Predizione dell'effetto delle mutazioni sulla variazione della stabilita' proteica con metodi di "machine-learning".

La tesi consiste nell’implementare un software in grado a predire la variazione della stabilità di una proteina sottoposta ad una mutazione. Il predittore implementato fa utilizzo di tecniche di Machine-Learning ed, in particolare, di SVM. In particolare, riguarda l’analisi delle prestazioni di un predittore, precedentemente implementato, sotto opportune variazioni dei parametri di input e relativamente all’utilizzo di nuova informazione rispetto a quella utilizzata dal predittore basilare.

Effetto dei campi elettromagnetici ad alta frequenza sull’espressione genica e proteica dell’enzima acetilcolinesterasi in cellule PC12

Con lo sviluppo di nuovi sistemi di telecomunicazione e con i progressi nelle applicazioni mediche ed industriali, l’uomo è sempre più esposto a campi elettromagnetici. Sorge quindi la volontà di indagare sui loro potenziali effetti nocivi, manifestatasi nel corso di diversi decenni di ricerca. Risultano di particolare interesse sanitario i campi elettromagnetici ad alta frequenza (HF-EMF) prodotti dai telefoni cellulari, in quanto il loro utilizzo implica il posizionamento dell’apparecchio in prossimità dell’orecchio, e quindi del cervello. Nel 2011 l’Agenzia Internazionale dell'OMS per la Ricerca sul Cancro (IARC), ha classificato gli HF-EMF come “possibilmente cancerogeni”, in quanto l’evidenza epidemiologica è stata giudicata “limitata”. Successivamente l’OMS si è espressa in favore di ulteriori ricerche giustificate dal crescente uso di telefoni cellulari, mentre non è stata richiesta l’adozione di misure precauzionali di limitazione al loro utilizzo. Emerge dunque la necessità di proseguire gli studi, che con questa tesi abbiamo indirizzato all’enzima acetilcolinesterasi (AChE). L’AChE svolge un ruolo importante nella trasmissione sinaptica in quanto catalizza l’idrolisi dell’acetilcolina (ACh), importante neurotrasmettitore nel sistema nervoso umano e animale. Lo studio dell’attività dell’AChE presenta una rilevante importanza dal punto di vista sanitario considerando che il deterioramento progressivo delle cellule neuronali, riscontrato nel Morbo di Alzheimer, è attribuito ad una diminuzione del livello del neurotrasmettitore ACh (Lane et al. 2005). A partire dagli anni 80, sono stati svolti studi sull’attività dell’enzima a seguito di esposizioni a EMF, i quali hanno evidenziato nella maggior parte dei casi un cambiamento dell’attività stessa. Il presente lavoro si avvale di un valido sistema di irraggiamento ad alta frequenza che simula l’esposizione ai segnali GSM; lo studio è stato svolto sulla linea cellulare PC12, cellule tumorali derivanti da feocromocitoma di ratto capaci di secernere e immagazzinare ACh e AChE. Sono state valutate in particolare l’attività enzimatica e l’espressione genica dell’AChE nelle cellule PC12 esposte ad una frequenza portante di 1,8 GHz con frequenza di modulazione di 217 Hz, condizioni alle quali lavorano comunemente gli apparati di telefonia mobile in modalità GSM, per un periodo di 24 h. I risultati ottenuti mostrano un aumento dell’attività dell’enzima AChE dei campioni irraggiati rispetto ai controlli, con variazione della Vmax ma non della Km, mentre non è stata rilevata alcuna variazione significativa dell’espressione genica, analizzata mediante PCR real-time. Nelle cellule PC12, si aveva una maggiore attività ed espressione genica dell’enzima in cellule trattate con forskolin e dbcAMP, impiegati come stimoli positivi. Questi risultati suggeriscono il coinvolgimento del sistema AMPc–dipendente nel controllo dell’espressione genica dell’enzima. L’AMPc, pur agendo tipicamente come secondo messaggero nella trasduzione del segnale chimico, in molte cellule di diversi organismi sembra essere aumentato anche in condizioni di stress. In particolare l’effetto si esplicava infatti sulla isoforma AChER, indotta in condizioni di stress. Il fatto che l’aumento dell’attività enzimatica di AChE indotto da HF-EMF non sia associato né all’aumento dell’affinità per il substrato, né all’aumento del numero di molecole, suggerisce l’ipotesi che i campi elettromagnetici ad alta frequenza agiscano sul microambiente di membrana che circonda l’enzima, per esempio determinando cambiamenti delle condizioni all’interno della matrice lipidica, influenzando fortemente la sua attività. Sarà interessante valutare in futuro come l’aumento della Vmax di reazione venga indotto in assenza di aumento dei trascritti genici. In conclusione il presente lavoro non fornisce risposte circa gli effetti del segnale GSM sulla salute umana, ma consente di affermare l’esistenza di un’interazione dei campi elettromagnetici con il modello biologico da noi utilizzato, richiamando l’attenzione sull’attività di questo enzima come possibile “indicatore” dell’interazione cellulare con tali segnali. Tale “indicatore”, ricercato da molti anni, non è mai stato individuato.

Studio della bioaccessibilità proteica di bevande a base di siero di fine lavorazione di Parmigiano Reggiano

Il siero di latte è un sottoprodotto dell’industria lattiero casearia dotato di ottime proprietà nutrizionali dato il contenuto in proteine ad alto valore biologico, vitamine del gruppo B e minerali quali calcio, magnesio, fosforo e zinco. Per questo è auspicabile valorizzarne l’impiego piuttosto che destinarlo allo smaltimento. All’interno del progetto regionale “Innovative Milk and Meat products for consumer's health” sono stati sviluppati dal Centro Ricerche Produzioni Animali tre prototipi di bevande ottenute a partire dal siero di fine lavorazione del Parmigiano Reggiano: una a base di siero pastorizzato, una a base di siero pastorizzato e fermentato e una terza in cui sono stati aggiunti probiotici. Le tre bevande oggetto di questo studio sono state sottoposte a digestione statica in vitro secondo il protocollo INFOGEST, i campioni di digerito sono stati prelevati a metà della fase gastrica, metà della fase duodenale e fine della fase duodenale e su questi è stata calcolata la bioaccessibilità proteica mediante assorbanza a 280 nm, il grado di idrolisi proteica con il metodo OPA, e la cinetica di proteolisi attraverso la gel elettroforesi SDS-PAGE. Dai risultati è emerso che i valori di bioaccessibilità e il grado di idrolisi proteica aumentano in maniera significativa al progredire della digestione, ma senza differenze significative nei valori finali tra i prototipi di bevande considerati. La diversa efficienza dell’idrolisi proteica nelle diverse fasi della digestione è stata confermata dall’analisi SDS page dei campioni digeriti, in cui si è potuto apprezzare un aumento delle bande a minor peso molecolare al progredire della digestione, anche in questo caso senza differenze significative tra i campioni. Quindi, nelle condizioni sperimentali utilizzate la fermentazione e l’aggiunta di probiotici non hanno influenzato significativamente la digeribilità e la bioaccessibilità delle proteine presenti nelle bevande.

Funzionalità delle proteine e ossidazione lipidica e proteica in filetti di branzino salati dopo trattamento con campi elettrici pulsati

Il presente lavoro di tesi ha avuto lo scopo di valutare l’effetto del trattamento con campi elettrici pulsati sulla funzionalità delle proteine e sul livello di ossidazione lipidica e proteica di filetti di branzino (Dicentrarchus labrax) durante 12 giorni di conservazione refrigerata. A tale scopo, un totale di 50 filetti è stato sottoposto a salagione mediante salamoia contenente il 5% di NaCl per 24 ore e successivamente diviso in 2 gruppi sperimentali (n=25/gruppo): CONT, filetti non sottoposti a trattamento e PEF, filetti trattati con campi elettrici pulsati aventi intensità di 0,6 kV/cm, ampiezza degli impulsi di 10 μs per un tempo totale di trattamento pari a 10 s. I filetti sono stati confezionati in atmosfera protettiva (20% di CO2 e 80% di N2) e conservati a temperatura di refrigerazione per i 12 giorni successivi. Nel complesso, i risultati ottenuti suggeriscono come il trattamento PEF non abbia esercitato un effetto né migliorativo né peggiorativo sulla funzionalità delle proteine, determinata tramite analisi della solubilità, risultato piuttosto inatteso data la potenzialità del PEF di migliorare la funzionalità proteica. Si può ipotizzare che il processo di salatura a cui sono stati sottoposti i campioni possa avere in qualche modo mascherato un possibile effetto positivo del trattamento a causa della solubilizzazione delle proteine avvenuta già in fase di salatura. Inoltre, nonostante il PEF possa innescare fenomeni ossidativi a carico della matrice lipidica e proteica, in questo studio non sono state osservate modificazioni, suggerendo come il trattamento non abbia alterato la stabilità ossidativa dei filetti. In conclusione, i risultati ottenuti nel presente studio sono da considerarsi positivi, in quanto è possibile evincere come il trattamento effettuato abbia consentito di migliorare le rese di processo, senza però influenzare la stabilità ossidativa di lipidi e proteine, lasciando quindi inalterata la funzionalità delle stesse.

Valutazione della funzionalità proteica di filetti di salmone affumicati

L’obiettivo del presente lavoro di tesi è stato quello di valutare l’effetto di diverse modalità di affumicatura sulla funzionalità della frazione proteica di filetti di salmoni norvegesi, valutata tramite la determinazione della solubilità e dell’ossidazione delle proteine. A tale scopo, 60 filetti di salmone dal peso omogeneo di circa 600g sono stati sottoposti a salagione e successivamente suddivisi in 3 gruppi sperimentali in funzione del processo di affumicatura (n=20/gruppo): ad aria a 20°C (AR-20), ad azoto a 20°C (AZ-20) e a 5°C (AZ-5). Al termine dei trattamenti tutti i filetti sono stati confezionati sottovuoto, conservati in cella frigorifera e sottoposti alle determinazioni analitiche a 5 diversi tempi di campionamento, per un totale di 17 giorni di conservazione. Dai dati ottenuti si evince come la tecnica di affumicatura commerciale (AR-20) determini, nel complesso, una riduzione della solubilità totale delle proteine, presumibilmente dovuta all’innesco di fenomeni ossidativi che hanno causato un accumulo di composti carbonilici, prevalentemente riscontrabile al termine della conservazione. L’affumicatura con azoto ha fatto invece registrare un miglioramento della funzionalità proteica a prescindere dalla temperatura impiegata, se paragonata all’affumicatura commerciale. A discapito di quanto atteso, l’affumicatura con azoto a 5°C non ha determinato un miglioramento in termini di solubilità ed ossidazione proteica, se paragonato alla controparte affumicata a 20°C; infatti i campioni appartenenti al gruppo AZ-20 hanno mostrato valori di solubilità proteica più elevati congiuntamente ad un contenuto di carbonili significativamente ridotto rispetto agli altri gruppi sperimentali. Alla luce di questi aspetti, ulteriori studi sono necessari al fine di confermare i risultati ottenuti ed approfondire l’effetto delle diverse modalità di affumicatura sulle proprietà funzionali e tecnologiche dei filetti di salmone.

Espressione della proteina CRM197 in escherichia coli e purificazione mediante cromatografia di affinità

In questo lavoro di tesi sono stati confrontati diversi protocolli per la purificazione della proteina CRM197 mediante cromatografia di affinità a cationi divalenti. Il CRM197 è una variante della tossina difterica caratterizzata da stessa massa molecolare e struttura. A causa di un’unica mutazione (G52E), tale variante è atossica e presenta numerose applicazioni in campo farmaceutico (in particolare nella preparazione di vaccini coniugati). Fino ad ora, per la produzione del CRM197 è stato utilizzato il ceppo originale di derivazione, cioè Corynebacterium diphteriae, e la produzione eterologa nel batterio Escherichia coli ha mostrato notevoli difficoltà. In particolare, mentre è stato possibile definire un valido protocollo di sovraespressione e di estrazione proteica, le fasi successive di purificazione e di refolding (rinaturazione) sono ancora problematiche e causano basse rese finali, ostacolando le prospettive di scale-up su scala industriale. Il CRM197, infatti, per le sue caratteristiche strutturali, come l’elevata percentuale di amminoacidi idrofobici e la presenza di foglietti β esposti al solvente, è suscettibile alla formazione di aggregati insolubili che impone, lungo tutto il processo, il controllo delle interazioni idrofobiche (con agenti denaturanti e/o detergenti). In un precedente lavoro di tesi, è stato sviluppato un protocollo valido per ottenere un’elevata espressione proteica intracellulare. Il primo passaggio di purificazione prevede una cromatografia di affinità su colonna che viene sfruttata anche per eseguire il refolding proteico. Tuttavia, durante la messa a punto di tale processo, sono stati osservati evidenti fenomeni di aggregazione della proteina, oltre all’instaurarsi di legami aspecifici proteina-proteina o proteina-resina cromatografica. In questo lavoro di tesi sono state affrontate alcune problematiche legate a tale passaggio di purificazione per cercare di individuare le condizioni ottimali per ottenere il CRM197 in forma nativa e biologicamente attiva.

La spettroscopia di forza basata sull'AFM nello studio dello spazio conformazionale e dei processi aggregativi di proteine prioniche

Le malattie neurodegenerative sono caratterizzate da aggregazione proteica, dipendente dalla perdita della usuale struttura fisiologica funzionale delle proteine coinvolte, a favore di conformazioni tossiche (patologiche). Il modello corrente descrive questi cambiamenti conformazionali come eventi rari e ritiene che non esista una sola conformazione patogena, ma che tali possibili conformazioni siano piuttosto eterogenee. La caratterizzazione di queste strutture è, di conseguenza, difficile con le tradizionali tecniche in bulk che permettono di studiare solo la conformazione media e non rendono possibile il riconoscimento delle caratteristiche dei conformeri individuali. Lo sviluppo delle tecniche di singola molecola ha permesso di studiare in modo approfondito le conformazioni possibili. In questo lavoro la spettroscopia di forza di singola molecola basata sull'AFM viene applicata a PrP (proteina responsabile delle encefalopatie spongiformi trasmissibili). Si studiano gli equilibri conformazionali del monomero e quelli di costrutti oligomerici, allo scopo di caratterizzare gli step iniziali dei processi aggregativi. Nel corso di questo lavoro di tesi è stato, in particolare, sviluppato un sistema di analisi dati, al fine di studiare in modo quantitativo le distribuzioni di eventi ottenute. Grazie a tale strumento è stato possibile riconoscere i segnali di unfolding della conformazione nativa del monomero e notare come essa sia presente anche in costrutti oligomerici, ad indicare come questo ripiegamento sia stabile anche in presenza di più monomeri ravvicinati. Si è osservato l'effetto del pH sulla stabilità di tale struttura, notando come pH acidi destabilizzino il ripiegamento nativo. Inoltre si è studiato il ruolo dell'orientazione dei monomeri nella formazione di strutture dimeriche. Monomeri e oligomeri di PrP sono stati descritti come proteine parzialmente strutturate il cui panorama energetico contiene molti minimi locali, dando origine a parecchie conformazioni transienti.

Caratteristiche qualitative delle carni di petto di pollo anomale

Il presente lavoro di tesi ha avuto lo scopo di valutare l’effetto dell’insorgenza delle anomalie “white-striping” e “wooden breast” (sia separatamente che contestualmente nell’ambito dello stesso filetto) su composizione chimica, profilo in acidi grassi e suscettibilità all’ossidazione lipidica e proteica. Le modificazioni riscontrate nella composizione chimica (maggiori livelli di collagene e lipidi a discapito del tenore in proteine) determinano una ridotta qualità nutrizionale con possibili effetti negativi sulla percezione del consumatore, oltre che sulla capacità di ritenzione idrica come riscontrato in precedenti studi. Per quanto riguarda il profilo in acidi grassi, l’effetto delle anomalie è stato più limitato rispetto a quanto ipotizzato. Infatti, nonostante l’aumento dei lipidi totali, le carni di petto anomale non presentano modificazioni nel contenuto di acidi grassi monoinsaturi e polinsaturi totali. Le uniche differenze hanno riguardato il totale degli acidi grassi saturi e il contenuto di acidi grassi essenziali (EPA, DPA, DHA) che sono risultati significativamente inferiori. Le ridotte quantità di EPA e DPA nei petti anomali possono essere correlate alla minore attività degli enzimi Δ5 e Δ6 desaturasi, probabilmente in ragione della complessiva riduzione nell’espressione dei geni che codificano tali enzimi. Da sottolineare infine che le carni anomale hanno presentato livelli inferiori di emepigmenti. Per quanto attiene alle caratteristiche tecnologiche, è stata osservato un maggiore livello di ossidazione delle proteine in relazione alla presenza dell’anomalia wooden breast. Al contrario, l’ossidazione dei lipidi non ha mostrato differenze sostanziali fra i campioni anomali e quelli normali. Nel complesso, pertanto questo lavoro di tesi ha ulteriormente evidenziato i rischi connessi all’utilizzo delle carni anomale, e soprattutto di quelle affette da wooden breast, nella preparazione di prodotti trasformati in relazione al peggioramento delle rese di lavorazione dovuto alla minore concentrazione e qualità delle proteine. La componente lipidica sembra invece essere meno compromessa dalla presenza di tali anomalie.

Evoluzione della qualita delle carni avicole durante la conservazione refrigerata

Il presente lavoro di tesi ha avuto lo scopo di valutare l’influenza della marinatura su alcuni aspetti microbiologici e chimico-fisici correlati alla qualità della carne di petto di pollo confezionata sottovuoto durante un periodo di stoccaggio di 14 giorni in condizioni refrigerate. Dalle analisi microbiologiche, è emerso che, nonostante l’aumento di pH dovuto all’azione alcalinizzante del bicarbonato, la shelf-life del prodotto marinato è rimasta invariata rispetto al gruppo di controllo non-marinato ed è stata pari a circa 14 giorni. Dal punto di vista tecnologico, gli ingredienti funzionali aggiunti nella soluzione di marinatura hanno consentito di ottenere livelli di perdite di cottura nel prodotto finito simili a quelli delle carni non-marinate durante tutto il periodo di conservazione. Ciò è riconducibile al notevole aumento della solubilità delle proteine miofibrillari determinato dall’effetto sinergico di cloruro di sodio e bicarbonato. Tuttavia, i prodotti marinati hanno mostrato maggiori perdite di liquido nelle confezioni e questo aspetto può condizionare negativamente la propensione all’acquisto da parte del consumatore. Gli effetti rilevati sul colore non costituiscono invece un elemento determinante nella scelta dei prodotti avicoli confezionati sottovuoto. Infine, è stato escluso qualsiasi effetto negativo della marinatura nei confronti della stabilità ossidativa dei lipidi. I risultati ottenuti in questo lavoro di tesi hanno pertanto dimostrato che è possibile realizzare un prodotto marinato a base di carne di petto di pollo stabile durante la conservazione offrendo così al consumatore un alimento con caratteristiche sensoriali di succulenza e tenerezza superiori e con una maggiore facilità d’uso. Restano da ottimizzare alcuni aspetti legati alla presentazione del prodotto soprattutto in relazione alla presenza di liquido nelle confezioni.