Ricostruzione di immagini di broncosfere in microscopia ottica con tecniche di estensione della profondità di fuoco

A causa della limitata estensione del campo di vista del sistema, con un microscopio ottico tradizionale non è possibile acquisire una singola immagine completamente a fuoco se l’oggetto è caratterizzato da una profondità non trascurabile. Fin dagli anni ’70, il problema dell’estensione della profondità di fuoco è stato ampiamente trattato in letteratura e molti metodi sono stati proposti per superare questo limite. Tuttavia, è molto difficile riuscire a decretare quale metodo risulti essere il migliore in una specifica applicazione, a causa della mancanza di una metrica validata e adatta ad essere utilizzata anche in casi reali, dove generalmente non si ha a disposizione un’immagine di riferimento da considerare come “la verità” (ground truth). L’Universal Quality Index (UQI) è ampiamente utilizzato in letteratura per valutare la qualità dei risultati in processi di elaborazione di immagini. Tuttavia, per poter calcolare questo indice è necessaria una ground truth. In effetti, sono state proposte in letteratura alcune estensioni dell’UQI per valutare il risultato dei metodi di fusione anche senza immagine di riferimento, ma nessuna analisi esaustiva è stata proposta per dimostrare la loro equivalenza con l’UQI standard nel valutare la qualità di un’immagine. In questo lavoro di Tesi, partendo dai limiti dei metodi attualmente utilizzati per l'estensione della profondità di campo di un microscopio, ed esposti in letteratura, per prima cosa è stato proposto un nuovo metodo, basato su approccio spaziale e fondato su analisi locale del segnale appositamente filtrato. Attraverso l’uso di sequenze di immagini sintetiche, delle quali si conosce la ground truth, è stato dimostrato, utilizzando metriche comuni in image processing, che il metodo proposto è in grado di superare le performance dei metodi allo stato dell'arte. In seguito, attraverso una serie di esperimenti dedicati, è stato provato che metriche proposte e ampiamente utilizzate in letteratura come estensione dell'UQI per valutare la qualità delle immagini prodotte da processi di fusione, sebbene dichiarate essere sue estensioni, non sono in grado di effettuare una valutazione quale quella che farebbe l'UQI standard. E’ quindi stato proposto e validato un nuovo approccio di valutazione che si è dimostrato in grado di classificare i metodi di fusione testati così come farebbe l’UQI standard, ma senza richiedere un’immagine di riferimento. Infine, utilizzando sequenze di immagini reali acquisite a differenti profondità di fuoco e l’approccio di valutazione validato, è stato dimostrato che il metodo proposto per l’estensione della profondità di campo risulta sempre migliore, o almeno equivalente, ai metodi allo stato dell’arte.

Acquisizioni e archiviazioni d'immagini microscopiche di broncosfere in radiobiologia

Nonostante l’oggettiva constatazione dei risultati positivi riscontrati a seguito dei trattamenti radioterapici a cui sono sottoposti i pazienti a cui è stato diagnosticato un tumore, al giorno d’oggi i processi biologici responsabili di tali effetti non sono ancora perfettamente compresi. Inseguendo l’obbiettivo di riuscire a definire tali processi è nata la branca delle scienze biomediche denominata radiobiologia, la quale appunto ha lo scopo di studiare gli effetti provocati dalle radiazioni quando esse interagiscono con un sistema biologico. Di particolare interesse risulta essere lo studio degli effetti dei trattamenti radioterapici nei pazienti con tumore del polmone che rappresentano la principale causa di morte dei paesi industrializzati. Purtroppo per via della scarsa reperibilità di materiale, non è stato finora possibile studiare nel dettaglio gli effetti delle cure radioterapiche nel caso di questo specifico tumore. Grazie alle ricerche di alcuni biologi dell’IRST sono stati creati in-vitro sferoidi composti da cellule staminali e tumorali di polmone, chiamate broncosfere, permettendo così di avere ottimi modelli tridimensionali di tessuto umano allo stato solido su cui eseguire esperimenti al fine di regolare i parametri dei trattamenti radioterapici, al fine di massimizzarne l’effetto di cura. In questo lavoro di Tesi sono state acquisite sequenze di immagini relative a broncosfere sottoposte a differenti tipologie di trattamenti radioterapici. Le immagini acquisite forniscono importanti indicazioni densitomorfometriche che correlate a dati clinoco-biologico potrebbero fornire importanti indicazioni per regolare parametri fondamentali dei trattamenti di cura. Risulta però difficile riuscire a confrontare immagini cellulari di pre e post-trattamento, e poter quindi effettuare delle correlazioni fra modalità di irraggiamento delle cellule e relative caratteristiche morfometriche, in particolare se le immagini non vengono acquisite con medesimi parametri e condizioni di cattura. Inoltre, le dimensioni degli sferoidi cellulari da acquisire risultano essere tipicamente maggiori del parametro depth of focus del sistema e questo implica che non è possibile acquisire una singola immagine completamente a fuoco di essi. Per ovviare a queste problematiche sono state acquisite sequenze di immagini relative allo stesso oggetto ma a diversi piani focali e sono state ricostruite le immagini completamente a fuoco utilizzando algoritmi per l’estensione della profondità di campo. Sono stati quindi formulati due protocolli operativi per fissare i procedimenti legati all’acquisizione di immagini di sferoidi cellulari e renderli ripetibili da più operatori. Il primo prende in esame le metodiche seguite per l’acquisizione di immagini microscopiche di broncosfere per permettere di comparare le immagini ottenute in diverse acquisizioni, con particolare attenzione agli aspetti critici di tale operazione. Il secondo è relativo alla metodica seguita nella archiviazione di tali immagini, seguendo una logica di classificazione basata sul numero di trattamenti subiti dal singolo sferoide. In questo lavoro di Tesi sono stati acquisiti e opportunamente archiviati complessivamente circa 6500 immagini di broncosfere riguardanti un totale di 85 sferoidi. I protocolli elaborati permetteranno di espandere il database contenente le immagini di broncosfere con futuri esperimenti, in modo da disporre di informazioni relative anche ai cambiamenti morfologici subiti dagli sferoidi in seguito a varie tipologie di radiotrattamenti e poter quindi studiare come parametri di frazionamento di dose influenzano la cura. Infine, grazie alle tecniche di elaborazioni delle immagini che stiamo sviluppando sarà inoltre possibile disporre di una ricostruzione della superficie degli sferoidi in tempo reale durante l’acquisizione.

Megistobenthic faunal diversity of the Antalya Gulf: Crustacea

The spatio-temporal distribution of megistobenthic crustacean assemblages from the Antalya Gulf, located in the Levantine Sea is described. In order to provide a comprehensive overview of the spatio-temporal patterns of the crustacean community, 3 transect including depth of 10, 25, 75, 125 and 200 m, were studied between 2014 and 2015 to investigate their association with a set of environmental parameters in representative months of each season (spring, summer, autumn and winter). For its economic importance in Levantine waters, a focus analysis of deep-water rose shrimp Parapenaeus longirostris (Lucas, 1846) was done, to investigate the length frequency composition of the population of the Antalya Gulf. A total of 58 crustacean species were encountered in the study area, of these species identified, 18 species were recognized as alien species in the Mediterranean Sea. Throughout the year the most frequent species of the study were the hermit crab Pagurus prideaux (Leach, 1815) and Parapenaeus longirostris (Lucas, 1846) followed by the Indo-Pacific swimming crab Charybdis longicollis (Leene, 1938) and by the invasive shrimp Marsupenaeus japonicus (Spence Bate, 1888). Few species contributing to a high amount to the total biomass were found throughout the year. These species were Charybdis longicollis and Parapenaeus longirostris. Stations of the study area showed similar values of diversity indices of benthic crustacean community among the three transect. The highest values of faunistic indices were detected in autumn and winter (October and February), and also varied along the depth gradient, with the highest values found between 25 and 75 meters. The multivariate analyses conducted on the abundance data point out major differences between depths and between seasons. Therefore, according to cluster analysis and ordination over abundance and biomass, three main crustacean assemblages were detected: the first corresponding to shallow bottoms (10, 25 meters), the second corresponding to intermediate waters (75 meters) and the last to deeper waters (125, 200 meters). Depth was the main factor governing the distribution of megistobenthic crustacean in the area. Besides the depth, the structure of the sediment is the most important factor in determining the crustacean assemblage. Therefore, all factors governing the crustacean distribution were found to be related to the bottom depth. The population of Parapenaeus longirostris in the Antalya Gulf showed significant differences in depth. It was found that females dominated the population of the study area (65.11%), and were significantly larger than males for each cohort identified. The size-weight relationships revealed a slight negative allometry in growth, a bit more pronounced in females than in males.