEin weiterer Schwerpunkt der Arbeit lag auf der Detektion mglicher vernderter Proteinexpressionen in den Retinae und Serumproben von Glaukompatienten, die potentiell zu den neurodegenerativen Prozessen der Glaukompathogenese beitragen. Um die Analyse spezifischer Proteinexpressionen zu ermglichen, wurde das Verfahren des Antikrper-Microarrays etabliert und auf die Fragestellung angewendet. Untersucht wurden hierbei vor allem die Abundanzen von Komplementproteinen, Zytokinen und Hitzeschock-Proteinen, aber auch die von verschiedenen neuronalen Strukturproteinen. Als Probenmaterial dienten Serum- und Retinaproben von Glaukompatienten, die vergleichend denen von gesunden Probanden gegenbergestellt wurden. Die Analyse erbrachte die Erkenntnis, dass neben der verstrkten Expression von Komplementproteinen in der Retina (z.B. C3, C6) auch im Serum der Glaukompatienten eine erhhte Konzentration dieser Proteine vorliegt, die im Rahmen der Glaukomerkrankung mglicherweise ebenfalls eine Rolle spielen. hnliches konnte fr verschiedene Zytokine, wie z.B. TNF-, IFN- oder IL1- beobachtet werden, die in den untersuchten Retinae von Glaukomprobanden, teilweise auch in den Serumproben der Patienten, in verstrktem Mae detektiert werden konnten. Die erhhte Produktion von Zytokinen in der Retina ist wahrscheinlich auf die Aktivierung von Gliazellen zurckzufhren, ein Ereignis fr das in dieser Arbeit zahlreiche Hinweise gefunden werden konnten. Die Gliaaktivierung wird vermutlich durch apoptotische Prozesse in der Retina ausgelst, eventuell aber auch durch eine erfolgte Komplementaktivierung. Darber hinaus konnten mittels eines massenspektrometrischen Verfahrens weitere Expressionsunterschiede verschiedener retinaler Proteine bei Glaukompatienten festgestellt werden. Diese Vernderungen, wie z.B. geminderte Mengen von ROS-eliminierenden Proteinen, wie der Superoxid Dismutase und Peroxiredoxin-2, begnstigen bzw. verstrken sehr wahrscheinlich die neurodegenerativen Prozesse in der Retina von GlaukompatientenrnInwieweit die untersuchten Faktoren kausativ an den neurodegenerativen Prozessen beteiligt sind, bleibt ungeklrt, jedoch untermauert deren Vielzahl die Notwendigkeit, die Ursache der Glaukomerkrankung als komplexe Interaktion und Wechselwirkung verschiedener Komponenten zu betrachten und nicht als einen einzelnen fehlgesteuerten Mechanismus.rn
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Ein neuer Ansatz der immunologischen Krebstherapie ist die Verwendung der bispezifischen, trifunktionalen Antikrper catumaxomab (anti-EpCAM x anti-CD3) und ertumaxomab (anti-Her2/neu x anti-CD3). Die Bispezifitt besteht in der Bindung eines Tumor-assoziierten Antigens (EpCAM bzw. Her2/neu) und des CD3 Molekls auf der Oberflche von T-Zellen. Darber hinaus stellt die Interaktion des Fc-Teils mit FcRI/IIa/III positiven akzessorischen Immunzellen die dritte Funktion der Antikrper dar. Diese einzigartige Kombination ermglicht theoretisch die Ausbildung eines Tri-Zell-Komplexes. In klinischen Studien konnte bereits die Wirksamkeit beider Antikrper nachgewiesen werden. Die eigentlichen Wirkmechanismen der trifunktionalen Antikrper jedoch sind noch nicht ausreichend bekannt. Um die Wechselwirkung zwischen den stark EpCAM- und schwach Her2/neu-positive FaDu- sowie den stabil mit humanem Her2/neu transfizierten FaDu E593-Tumorzellen, peripheren Blutmonozyten (PBMC) und trifunktionalen Antikrpern systematisch zu untersuchen wurde ein 3D-Tumormodell, die so genannten multizellulren Tumorsphroide (MCTS), angewandt. Als Endpunkte zur Beurteilung der Therapieeffizienz dienten das Volumenwachstum der Sphroide, sowie die Klonogenitt und die Zellvitalitt. Zur Beurteilung der PBMC-Penetration in die Sphroide erfolgten immunhistochemische Frbungen und molekularbiologische Nachweise der Abwehrzellantigene. Entsprechend wurden in den Sphroiden die Proliferationsrate ber eine Ki67-Frbung sowie die Apoptoserate ber eine FragEL-Markierung identifiziert. Die Aktivitt der PBMC wurde durch die Bestimmung ausgewhlter Zytokine (ELISA) und der Zellzahl aus den Medienberstnden charakterisiert. Die an den FaDu- und E593-Sphroiden erzielten Ergebnisse zeigten, dass catumaxomab und ertumaxomab eine konzentrations- und zeitabhngige Abnahme des Sphroidvolumens bewirkten. Die Schrumpfung der Tumorsphroide ging mit einer Reduktion des proliferativen und mit einer Steigerung des apoptotischen Tumorzellanteils einher. Die histologischen Befunde weisen darauf hin, dass die Volumenreduktion durch eine gesteigerte Anzahl infiltrierender Leukozyten bedingt ist. Auf verschiedenen Methoden basierende Analysen der Immunzellsubtypen zeigten eine dominierende Infiltration von zytotoxischen T-Zellen in die Tumorsphroide. Der Aktivittsnachweis der T-Zellen wurde ber die Detektion der IL-2 mRNA und des sekretierten Zytokins erbracht. Einen zustzlichen Hinweis auf eine zellulre Immunantwort liefert das Zytokinmuster mit hohen Konzentrationen an IFN-. Der direkte Vergleich beider Antikrper zeigte, dass der anti-tumorale Effekt abhngig von der Antigenexpression auf den Tumorzellen war. Die Analyse von Medienberstnden wies auf eine mehrheitlich hhere Zytokinausschttung in Gegenwart des Tumorantigens hin. Sphroid-Kokulturen, die mit dem parentalen anti-EpCAM Antikrper behandelt wurden, zeigten keine Volumenreduktion. Im Gegensatz dazu fhrte der parentale CD3-Antikrper, das CD3- und Tumorzell-bindende catumaxomab F(ab')2 Fragment oder eine Kombination beider parentaler Antikrper zu einer anti-tumoralen Wirkung, die jedoch nicht so stark war wie die des trifunktionalen Antikrpers catumaxomab. Demnach ist fr catumaxomab gezeigt, dass fr die Effektivitt des Antikrpers die Trifunktionalitt unabdingbar ist. Daraus leitet sich ab, dass die Aktivierung der Abwehrzellen durch kostimulatorische Signale notwendig ist und ber die Tumorantigenbindung Mechanismen wie ADCC (antibody-dependent cellular cytotoxicity) zum Tragen kommen. Die Experimente mit gleichzeitiger Gabe von trifunktionalen Antikrpern und Immunsuppressiva haben gezeigt, dass eine Kombination beider Agenzien mglich ist. Die Konzentrationen sind jedoch sorgfltig derart zu whlen, dass die Zytokinausschttung und die damit verbundenen Nebenwirkungen reduziert sind, ohne dass die anti-tumorale Wirkung der Antikrper mageblich beeinflusst wird. T-Zellen bedienen sich nach Aktivierung fr die rasche Proliferation einer gesteigerten aeroben Glykolyse. Unter Behandlung der Kokulturen mit catumaxomab konnte im Vergleich zu anderen immunstimulatorischen Agenzien die grte Steigerung der Laktatproduktion bzw. der Azidifizierungs- und Sauerstoffverbrauchsrate detektiert werden. Diese Effekte weisen auf eine metabolische Aktivierung der PBMC durch catumaxomab hin. Das von den Tumorzellen abgegebene Laktat kann die Immunzellen jedoch inhibieren. Daher wre die Kombination mit Glykolyseinhibitoren ein mglicher Ansatz, um die Therapieeffizienz weiter zu steigern. Darber hinaus konnte gezeigt werden, dass eine Komedikation der trifunktionalen Antikrper mit Chemotherapeutika zu einer gesteigerter Wirkung fhrte. Insgesamt liegt die Zukunft der Immuntherapien wohl in der Kombination mit anderen Wirkstoffklassen, die anti-tumorale Effekte verstrken oder immunsupprimierende Mechanismen inhibieren.
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In den letzten Jahren hat die Tumorbehandlung mit immunologischen Prparaten an Bedeutung gewonnen. Der allgemeine Ablauf der Testung eines Arzneimittelkandidaten sieht vor, zunchst in Zellkulturversuchen und Tierversuchen Wirkweise und Sicherheit, sowie voraussichtliche Abbauwege und mgliche Gefahren so beurteilen zu knnen, dass sie fr einen Einsatz im Menschen in Frage kommen. Zur prklinischen in vitro-Testung werden dabei in der Regel Monolayer-Zellkulturen oder Einzelzellsuspensionen eingesetzt. Der Einsatz von 3D-Zellkulturmodellen, welche den Aufbau von Mikrometastasen oder intervaskulre Areale in Tumoren exakter widerspiegeln, fhrt zu wesentlich besseren Voraussagen bezglich der klinischen Wirksamkeit neuer Prparate. Das Ziel dieser Arbeit war daher die Entwicklung und Anwendung eines neuen 3D-Zellkulturbasierten Systems zur Testung trifunktionaler bispezifischer Antikrper fr die Tumorbehandlung, welches sich auch auf andere vergleichbare Prparate bertragen lsst.rnIn meiner Arbeit konnte ich mehrere humane Tumorzelllinien definieren, mit denen es gelang, stabile Co-Kulturen von Multi Cellular Tumour Spheroids (MCTS) mit Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC) in miniaturisierten Spinner-Flaschen zu etablieren. Spinner-Flaschen, in denen die im Kulturmedium befindlichen Immunzellen, MCTS und Therapeutika stndig frei zirkulieren, sind besonders fr eine wirklichkeitsnahe Nachbildung der in vivo-Simulation mit disseminierten Tumorzellen oder mit malignem Aszites geeignet. Diese Art der Kultivierung erlaubte Beobachtungszeiten von 20 Tagen fr eine groe Bandbreite Analysemethoden. Zu den mit dem erstellten Protokoll standardmig durchfhrbaren Analysemethoden zhlen unter anderem immunhistochemische Frbungen an Sphroid-Gefrierschnitten, Vitalittstest, Untersuchung der Plattierungs-Effizienz, Bestimmung der Sphroidvolumina, Zytokinbestimmungen aus dem Medienberstand mit Cytokine Bead Arrays, PCR-Analysen immunzellspezifischer Antigene, sowie durchflusszytometrische Analysen. Diese Methodenkombination erlaubt einen sehr detaillierten Einblick in die Wirkweise und Effizienz neuer Immuntherapeutika aus verschiedensten Blickwinkeln und stellt ein reproduzierbares Testsystem zur prklinischen Testung von Immuntherapeutika dar, das zuknftig als Bindeglied zwischen Monolayer-Zellkulturen und klinischen Prfungen einen festen Platz einnehmen knnte.rnMit dem beschriebenen 3D-Zellkultur-System wurden in der vorliegenden Arbeit die trifunktionalen bispezifischen Antikrper catumaxomab (unter dem Handelsnamen Removab fr die Behandlung maligner Ascites zugelassen) und ertumaxomab (derzeit in klinischen Prfungen) hinsichtlich ihrer Wirkweise untersucht. Die Antikrper besitzen im Gegensatz zu herkmmlichen monoklonalen Antikrpern zwei verschiedene Bindungsarme, einer gegen CD3 auf T-Zellen, der zweite gegen EpCAM respektive Her2/neu - beides weit verbreitete Tumorantigene - gerichtet. An ihrem Fc-Teil besitzen sie eine dritte Bindungskapazitt, ber welche sie an Fc RI, -IIa und -III positive akzessorische Zellen binden. Diese Kombination ermglicht theoretisch die Ausbildung eines Tri-Zell-Komplexes aus T-Zelle, Tumorzelle und akzessorischer Zelle. Dies stellt eine wirkungsvolle Therapieoption unter Ausnutzung der krpereigenen, immunologischen Abwehr dar. rnIm Rahmen dieser Arbeit wurde gezeigt, dass beide Antikrper eine Grenreduktion der Sphroide mit den entsprechenden Tumorantigenen in gleichem Mae bewirkten und die Plattierungseffizienz durch ertumaxomab dosisabhngig reduziert wurde. Mit dem erstellten Testsystem konnte der Wirkmechanismus von catumaxomab auf Sphroide der Zelllinie FaDu (Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinom) detaillierter gezeigt werden: catumaxomab wirkte dosisabhngig auf die Reduktion der Sphroidvolumina und die zunehmende Infiltration von CD45+ Zellen, die als T-, NK- und/oder dendritische Zellen identifiziert wurden. Des Weiteren rief die catumaxomab-Gabe eine verstrkte Ausschttung der Zytokine IL-2, IFN- und TNF- hervor. Diese Ergebnisse sprechen dafr, dass catumaxomab die zellulre Immunantwort aktiviert.rnDie Standard-Tumorbehandlung beinhaltet die Gabe von Chemotherapeutika. Oft werden dafr Zytostatika mit dem unerwnschten Nebeneffekt auch gesunde proliferierende Zellen anzugreifen verwendet. Dies kann prinzipiell auch die Wirksamkeit der Antikrper-Therapie beeinflussen. Aus diesem Grund wurden in dieser Arbeit zustzlich vergleichende Kombinations-Versuche mit catumaxomab und einem gngigen Zytostatikum - Cisplatin - durchgefhrt. Mit Untersuchungen der Sphroidvolumina, Vitalittstests und Plattierungseffizienz konnte gezeigt werden, dass die Wirkung von catumaxomab bei gleichzeitiger Anwendung beider Therapeutika aufrecht erhalten bleibt und diese sogar additiv verstrkt wird. Eine Kombinationstherapie im Menschen ist daher denkbar.rnrn
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This thesis focuses on the role of B cells in mCMV and Leishmania major infection. B cells are an essential component of the adaptive immune system and play a key role in the humoral immune response. In mCMV infection we analyzed the influence of B cells on the virus-specific CD8 T cell response, in detail the role of B cells as IL-10 secreting cells, as source of immunoglobulin (Ig) and as antigen presenting cells. In Leishmania major infection we investigated the role of Ig in Th1 and Th2 directed disease.rnWe found in mCMV infection that the B cell secreted IL-10 suppresses effectively the acute virus-specific CD8 T cell response, while the IL-10 secreted by dendritic cell has no obvious effect. Ig has no effect in the acute virus-specific CD8 T cell response, but in memory response Ig is essential. If Ig is missing the CD8 T cell population remains high in memory response 135 days post infection. The complete absence of B cells dramatically reduces the acute virus-specific CD8 T cell response, while B cell reconstitution just partially rescues this dramatic reduction. A comparison of this reduction in a B cell free organism to an organism with depleted dendritic cells gave a similar result. To exclude a malfunction of the CD8 T cells in the B cell deficient mice, the decreased virus-specific CD8 T cell population was confirmed in a B cell depletion model. Further, bone marrow chimeras with a B cell compartment deficient for CD40-/- showed a decrease of the virus-specific response and an involvement of CD40 on B cells. Taken together these results suggest a role for B cells in antigen presentation during mCMV infection.rnFurther we took advantage of the altered mCMV specific CD8 T cell memory response in mice without Ig to investigate the memory inflation of CD8 T cells specific for distinct mCMV specifc peptides. Using a SIINFEKL-presenting virus system, we were able to shorten the time until the memory inflation occurs and show that direct presentation stimulates the memory inflation. rnIn Leishmania major infection, Ig of Th2 balanced BALB/c mice has a central role in preventing a systemic infection, although the ear lesions are smaller in IgMi mice without specific Ig. Here the parasite loads of ears and spleen are elevated, and an IMS-reconstitution does not affect the parasite load. In contrast in Th1 balanced C57BL/6 mice, reconstitution of IgMi mice with serum of either untreated or immunized mice decreased the parasite load of spleen and ear, further IMS treatment reduces the size of the spleen and the cytokine-levels of IL-10, IL-4, IL-2 and IFN- to a level comparable to wt mice. rn
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Das allergische Asthma ist eine weit verbreitete, immunologische Erkrankung, deren Prvalenz in den vergangenen 20 Jahren vor allem in industrialisierten Regionen drastisch zugenommen hat. Trotz intensiver Forschung und Entwicklung medikamentser Therapien steigt die Zahl der Patienten stetig an. Charakteristisch fr diese Erkrankung sind entzndliche Vernderungen in der Lunge, erhhte Atemwegsberempfindlichkeit (AHR), Mukusproduktion und in chronischen Fllen auch Atemwegsobstruktion. Bei der Entstehung des allergischen Asthmas wird ein anflliges Individuum durch die Inhalation eines normalerweise unschdlichen, in der Umwelt vorkommenden Antigens (Allergen) sensibilisiert, wodurch im Krper eine eigentlich unangebrachte Immunreaktion in Gang gesetzt wird. CD4+ T-Lymphozyten und ganz besonders die Subpopulationen der T-Helfer 1 (Th1) und Th2 Zellen spielen in dem Prozess eine zentrale Rolle. Obwohl ein Groteil der Asthmatiker mit einer Atemwegseosinophilie und erhhter Expression der Th2-typischen Zytokine IL-4 und IL-13 ein Th2-typisches Krankheitsbild aufweisen, wurden weitere Asthmaphnotypen identifiziert. Vornehmlich in Patienten, die an schwerem Asthma leiden, sind dominierende Neutrophilie und erhhte Mengen IFN- in den Atemwegen nachweisbar, was auf eine Th1-gesteuerte Immunreaktion hindeutet. Eine effektive, heilende Therapie des Asthmas wurde bislang nicht entwickelt. Die Inhibition der T-Zellantwort etwa durch Applikation allergenspezifischer, regulatorischer T-Zellen (Tregs) gilt als ein vielversprechender, aber nicht vollstndig erforschter Ansatz zur Kontrolle der Krankheitssymptome. In diesem Zusammenhang wurden in der vorliegenden Arbeit die Mechanismen und Effekte natrlich vorkommender CD4+CD25+Foxp3+ regulatorischer T-Zellen (nTregs) auf eine Th1 bzw. Th2-induzierte allergische Atemwegserkrankung untersucht. Anhand eines adoptiven Zelltransfermodells unter Einsatz lymphozytendefizienter Rag2-/- Muse konnte gezeigt werden, dass sowohl Th1 als auch Th2 Zellen, kombiniert mit mehrfacher, inhalativer Allergenprovokation, eine erhhte AHR induzieren. Whrend der Transfer allergenspezifischer Th2 Zellen eine Eosinophilie in der bronchoalveolren Lavage (BAL) und vermehrte Mukusproduktion in den Atemwegen hervorrief, war in Th1-transferierten Tieren zwar eine massive Infiltration neutrophiler Granulozyten zu beobachten, eine Becherzellmetaplasie mit vermehrten, mukusproduzierenden Atemwegsepithelzellen blieb allerdings aus. In vitro und in vivo waren voraktivierte nTregs (preTregs) nur eingeschrnkt in der Lage, die Th2-gesteuerte Atemwegserkrankung zu inhibieren. Im Gegensatz dazu konnten die Th1-Effektorfunktionen in vitro und die Th1-induzierte AHR und Atemwegsentzndung in vivo durch preTregs effektiv gehemmt werden, was auf eine unterschiedliche Empfindlichkeit der Th-Subpopulationen weist. Innerhalb der nTreg-vermittelten Suppression wird der sekundre Botenstoff cAMP auf die zu supprimierende Zelle bertragen und fhrt zur Hemmung von Proliferation und Zytokinproduktion. Dass dieser Mechanismus nicht nur in vitro, sondern auch in der Suppression der Th2-gesteuerten allergischen Atemwegserkrankung eine Rolle spielt, konnte durch die Strung des intrazellulren cAMP-Abbaus mittels PDE4-Inhibitoren verdeutlicht werden. Sowohl die prophylaktische, als auch die therapeutische Applikation der PDE4-Inhibitoren verstrkte den regulativen Effekt der nTregs auf AHR und Entzndung, korrelierend mit erhhten, zytosolischen cAMP-Konzentrationen in den Th2 Zellen der Lunge. Trotz des Fortschritts in der Isolation und In vitro-Expansion humaner nTregs ist die Ausbeute an Zellen uerst limitiert und die bertragbarkeit grerer Zellmengen nicht zuletzt aufgrund von hohem Kontaminationsrisiko whrend mehrtgiger In vitro-Expansion fragwrdig. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass eine Behandlung mit dem PDE4-Inhibitor die suppressive Kapazitt der allergenspezifischen nTregs deutlich erhhte. Den nTreg-vermittelten Suppressionsmechanismus durch den Einsatz von Pharmazeutika zu untersttzen bietet einen viel versprechenden und realistischen Ansatz zur Therapie des allergischen Asthmas.
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Die akute myeloische Leukmie (AML) zhlt zu den aggressivsten neoplastischen Erkrankungenrnder Hmatopoese. Die Mehrheit der Patienten mit AML erreicht nach Induktions-rnChemotherapie den Zustand der kompletten Remission, jedoch erleiden mehr als die Hlfterndieser Patienten anschlieend einen Rckfall und versterben an den Folgen der Erkrankungrn[1]. Die allogene hmatopoetische Stammzelltransplantation (engl.: hematopoietic stem cellrntransplantation, HSCT) stellt die einzig putativ kurative Behandlungsform fr rezidierendernPatienten und solche mit schlechter Prognose dar. Jedoch birgt diese Form der Therapiernauch eine Vielzahl an Risiken. Insbesondere das Auftreten einer akuten Transplantat-gegen-rnWirt-Erkrankung (engl.: graft-versus-host disease, GvHD) stellt die Hauptursache fr transplantationsassoziierternMortalitt und Morbiditt dar [2]. Die Depletion von alloreaktiven zytotoxischenrnT Lymphozyten (CTL) aus dem Transplantat ermglicht zwar die Prvention derrnEntstehung einer GvH-Erkrankung, jedoch hufig unter gleichzeitigem Verlust des frderlichen,rnanti-leukmischen Transplantat-gegen-Leukmie-Effekts (engl.: graft-versus-leukemia,rnGvL) [3]. Um den GvL-Effekt unter Vermeidung einer GvH-Erkrankung zu erhalten, bietetrnsich der gezielte adoptive Transfer von Leukmie-spezifischen, nicht alloreaktiven CTL alsrnattraktive Strategie der Immuntherapie fr AML-Patienten nach allogener HSCT an. In derrnvorliegenden Arbeit konnte erfolgreich ein pr-klinisches murines AML-Modell unter Einsatzrndes stark immundefizienten NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ- (NSG-) Mausstamms und primrenrnAML-Blasten durch die Optimierung bereits publizierter Protokolle etabliert werden.rnBei zehn von 17 transplantierten primren AML-Proben konnte ein erfolgreiches Engraftmentrnder humanen Zellen und eine Rekonstitution der humanen Neoplasie in den NSG-Musenrnerzielt werden. Die Engraftment-Rate betrug somit 58,82% und lag etwas unter dem aus derrnLiteratur bekannten Wert von 65-70% [4, 5]. Es lieen sich gut, intermedir und schlecht anwachsendernAML-Proben anhand der Engraftment-Strke und -Reproduzierbarkeit voneinanderrnunterscheiden. Anhand der Analyse von fr das Engraftment kritischer Parameter konnternein Zusammenhang zwischen Engraftment-Rate in der Maus und Flt3-Mutationsstatus sowiernFAB-Klassifikation des Patienten hergestellt und somit Angaben aus der Literatur besttigtrnwerden. Fr zwei Patienten-spezifische AML-Modelle, MZ580 und MZ308, konnten in vitrornerfolgreich AML-reaktive, ber einzelne bzw. duale HLA-Diskrepanzen restringierte CTLPopulationenrngeneriert und ber einen Zeitraum von bis zu 70 Tagen expandiert werden.rnDeren adoptiver Transfer in zuvor mit humanen AML-Blasten inokulierte NSG-Muse fhrternzu einer nahezu vollstndigen Eradikation der AML-Blasten und Remission der Versuchstiere.rnAnhand unterschiedlich langer in vitro Kultur-Zeitrume konnte ein fr die in vivo ausgebtenrnEffektor-Funktionen optimaler Reifungszustand der CTL-Populationen von maximalrn28 Tagen bestimmt werden. Die kinetische Analyse der lytischen Aktivitt in vivo deutete auf eine relativ schnelle Ausbung der Effektor-Funktionen durch die CTL-Populationen innerhalbrnvon zwei bis 24 Stunden nach adoptivem Transfer hin. Durch die Verwendung von inrnvitro generierten EBV-reaktiven CTL aus einem irrelevanten Spender konnte zudem die Spezifittrnder in vivo ausgebten Effektor-Funktionen nachgewiesen werden. Die ex vivo Re-rnIsolation adoptiv transferierter CTL und deren in vitro Analyse in einem IFN ELISpot wiesrneine konstante Reaktivitt der Zellen ohne Induktion einer Xeno-Reaktivitt nach. Die zurrnVerbesserung der Persistenz humaner CTL-Populationen eingesetzten autologen CD4+ TrnZellen zeigten nur im AML MZ308-System eine positive Wirkung. Generell konnte die Persistenzrnin vivo jedoch trotz initialer Substitution mit den Zytokinen IL-2 und IL-7 nicht ber einenrnZeitraum von sieben Tagen hinaus aufrechterhalten werden.rnZur Untersuchung des Extravasations-Mechanismus humaner T Zellen ber murines Endothelrnwurden sowohl Flusskammer- als auch Transwell-Studien durchgefhrt, um die molekularenrnGrundlagen des Adhsions- und Transmigrationsprozesses aufzuklren. Durch denrnparallelen Einsatz humaner und muriner T Zellen auf murinen Endothelzellen unter Zusatzrnfunktionsblockierender monoklonaler Antikrper konnte gezeigt werden, dass derrnExtravasations-Mechanismus beider Spezies auf Interaktionen homologer Adhsionsmolekl-rnPaare, nmlich VLA-4VCAM-1 und LFA-1ICAM-1, beruht. Fr einzelne Molekle konntenrnin Abhngigkeit der eingesetzten Endothelzellen Unterschiede in der Funktionalitt zwischenrnden Spezies identifiziert werden. Der Adhsionsprozess war durch die Blockade derrnVLA-4VCAM-1-Interaktion strker inhibierbar als durch die Blockade von LFA-1ICAM-1.rnDie Transmigration hingegen war durch die Blockade beider Adhsionsmolekl-Paare vergleichbarrnstark inhibierbar.
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Primary varicella-zoster virus (VZV) infection during childhood leads to varicella commonly known as chickenpox. After primary infection has occurred VZV establishes latency in the host. During subsequent lifetime the virus can cause reactivated infection clinically known as herpes zoster or shingles. In immunodeficient patients dissemination of the virus can lead to life-threatening disease. Withdrawal of acyclovir drug prophylaxis puts allogeneic hematopoietic stem-cell transplantation (HSCT) patients at increased risk for herpes zoster as long as VZV-specific cellular immunity is impaired. Although an efficient live attenuated VZV vaccine for zoster prophylaxis exists, it is not approved in immunocompromised patients due to safety reasons. Knowledge of immunogenic VZV proteins would allow designing a noninfectious nonhazardous subunit vaccine suitable for patients with immunodeficiencies. The objective of this study was to identify T cell defined virus proteins of a VZV-infected Vero cell extract that we have recently described as a reliable antigen format for interferon-gamma (IFN-) enzyme-linked immunosorbent spot (ELISpot) assays (Distler et al. 2008). We first separated the VZV-infected/-uninfected Vero cell extracts by size filtration and reverse-phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC). The collected fractions were screened for VZV reactivity with peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of VZV-seropositive healthy individuals in the sensitive IFN- ELISpot assay. Using this strategy, we successfully identified bioactive fractions that contained immunogenic VZV material. VZV immune reactivity was mediated by CD4+ memory T lymphocytes (T cells) of VZV-seropositive healthy individuals as demonstrated in experiments with HLA blockade antibodies and T cell subpopulations already published by Distler et al. We next analyzed the bioactive fractions with electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS) techniques and identified the sequences of three VZV-derived proteins: glycoprotein E (gE); glycoprotein B (gB), and immediate early protein 62 (IE62). Complementary DNA of these identified proteins was used to generate in vitro transcribed RNA for effective expression in PBMCs by electroporation. We thereby established a reliable and convenient IFN- ELISPOT approach to screen PBMCs of healthy donors and HSCT patients for T cell reactivity to single full-length VZV proteins. Application in 10 VZV seropositive healthy donors demonstrated much stronger recognition of glycoproteins gE and gB compared to IE62. In addition, monitoring experiments with ex vivo PBMCs of 3 allo-HSCT patients detected strongly increased CD4+ T cell responses to gE and gB for several weeks to months after zoster onset, while IE62 reactivity remained moderate. Overall our results show for the first time that VZV glycoproteins gE and gB are major targets of the post-transplant anti-zoster CD4+ T cell response. The screening approach introduced herein may help to select VZV proteins recognized by memory CD4+ T cells for inclusion in a subunit vaccine, which can be safely used for zoster prophylaxis in immunocompromised HSCT patients.
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Immune modulation by herpesviruses, such as cytomegalovirus, is critical for the establishment of acute and persistent infection confronting a vigorous antiviral immune response of the host. Therefore, the action of immune-modulatory proteins has long been the subject of research, with the final goal to identify new strategies for antiviral therapy.rnIn the case of murine cytomegalovirus (mCMV), the viral m152 protein has been identified to play a major role in targeting components of both the innate and the adaptive immune system in terms of infected host-cell recognition in the effector phase of the antiviral immune response. On the one hand, it inhibits cell surface expression of RAE-1 and thereby prevents ligation of the activating natural killer (NK)-cell receptor NKG2D. On the other hand, it decreases cell surface expression of peptide-loaded MHC class I molecules thereby preventing antigen presentation to CD8 T cells. Ultimately, the outcome of CMV infection is determined by the interplay between viral and cellular factors.rnIn this context, the work presented here has revealed a novel and intriguing connection between viral m152 and cellular interferon (IFN), a key cytokine of the immune system: rnthe m152 promoter region contains an interferon regulatory factor element (IRFE) perfectly matching the consensus sequence of cellular IRFEs.rnThe biological relevance of this regulatory element was first suggested by sequence comparisons revealing its evolutionary conservation among various established laboratory strains of mCMV and more recent low-passage wild-derived virus isolates. Moreover, search of the mCMV genome revealed only three IRFE sites in the complete sequence. Importantly, the functionality of the IRFE in the m152 promoter was confirmed with the use of a mutant virus, representing a functional deletion of the IRFE, and its corresponding revertant virus. In particular, m152 gene expression was found to be inhibited in an IRFE-dependent manner in infected cells. Essentially, this inhibition proved to have a severe impact on the immune-modulatory function of m152, first demonstrated by a restored direct antigen presentation on infected cells for CD8 T-cell activation. Even more importantly, this effect of IRFE-mediated IFN signaling was validated in vivo by showing that the protective antiviral capacity of adoptively-transferred, antigen-specific CD8 T cells is also significantly restored by the IRFE-dependent inhibition of m152. Somewhat curious and surprising, the decrease in m152 protein simultaneously prevented an enhanced activation of NK cells in acute-infected mice, apparently independent of the RAE-1/NKG2D ligand/receptor interaction but rather due to reduced missing-self recognition.rnTaken together, this work presents a so far unknown mechanism of IFN signaling to control mCMV immune modulation in acute infection.rnrn
