Generierung und Transduktion wachstumsnegativer Signale durch den Contactinhibin-Rezeptor

Generierung und Transduktion wachstumsnegativer Signale durch den Contactinhibin-RezeptorDie kontaktabh��ngige Wachstumshemmung, Kontaktinhibition, basierend auf der Interaktion von Contactinhibin (Ci) und seinem Rezeptor (CiR), reguliert das Zellwachstum. Ziel dieser Arbeit war die Aufkl��rung der Signalweiterleitung ��ber den CiR.Der transformierende Wachstumsfaktor TGF-beta f��hrt in den meisten Zelltypen wie die Kontaktinhibition zum Zellzyklusstopp in der G1-Phase. Um m��gliche Interaktionen der beiden Signalkaskaden zu untersuchen, wurden humane Keratinozyten (HaCaT) mit einem dominant-negativen TGF-beta-Rezeptor Typ II stabil transfiziert. Das Ausschalten des TGF-beta-Signalweges resultierte in einer erh��hten S��ttigungsdichte und Aufhebung der Kontaktinhibition. Die durch Kontaktinhibition induzierte Zunahme der Expression der TGF-beta-mRNA best��tigte die m��gliche Interaktion der beiden Signalwege.In einem weiteren Ansatz sollte die Proteinkinase C (PKC) als m��glicher Second Messenger der Kontaktinhibition untersucht werden. Die Herunterregulierung der PKC-Isoformen alpha, delta, epsilon und mu nach Langzeit-Behandlung mit 12-O-Tetradecanoylphorbol-13-acetat f��hrte in humanen Fibroblasten (FH109) zu einer Reduktion der Kontaktinhibition. Nur durch Inkubation mit dem spezifischen Inhibitor der delta-Isoform Rottlerin konnte die Kontaktinhibition vollst��ndig aufgehoben werden. Eine Beteiligung der PKC-delta in die Kontaktinhibition wurde dadurch best��tigt, da�� sowohl die St��rke ihrer Proteinexpression als auch ihre intrazellul��re Verteilung ��ber Zell-Zellkontakte reguliert wurde. Au��erdem f��hrte die transiente Transfektion von Maus-Fibroblasten, NIH3T3, mit einer dominant-negativen Mutante der PKC-delta zu einem transformierten Ph��notyp.

Funktionelle Zusammenh��nge zwischen Expressionsver��nderungen des von Hippel-Lindau Tumorsuppressorgens und dessen potentiellen Zielgenen in sporadischen Nierenzellkarzinomen

ZusammenfassungNierenzellkarzinome (NZK) sind h��ufig gekennzeichnet durch den Funktionsverlust des von Hippel-Lindau Tumorsuppressorgens (VHL TSG). Man kennt heute eine Reihe potentieller Kandidatengene, die eventuell in Wechselwirkung mit dem VHL-Genprodukt stehen (VEGF, c-fos, c-myc). Zur Aufkl��rung der molekularen Vorg��nge, die zur Pathogenese der gut vaskularisierten Nierenzellkarzinome beitragen, wurden NZK-Zellinien untersucht. Vektorkonstrukte wurden generiert, um das in vitro und in vivo Wachstumsverhalten vor und nach Transfektion zu beobachten. Mit Hilfe eines GFP-Fusionsproteins wurden zus��tzlich Hinweise auf die intrazellul��re Lokalisation des VHL-Genproduktes (pVHL) geliefert. Nach Abschlu�� der vorliegenden Studien zeigte sich eine direkte Abh��ngigkeit der beiden Gene VHL und VEGF. Sowohl die in vitro als auch die in vivo Ans��tze bewiesen eine Interaktion der beiden Gene. Die Frage nach einer Interaktion von pVHL mit den Genprodukten Fos und Myc l����t sich jedoch nicht eindeutig beantworten. Die Expressionsver��nderungen dieser Gene erfolgten scheinbar willk��rlich, eine Interaktion konnte nicht best��tigt werden.Die Lokalisation des VHL-Genproduktes ist von Fall zu Fall unterschiedlich, ein Zusammenhang mit den verschiedenen Funktionen des VHL-Gens ist demnach wahrscheinlich. Zusammenfassend l����t sich sagen, da�� das VHL TSG eine Rolle bei der Kontrolle der Angiogenese spielt, eine Interaktion mit VEGF ist mehr als wahrscheinlich. Zuk��nftig sind bei der Aufkl��rung des Pathomechanismus von Nierenzellkarzinomen deshalb vor allem Studien n��tig, die dem VHL TSG als Angiogeneseinhibitor eine zentrale Bedeutung bei der Heilung sporadischer Tumoren mit starker Vaskularisierung zukommen lassen.

Struktur, Funktion und potentielle Anwendung der PKC- und SNZ,SNO-Promotoren aus Geodia cydonium und Suberites domuncula

Die Schw��mme (Porifera) sind eine reiche Quelle bioaktiver Naturstoffe. Viele dieser Naturstoffe besitzen das Potential, als Pharmazeutika, molekulare Sonden usw. eingesetzt oder weiterentwickelt zu werden. Die Beschaffung dieser Naturstoffe in ausreichenden Mengen stellt jedoch eines der gr����ten Probleme bei der Testung und Produktion vielversprechender Substanzen dar. Der Transfer von DNA in Schwammzellen bzw. in komplette Organismen w��re ein vielversprechender Ansatz, dieses Problem zu l��sen. Das Ziel dieser Arbeit war es deshalb, die Funktion und Struktur homologer Promotoren zu untersuchen und eine Methode des Gentransfers in Schwammzellen auszuarbeiten. Zu diesem Zweck wurde zus��tzlich zu der bereits vorhandenen 5'-flankierenden Region des conventional PKC-Gens aus Geodia cydonium eine genomische Bibliothek von Suberites domuncula konstruiert, um diese mit Hilfe des DNA-Homologiescreenings nach den 5'-flankierenden Regionen des cPKC- und des SNZ (SnooZe)-Gens (SD_SNZG) zu durchsuchen. Die Klonierung und Sequenzierung sowohl des 5'-Bereichs als auch die Charakterisierung der Exon-Intron Struktur beider Gene wurde erfolgreich durchgef��hrt. In der 5'-Region des SNZ-Gens konnte dabei ein weiteres Gen (SD_SNO; SNZ proximal Open Reading Frame) identifiziert werden, das in einer 'Kopf-an-Kopf' Anordnung zu SD_SNZG orientiert ist. Sowohl SD_SNZG als auch SD_SNO wurden hochkonservierten Genfamilien zugeordnet, deren Vorkommen in Metazoen hier erstmals beschrieben wird.Funktionelle Studien mit Hilfe der Reportergene Luciferase und Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) im heterologen System der NIH 3T3 Zellen wiesen sowohl dem cPKC-Promotor aus G. cydonium als auch dem SNZ-Promotor aus S. domuncula eine starke Promotoraktivit��t im Verh��ltnis zum SV40-Promotor nach. Die Aktivit��t des cPKC-Promotors aus S. domuncula dagegen war relativ schwach. Dar��ber hinaus konnte gekl��rt werden, da�� die 5'-flankierende Region des SNZ-Gens bidirektionale Promotoraktivit��t aufweist und da�� der G. cydonium cPKC-Promotor keine TATA-Box besitzt, sondern eine GC-Box f��r die basale Funktion ben��tigt.Als geeignete Methode zur Transfektion von Zellen des Schwamms S. domuncula erwies sich der ballistische Gentransfer mit Hilfe der Gene Gun. Homologe Promotoren konnten die sichtbare Expression des Reportergens EGFP jedoch nicht bewirken. Nur der virale CMV-Promotor erwies sich als hierf��r geeignet.

Untersuchungen zur Charakterisierung der Bystander-Effekte bei einer in vivo Therapie mit Suizidgenen

Untersuchungen zur Charakterisierung der Bystander-Effekte bei einer in vivo Therapie mit Suizidgenen Bei Tumoren eines syngenen Prostatakarzinoms der Ratte (Dunning R3327 AT-1), die zuvor ex vivo mit einem Fusionsgen aus Cytosin Deaminase und Tymidinkinase (AT-1/CDglyTK) transfiziert wurden, konnte durch Kombinationsbehandlung mit Ganciclovir (GCV) und 5-Fluorocytosin (5-FC) komplette Remission und Langzeit��berleben erzielt werden. Dagegen ergaben sich bei Applikation nur einer Pro-Drug lediglich lokale Tumorkontrollraten von 83% (GCV) und 57% (5-FC). Noch geringere therapeutische Effekte einer Kombinationstherapie mit GCV und 5-FC wurden beobachtet, wenn in Anlehnung an die klinische Situation der Anteil suizidgen-tragender Zellen in den Tumoren auf < 20% abgesenkt wurde. Molekularbiologische Analysen dieser Mischtumore zeigen eine Verminderung membranst��ndiger Connexinproteine, welche f��r den interzellul��ren Transport phosphorylierter GCV-Metabolite ��ber Gap-junctions erforderlich sind. Pharmakodynamische Untersuchungen mittels 19F-NMR belegen eine effiziente Metabolisierung von 5-FC zu 5-Fluorouracil (5-FU) und den anschlie��enden Einbau der F-Nukleotide in die DNA. Dennoch sind die intrazellul��ren und sezernierten 5-FU Konzentrationen f��r eine Inaktivierung benachbarter Zellen im Sinne eines ������lokalen-Bystander-Effektes������ nicht ausreichend. Bei gleichzeitiger Therapie von AT-1 und AT-1/CDglyTK Tumoren, kommt es nicht zur Regression des AT-1 Tumors und damit nicht zu einem ������Distalen-Bystander-Effekt������. Dagegen f��hrt die Induktion eines immunologischen Ged��chtnisses zu deutlich verminderten Angehraten bei sp��ter injizierten AT-1 Tumoren. Die Suizidgen-Therapie ist ein erfolgversprechender Ansatz zur Behandlung maligner Erkrankungen, bei dem die lokalen und distalen Bystander-Effekte individueller Tumoren den therapeutischen Erfolg ma��geblich mitbestimmen.

Ektopische Expression schwer exprimierbarer nikotinischer Acetylcholinrezeptoren in Zellinien

Deutsch:In dieser Arbeit wurden Versuche zur funktionellen Expression von schwer ektopisch exprimierbaren nAChR in HEK-293/a1-Zellen durchgef��hrt: a7 nAChR und a6-enthaltenden nAChR. Die Probleme lagen dabei nicht auf dem Niveau der Transfektion, Transkription, Translation oder der Assemblierung, sondern beim Transport der Rezeptoren zur Zellmembran.Die Expression von a7 nAChR in der Plasmamembran von HEK-293/a1-Zellen konnte durch verbesserte Expressionsbedingungen (Koexpression des Faltungshelfers Calnexin oder weiterer nAChR-Untereinheiten, Erniedrigung der Expressionstemperatur, Expression in Gegenwart nikotinischer Antagonisten) nicht erreicht werden. Auch in anderen Zellinien mit neuronalem oder nicht-neuronalem Ursprung (QT6, GH4C1, S2 und PCC7-Mz1) war die EGFP-gekoppelte a7 nAChR-Untereinheit nur im Zellinneren lokalisiert.Eine intrazellul��re Lokalisation verhinderte auch eine funktionelle Expression homomerer a6 sowie heteromerer a6b2 und a6b3 nAChR in HEK-293/a1-Zellen. Im Gegensatz dazu f��hrte eine Expression von stabil mit den nAChR-Untereinheiten a6 und b4 transfizierten HEK-293/a1-Zellen in Gegenwart von Calciumphosphat-Transfektionsl��sung und anschlie��end bei 30��C zu einem verbesserten Transport der Rezeptoren zur Zellmembran und damit zum erfolgreichen Expression funktioneller a6b4 nAChR. Die Wirkung der Transfektionsl��sung kann durch die erh��hte Calciumkonzentration erkl��rt werden, da in Ganzzellableitungen eine potenzierende Wirkung von Calciumionen auf den a6b4 nAChR bewiesen wurde. Somit konnte erstmalig der humane a6b4 nAChR in einer S��ugerzellinie stabil und funktionell exprimiert werden.

Klonierung und Charakterisierung eines Konsensusgenoms des Hepatitis C Virus als Grundlage der Etablierung eines Zellkultursystems

Das Hepatitis C Virus (HCV) ist der Haupterreger der parenteral ��bertragenen non-A non-B Hepatitis. Bisher wurde die Erforschung der Replikation und Pathogenese des HCV durch das Fehlen eines effizienten und verl����lichen Zellkultursystems behindert.Virale RNA aus infizierten humanen Leberzellen wurde isoliert und kloniert. Mit Hilfe eines Vergleichs mehrerer Klone wurde eine isolatspezifische Konsensussequenz bestimmt, auf deren Basis ein Konsensusgenom konstruiert wurde. Mit dem Konsensusgenom als Grundlage wurden subgenomische RNA-Molek��le, sogenannte ������selektionierbare Replikons������ hergestellt. Nach Transfektion der Replikons in humane HuH-7 Hepatoma-Zellen konnte gezeigt werden, da�� die Replikons autonom und in hohem Ma��e in den Wirtszellen replizierten.Die Arbeit definiert die Struktur von HCV-Replikons, die in Zellkultur funktionell sind. Damit wird die Basis f��r ein lange gesuchtes HCV-Zellkultursystem geschaffen, welches das Studium der HCV-Replikation im Detail und die Entwicklung antiviral wirksamer Substanzen erm��glicht.

Analyse der Mechanismen zur Regulation der Zellzyklus-abh��ngigen Stabilit��t der MARCKS-mRNA

Die Expression des PKC-Hauptsubstrates MARCKS (myristoylated alanine-rich C kinase substrate) wird in Swiss 3T3-Fibroblasten in Abh��ngigkeit des Zellzyklus durch Variation der mRNA-Stabilit��t reguliert. In der vorliegenden Arbeit wurde die Beteiligung der 3' nichttranslatierten Region (3'UTR) der MARCKS-mRNA an der Stabilit��tskontrolle analysiert. Durch Einsatz der RNase/EMSA-Technik konnten zwei cis-Elemente der MARCKS 3'UTR identifiziert und lokalisiert werden, die mit RNA-bindenden Swiss 3T3-Proteinen (trans-Faktoren) interagieren. Diese neu identifizierten cis-Elemente sind AU-reiche Elemente (ARE) der Klasse III, da sie sehr gro��e Sequenzhomologie zu ARE dieser Klasse aufweisen und der MARCKS 3'UTR, wie f��r ARE typisch, Instabilit��t vermitteln.Durch UV-crosslinking wurden vier Proteine mit Molek��lmassen von 55, 40, 36 und 30 kDa nachgewiesen, die spezifisch an das 52nt lange Haupt-ARE (MARCKS 52nt) mit unterschiedlicher Affinit��t binden konnten. Mit Hilfe von rekombinant hergestellten ELAV/Hu-Proteinen und einem ELAV/Hu-spezifischen, affinit��tsgereinigten Antiserum konnte eines der vier Proteine (p36) als das ELAV/Hu-Protein HuR identifiziert werden. Die Funktion der ELAV/Hu-Proteine f��r die Stabilit��tskontrolle der MARCKS-mRNA lie�� sich durch transiente und stabile Transfektion von HuR und neuronenspezifischem HuD mit dem Tetracyclin induzierbaren Expressionssystem (Tetoff) in Swiss 3T3- bzw. MEF/3T3-Tetoff-Zellen verdeutlichen: Durch ��berexpression von HuR und HuD wurde die wachstumsinduzierte Destabilisierung der MARCKS-mRNA bei Wiedereintritt der Zellen in den Zellzyklus unterbunden.

Beeinflussung der menschlichen allergischen Immunantwort durch Allergen-DNA-transfizierte dendritische Zellen

Immunreaktionen gegen Antigene k��nnen eine zellul��re Immunantwort, eingeleitet durch TH1-Zellen induzieren oder aber eine antik��rpervermittelte humorale Immunantwort induzieren, die von Zellen des TH2-Typs bestimmt sind. Diese unterschiedlichen Immunreaktionen regulieren sich gegenseitig, indem sie sich wechselseitig unterdr��cken. Dadurch stellt sich ein Gleichgewicht zwischen den TH1- und TH2-Immunantworten ein. Die Allergie vom Soforttyp ist TH2-dominiert und wird ausgel��st durch die Produktion spezifischer IgE-Antik��rper gegen eigentlich harmlose Antigene. Durch die fr��he Aussch��ttung des Zytokins IL-4 von T-Zellen differenzieren naive allergenspezifische T-Zellen zu TH2-Zellen aus. Diese sezernieren dann ebenfalls IL-4 und auch IL-13, was die B-Zellen zu einer vermehrten Produktion von IgE-Molek��len stimuliert. IgE bindet an den hochaffinen IgE-Rezeptor auf Mastzellen, Basophilen und Eosinophilen. Bei weiterem Allergenkontakt kommt es durch Kreuzvernetzung der Fc���-Rezeptoren zur Aussch��ttung vo

Funktionelle Analyse von Dystroglycan in der sich entwickelnden H��hnerretina durch in-ovo-Elektroporation

Alpha- und Beta-Dystroglycan, die zentralen Komponenten eines multimeren Dystrophin-assoziierten Proteinkomplexes wurden bislang im Wesentlichen in der Skelettmuskulatur charakterisiert. Dort stellt der DAG eine molekulare Verbindung zwischen dem Aktin-Zytoskelett der Muskelfaser und einer Basalmembran her, die die einzelne Muskelfaser umh��llt. Dystroglycan vermittelt auf diese Weise die mechanische Festigkeit der Muskelfasern w��hrend der Kontraktion. Au��erdem dient der DAG als Ger��st f��r die Anlagerung von Proteinen. Mutationen in den strukturgebenden oder signaltransduzierenden Proteinen des DAG verursachen Muskeldystrophie. Besonders schwere Muskeldystrophien werden durch Mutationen hervorgerufen, die eine ver��nderte Glykosylierung von Dystroglycan und damit eine verminderte Bindung von alpha-Dystroglycan an Matrixproteine verursachen. Dies f��hrt zu einer Beeintr��chtigung der Basalmembranbiosynthese sowie sich daraus ergebende St��rungen in der Migration, Schichtung und Differenzierung von Nervenzellen im ZNS. Welche Rolle Dystroglycan im sich entwickelnden ZNS spielt, sollte in dieser Arbeit an der H��hnerretina untersucht werden. Durch Anwendung der in ovo Elektroporation wurden zwei modifizierte Dystroglycankonstrukte in Neuroepithelzellen transfiziert. Die ��berexpression eines verk��rtzten Dystroglycanproteins, verursachte eine Abrundung der Neuroepithelzellen. Dies f��hrte zur Hyperproliferation der Zellen deren Folge die Bildung von Verdickungen in der Retina war sowie eine verst��rkte Bildung postmitotischer Neurone. Die Elektroporation eines nicht-spaltbaren Dystroglycans, f��hrte im Gegensatz dazu zu einer Abnahme der Anzahl proliferierender und differenzierender Nervenzellen. Als Konsequenz ver��nderte sich die Orientierung der Axone von retinalen Ganglienzellen. Nach der ��berexpression des verk��rzten Dystroglycans verloren die Axone ihre zentripetale Orientierung auf den optischen Nerv, w��hrend die Elektroporation von Wt-Dystroglycan und nicht-spaltbarem Dystroglycan nur einen gelegentlichen Richtungswechsel der Axone verursachte. Die Daten zeigen, dass Dystroglycan einen entscheidenden Einfluss auf die Proliferation, Differenzierung und Polarit��t der Neuroepithelzellen aus��bt. Dies geschieht vermutlich durch die Vermittlung der Adh��sion des Endfu��es von Neuroepithelzellen an die Basalmembran. Die Ver��nderungen nach der ��berexpression der modifizierten Dystroglycankonstrukte liefern m��glicherweise eine Erkl��rung f��r den ZNS-Ph��notyp der sich bei verschiedenen Formen von Muskeldystrophie zeigt.

Processing of O 6 - methylguanine in mammalian cells

DNA methylating compounds are widely used as anti-cancer chemotherapeutics. The pharmaceutical critical DNA lesion induced by these drugs is O6-methylguanine (O6MeG). O6MeG is highly mutagenic and genotoxic, by triggering apoptosis. Despite the potency of O6MeG to induce cell death, the mechanism of O6MeG induced toxicity is still poorly understood. Comparing the response of mouse fibroblasts wild-type (wt) and deficient for ataxia telangiectasia mutant protein (ATM), a kinase responsible for both the recognition and the signalling of DNA double-strand breaks (DSBs), it was shown that ATM deficient cells are more sensitive to the methylating agents N-methyl-N���-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG), methyl methansulfonate (MMS) and the anti-cancer drug temozolomide, in both colony formation and apoptosis assays. This clearly shows that DSBs are involved in O6MeG toxicity. By inactivating the O6MeG repair enzyme O6-methylguanine-DNA methyltransferase (MGMT) with the specific inhibitor O6-benzylguanine (O6BG), ATM wt and deficient cells became more sensitive to MNNG and MMS. The opposite effect was observed when over-expressing MGMT in ATM -/- cells. The results show that O6MeG is the critical DNA lesion causing death in ATM cells following MNNG treatment, and is partially responsible for the toxicity observed following MMS treatment. Furthermore, by inhibiting the ATM kinase activity with caffeine, it was shown that the resistance of wt cells to MNNG was due to the kinase activity of ATM, as wt cells underwent more apoptosis following methylating agent treatment in the presence of caffeine. Apoptosis and caspase-3 activation were late events, starting 48h after treatment. This lends support to the model where O6MeG lesions are converted into DSBs during replication. As ATM wt and deficient cells showed similar G2/M blockage and Chk1 activation following MNNG and MMS treatment, it was concluded that the protective effect of ATM is not due to cell cycle progression control. The hypersensitivity of ATM deficient cells was accompanied by their inability to activate the anti-apoptotic NFkB pathway. In a second part of this study, it was shown that the inflammatory cytokine IL-1 up-regulates the DNA repair gene apurinic endonuclease 2 (APEX2). Up-regulation of APEX2 occurred by transcriptional regulation as it was abrogated by actinomycin D. APEX2 mRNA accumulation was accompanied by increase in APEX2 protein level. IL-1 induced APEX2 expression as well as transfection of cells with APEX2 cDNA positively correlated with a decrease in apoptosis after treatment with genotoxic agents, particularly affecting cell death after H2O2. This indicates an involvement of APEX2 in the BER pathway in cells responding to IL-1.

Neuronal differentiation and epithelial integrity: the role of Drosophila Short stop

The nervous system is the most complex organ in animals and the ordered interconnection of neurons is an essential prerequisite for normal behaviour. Neuronal connectivity requires controlled neuronal growth and differentiation. Neuronal growth essentially depends on the actin and microtubule cytoskeleton, and it has become increasingly clear, that crosslinking of these cytoskeletal fractions is a crucial regulatory process. The Drosophila Spectraplakin family member Short stop (Shot) is such a crosslinker and is crucial for several aspects of neuronal growth. Shot comprises various domains: An actin binding domain, a plakin-like domain, a rod domain, calcium responsive EF-hand motifs, a microtubule binding Gas2 domain, a GSR motif and a C-terminal EB1aff domain. Amongst other phenotypes, shot mutant animals exhibit severely reduced dendrites and neuromuscular junctions, the subcellular compartmentalisation of the transmembrane protein Fasciclin2 is affected, but it is also crucially required in other tissues, for example for the integrity of tendon cells, specialised epidermal cells which anchor muscles to the body wall. Despite these striking phenotypes, Shot function is little understood, and especially we do not understand how it can carry out functions as diverse as those described above. To bridge this gap, I capitalised on the genetic possibilities of the model system Drosophila melanogaster and carried out a structure-function analysis in different neurodevelopmental contexts and in tendon cells. To this end, I used targeted gene expression of existing and newly generated Shot deletion constructs in Drosophila embryos and larvae, analyses of different shot mutant alleles, and transfection of Shot constructs into S2 cells or cultured fibroblasts. My analyses reveal that a part of the Shot C-terminus is not essential in the nervous system but in tendon cells where it stabilises microtubules. The precise molecular mechanism underlying this activity is not yet elucidated but, based on the findings presented here, I have developed three alternative testable hypothesis. Thus, either binding of the microtubule plus-end tracking molecule EB1 through an EB1aff domain, microtubulebundling through a GSR rich motif or a combination of both may explain a context-specific requirement of the Shot C-terminus for tendon cell integrity. Furthermore, I find that the calcium binding EF-hand motif in Shot is exclusively required for a subset of neuronal functions of Shot but not in the epidermal tendon cells. These findings pave the way for complementary studies studying the impact of [Ca2+] on Shot function. Besides these differential requirements of Shot domains I find, that most Shot domains are required in the nervous system and tendon cells alike. Thus the microtubule Gas2 domain shows no context specific requirements and is equally essential in all analysed cellular contexts. Furthermore, I could demonstrate a partial requirement of the large spectrin-repeat rod domain of Shot in neuronal and epidermal contexts. I demonstrate that this domain is partially required in processes involving growth and/or tissue stability but dispensable for cellular processes where no mechanical stress resistance is required. In addition, I demonstrate that the CH1 domain a part of the N-terminal actin binding domain of Shot is only partially required for all analysed contexts. Thus, I conclude that Shot domains are functioning different in various cellular environments. In addition my study lays the base for future projects, such as the elucidation of Shot function in growth cones. Given the high degree of conservation between Shot and its mammalian orthologues MACF1/ACF7 and BPAG1, I believe that the findings presented in this study will contribute to the general understanding of spectraplakins across species borders.

Der Einfluss von Apolipoprotein E auf die zellul��ren Mechanismen der Alzheimer Erkrankung

Die massive Bildung und Ablagerung von aggregiertem Amyloid Beta-Peptid im Gehirn wird allgemein als zentrales Ereignis im Rahmen des Neurodegenerationsprozesses der Alzheimer Demenz betrachtet. Als einer der urs��chlichen Risikofaktoren gilt das Vorliegen des ��4-Allels des Apolipoprotein E. Die Alzheimer��sche Krankheit ist dabei in sehr vielf��ltige Weise mit Apolipoprotein E verkn��pft. ApoE beg��nstigt isoformenabh��ngig A��-Ablagerungen, ApoE-Fragmente kommen im Gehirn und der Cerebrospinalfl��ssigkeit von Alzheimer Patienten vor und ApoE ist dar��ber hinaus als Cholesterintransportprotein ��ber den zellul��ren Cholesterinstoffwechsel mit der Amyloidbildung verkn��pft. Mit Hilfe einer Doppeltransfektion von ApoE und ADAM10 in HEK-Zellen und durch Studien mit Inhibitoren der ADAM-Familie an HepG-2-Zellen wurde in vitro gezeigt, dass ApoE nicht durch ��-Sekretasen der ADAM-Familie gespalten wird. Weiterhin konnte bewiesen werden, dass ApoE in Astrogliomazellen keinen Einfluss auf die APP-Prozessierung aus��bt. Durch in vitro Modulation des Cholesteringehaltes an Astrogliomazellen mit M��CD und seine Cholesterin-Komplexverbindungen ist gezeigt worden, dass die ApoE-Sekretion durch abnehmenden Cholesteringehalt gesenkt wird. Indem Statine alleine oder in Kombination mit Isoprenylierungssubstraten eingesetzt wurden ist der Beweis erbracht worden, dass Statine in vitro die ApoE-Sekretionsinhibition alleine durch Hemmung der Cholesterinbiosynthese bewirken. Best��tigt wurde dies weiterhin durch Experimente mit Isoprenylierungsinhibitoren. Aus dem Wirkmechanismus von Statinen auf die ApoE-Sekretionssenkung leitet sich wom��glich der f��r bestimmte Statine berichtete neuroprotektive Effekt bei Morbus Alzheimer in retrospektiven Humanstudien ab, der sich durch reine Cholesterinsenkung nicht erkl��ren l��sst. Im Zusammenhang mit der Cholesterinhom��ostase und dem gesteigerten 24(S)-Hydroxycholesterinspiegel bei Morbus Alzheimer, haben die Ergebnisse gezeigt, dass 24(S)-Hydroxycholesterin [24(S)-OH-chol] zur ApoE-Sekretions- und Expressionssteigerung f��hrt. In dieser Arbeit konnte erstmals der Nachweis erbracht werden, dass der stimulatorische Effekt von 24(S)-OH-Chol durch gleichzeitige Lovastatingabe reduziert werden kann. Dies stellt einen m��glichen Ansatz im Kampf gegen die Alzheimer Demenz dar. Weiterf��hrend m��ssen diese Ergebnisse noch in vivo beispielsweise durch Versuche an ApoE-transgenen M��usen best��tigt werden. Dar��ber hinaus k��nnte nach einer Statintherapie der ApoE-Gehalt in humaner, cerebrospinaler Fl��ssigkeit ermittelt werden.

Untersuchungen zur selektiven Deletion alloreaktiver Spender-T- Lymphozyten durch CD178-modifizierte dendritische Zellen im Rahmen der allogenen Blutstammzelltransplantation

Eine der h��ufigsten Komplikationen bei der allogenen Blutstammzelltransplantation stellt die Transplantat-gegen-Wirt-Erkrankung (Graft versus Host Disease, GvHD) dar. Sie wird durch allogene Spender-T-Lymphozyten verursacht, die Gewebe des Transplantatempf��ngers erkennen und inflammatorische Entz��ndungsprozesse ausl��sen. Neben dieser Alloreaktivit��t induzieren Spender-T-Lymphozyten jedoch auch immuntherapeutisch erw��nschte Transplantat-gegen-Leuk��mie-Reaktionen (Graft versus Leukemia, GvL-Reaktion), bei denen residuelle Tumor- bzw. Leuk��miezellen im Patienten durch Spender-T-Zellen spezifisch erkannt und eliminiert werden. Im Rahmen einer verbesserten Immmuntherapie wird daher versucht, GvHD-reaktive und GvL-reaktive Spender-T-Lymphozyten effizient voneinander zu separieren und so eine wirkungsvolle GvHD-Prophylaxe bzw. optimierte GvL-Induktion zu erreichen. In diesem Kontext war es Ziel dieser Arbeit, murine dendritische Zellen (DZ) so zu modifizieren, da�� sie f��r die spezifische Deletion alloreaktiver T-Zellen in murinen GvHD/GvL-Tiermodellen eingesetzt werden k��nnen. Die Modifikation der DZ sollte dazu f��hren, da�� ��ber das CD95/CD178-System Aktivierungs-induzierter Zelltod (activation induced cell death, AICD) in alloreaktiven T-Zellen ausgel��st wird. Hierzu wurden f��r die Modifikation der DZ zwei verschiedene Mechanismen angewandt: a) die Transfektion der DZ mit CD178-mRNA sowie b) die zielgerichtete Immobilisierung von hCD178-X-Fusionsproteinen auf Oberfl��chenmolek��len von DZ bzw. T-Zellen. Als Positivkontrolle f��r die Induktion CD95-vermittelter Apoptose diente der agonistische anti-CD95-Antik��rper Jo2. Bei der Transfektion muriner DZ mit mRNA zeigte sich anhand des Reportergens EGFP, da�� aus dem Knochenmark generierte DZ mit hoher Effizienz mit EGFP-mRNA transfizierbar waren. Im Falle von hCD178-mRNA f��hrte die Transfektion jedoch zu einer insuffizienten CD178-Expression, die mit den regulatorischen Eigenschaften der zytoplasmatischen CD178-Region in Verbindung gebracht werden konnte. So f��hrte die Verwendung einer zytoplasmatisch trunkierten Form der CD178-mRNA (CD178Dzyt) zu einer durchflu��zytometrisch nachweisbaren CD178-Expression in DZ. Mit diesen CD178Dzyt-exprimierenden DZ konnte in einem Proliferationstest die Proliferation alloreaktiver T-Zellen inhibiert werden. Die Beladung von DZ bzw. von T-Zellen mit hCD178-X-Fusionsproteinen f��hrte in vitro ebenfalls zu einer deutlichen Reduktion von Alloreaktivit��t. Dabei konnte eine spezifische Deletion/Inhibition alloreaktiver T-Zellen nachgewiesen werden. Die Elimination alloreaktiver T-Zellen erfolgte in beiden Verfahren ��ber AICD. Dar��ber hinaus wurde eine Bifunktionalit��t der Fusionsproteine festgestellt, da sie neben der Induktion CD95-vermittelter Apoptose auch in der Lage waren, die Kostimulation allogener T-Zellen effizient zu inhibieren. Mit Hilfe adoptiver T-Zell-Transferexperimente konnten abschlie��end die in vitro gewonnenen Ergebnisse in vivo in zwei verschiedenen GvHD-Mausmodellen best��tigt werden.

RNA-basierte Impfstoffe zur Induktion optimaler Immunantworten

Antigen-kodierende RNA wird als eine sichere und effiziente Alternative zu traditionellen Impfstoff-Formulierungen, wie Peptid-, Protein-, rekombinanten viralen oder DNA basierten Impfstoffen betrachtet. Der endg��ltige klinische Nutzen RNA-basierter Impfstoffe wird von der Optimierung verschiedener Parameter abh��ngig sein, die zur Induktion und effizienten Expansion der humoralen und zellvermittelten Immunantwort beitragen. Vor diesem Hintergrund war die Zielsetzung der vorliegenden Arbeit, die Etablierung pharmakologischer und immunologischer Parameter f��r die Generierung effektiver Immunantworten durch RNA-Impfstoffe sowie deren Wirksamkeit in vitro und im Mausmodell unter Nutzung von Modellantigenen zu testen. Zur Untersuchung und Optimierung der RNA-Pharmakokinetik, als einem Schl��sselaspekt der klinischen Medikamentenentwicklung, wurde der Einfluss von strukturellen Modifikationen auf die Transkriptstabilit��t und Translationseffizienz von Reporter-Proteinen in einer zeitabh��ngigen Kinetik evaluiert. Es wurde gezeigt, dass ein poly(A) Schwanz von 120 Adenosinen, verglichen mit einem k��rzeren, ein freies 3�� poly(A) Ende, verglichen mit einem verdeckten und eine doppelte ��-globin 3�� UTR, unabh��ngig voneinander zu einer Erh��hung der IVT-RNA Stabilit��t und zu einer Verbesserung der Translationseffizienz beitrugen und dadurch insgesamt zu einer erh��hten Proteinexpression f��hrten. Antigen-kodierende IVT-RNA mit diesen molekularen Merkmalen in Kombination f��hrte, im Vergleich zur Standard IVT-RNA, zu einer erh��hten Dichte und Stabilit��t von Peptid/MHC-Komplexen auf der Zelloberfl��che transfizierter DCs und dadurch zu einer verbesserten Stimulation von CD4+ und CD8+ T-Zellen im murinen und humanen System. Mit dem Ziel, die RNA kodierte Antigenform f��r die Induktion einer verst��rkten Antik��rperantwort zu modifizieren, wurde im zweiten Teil der Arbeit ein Antigen-IgM Fusionskonstrukt hergestellt und hinsichtlich seiner Eignung als neues Impfstoff-Format untersucht. Die Ausgangshypothese, dass die RNA kodierten Antigen-IgM Fusionsproteine polymerisieren, von transfizierten Zellen sezerniert werden und aufgrund der repetitiven Antigenstruktur im Vergleich mit dem monomeren Antigen zu einer Verst��rkung der Antik��rperantwort f��hren, wurde in vitro und in vivo im Mausmodell best��tigt. Die Entwicklung und Evaluierung von Zytokinfusionsproteinen zur selektiven Verst��rkung der antigenspezifischen Immunantworten bildeten den dritten Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit. Zur weiteren Verst��rkung der Antik��rperantwort wurde basierend auf den Resultaten aus dem zweiten Teil ein IL2-IgM Fusionskonstrukt hergestellt. Die Ko-Transfektion von Antigen-IgM und IL2-IgM kodierender IVT-RNA f��hrte zu einer signifikant st��rkeren Antik��rperantwort als die Ko-Transfektion von Antigen-IgM und IL2. F��r die Initiierung einer erfolgreichen anti-Tumor-Immunantwort ist das Priming antigenspezifischer T-Zellen essentiell. Um die Effizienz dieses Prozesses zu steigern, wurde ein bifunktionelles IL2-mCD40L Fusionskonstrukt hergestellt und sein Einfluss auf die Effektorfunktion von DCs in vitro und in vivo untersucht. Es wurde gezeigt, dass ein RNA kodiertes IL2-mCD40L Fusionsprotein als genetisches Adjuvanz zu einer Effizienzsteigerung des Priming zytotoxischer T-Zellen f��hrt. Somit wurden in dieser Arbeit durch die Optimierung der Pharmakokinetik, die Modifikation der Antigenform und die Herstellung und Evaluierung von Zytokinfusionskonstrukten als genetische Adjuvantien, RNA-basierte Impfstoffe f��r eine optimierte Induktion von antigenspezifischen Immunantworten weiter verbessert.

Induktion und Analyse spezifischer Immunantworten nach intranodaler Immunisierung mit RNA im murinen Modell

Die Wirksamkeit einer Vakzine ist von vielen Parametern abh��ngig. Dazu geh��ren unter anderen: das ausgew��hlte Antigen, die Formulation in der das Antigen benutzt wird sowie die Applikationsroute. Antigen-kodierende Ribonukleins��uren (RNA) gilt heutzutage als eine sichere und effiziente Alternative zu traditionellen Impfstoff-Formulierungen, wie Peptiden, rekombinanten Proteinen, viralen Systemen oder DNA basierten Impfstoffen. Bez��glich des Applikationsortes repr��sentiert der Lymphknoten ein optimales Milieu f��r die Interaktion zwischen antigenpr��sentierenden Zellen und T-Zellen. Vor diesem Hintergrund war die Zielsetzung dieser Arbeit, ein auf direktem in vivo Transfer von Antigen-kodierender in vitro transkribierter RNA (IVT-RNA) basierendes Impfverfahren zu entwickeln, zu charakterisieren und auf seine anti-tumorale Wirksamkeit zu testen. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass dendritische Zellen (DCs) in vitro hocheffizient mit IVT-RNA transfiziert werden k��nnen und eine hohe stimulatorische Kapazit��t besitzen. Durch Sequenzmodifikation der IVT-RNA konnten wir die Transkriptstabilit��t und Translationseffizienz erh��hen was zu einer Steigerung der stimulatorischen Kapazit��t in vivo f��hrte. Dar��ber hinaus untersuchten wir die Auswirkung der Insertion eines Signalpeptides 5��� sowie einer C-terminalen transmembran- und zytosolischen-Dom��ne eines MHC-Klasse-I-Molek��ls am 3��� der Antigen-kodierenden Sequenz auf die Effizienz der MHC-Klasse-I und -II Pr��sentation. Wir konnten in vitro und in vivo nachweisen, dass diese Modifikation zu einer gesteigerten, simultanen Stimulation von antigenspezifischen CD4+ und CD8+ T-Zellen f��hrt. Auf der Basis der optimierten Vektorkassetten etablierten wir die intranodale (i.n.) Transfektion von antigenpr��sentierenden Zellen in der Maus. Dazu nutzten wir verschiedene Reportersysteme (eGFP-RNA, fluoreszensmarkierte RNA) und konnten zeigen, dass die intranodale Applikation von IVT-RNA zu selektiven Transfektion und Maturation lymphknotenresidenter DCs f��hrt. Zur Untersuchung der immunologischen Effekte wurden in erster Linie auf Influenza-Hemagglutinin-A und Ovalbumin basierende Modellantigensysteme verwendet. Beide Antigene wurden als Antigen-MHC-Fusionskonstrukte genutzt. Als Responderzellen wurden TCR-transgene Lymphozyten verwendet, die MHC-Klasse-I oder -Klasse-II restringierte Epitope des Influenza-Hemagglutinin-A bzw. des Ovalbumin-Proteins erkennen. Wir konnten in vivo zeigen, dass die intranodale Immunisierung mit IVT-RNA zu einer effizienten Stimulation und Expansion von antigenspezifischen CD4+ und CD8+ T-Zellen in einer dosisabh��ngigen Weise f��hrt. Funktionell konnte gezeigt werden, dass diese T-Zellen Zytokine sezernieren und zur Zytolyse bef��higt sind. Wir waren in der Lage durch repetitive i.n. RNA Immunisierung ein ���Priming��� CD8+ T-Zellen in naiven M��usen sowohl gegen virale als auch gegen Tumor assoziierte Antigene zu erreichen. Die geprimten T-Zellen waren bef��higt eine zytolytische Aktivit��t gegen mit spezifischem Peptid beladene Targetzellen zu generieren. Dar��ber hinaus waren wir in der Lage Ged��chtnisszellen expandieren zu k��nnen. Abschlie��end konnten wir in Tumormodellen sowohl in prophylaktischen als auch in therapeutischen Experimenten zeigen dass die i.n. RNA Vakzination die Potenz zur Induktion einer anti-tumoralen Immunit��t besitzt.