Competizione e interazioni allelopatiche tra Ostreopsis ovata e altre microalghe.

Le fioriture algali rappresentano un problema emergente che colpisce le attività ricreative costiere negli ultimi decenni e molta responsabilità è attribuita alla pressione antropica sulle coste, anche se fondamentalmente i fenomeni di fioriture dannose rimangono imprevedibili. Un tempo confinate in aree tropicali e sub-tropicali, nuove alghe tossiche produttrici di composti palitossina-simili, quali Ostreopsis spp., si sono diffuse anche in regioni temperate, come il Mediterraneo. Le condizioni di sviluppo di queste fioriture sono legate a fattori ambientali quali irraggiamento, temperatura, concentrazione di nutrienti e alle caratteristiche biologiche delle singole specie. Per valutare il rischio reale sulla salute dell’uomo, vi è necessità di conoscere i parametri ambientali ottimali alla proliferazione delle specie, in termini di temperatura, intensità luminosa e disponibilità di nutrienti, così come di chiarire la struttura delle tossine e le condizioni che possono favorire la loro produzione. In questo studio un ceppo della dinoflagellata Ostreopsis ovata e un ceppo della dinoflagellata Prorocentrum lima sono stati coltivati in colture batch a tre diverse temperature (20°C, 25°C, 30°C) come monocolture e come colture miste. La raccolta è avvenuta nel periodo della loro presunta fase stazionaria. Le informazioni circa il comportamento delle microalghe nelle diverse colture sono state raccolte tramite calcolo del tasso di crescita, analisi del consumo di nutrienti, valutazione dell’efficienza fotosintetica, produzione di tossine. E’ stato applicato un nuovo metodo di misura per il calcolo dei biovolumi. Tra le due microalghe, O. ovata ha esibito maggiore variabilità morfologica, tassi di crescita più elevati e migliore efficienza fotosintetica, mostrando però di subire stress alla temperatura di 30°C. P. lima ha presentato tassi di crescita inferiori, incompleto utilizzo dei nitrati e minore efficienza fotosintetica, accompagnata da grande dissipazione di energia sotto forma di calore. Nelle colture miste, l’uptake più rapido di nitrati da parte di O. ovata ha fatto sì che il numero di cellule di P. lima fosse notevolmente inferiore a quello sviluppatosi nelle colture pure. Ciononostante, la produzione di acido okadaico da parte di P. lima non si è modificata in presenza di O. ovata. Il ceppo di O. ovata utilizzato è stato in grado di produrre ovatossina-a, la tossina maggiormente presente nelle cellule, e quantità circa quattro volte inferiori di ovatossine d+e, oltre a piccole quantità di palitossina putativa. Non è stato invece in grado di produrre le altre due ovatossine conoscisute, l’ovatossina-b e l’ovatossina-c. La produzione di tossine ha dimostrato di essere correlata positivamente con l’aumento della temperatura quando espressa su unità di biovolume, ed è stata inferiore nelle colture miste rispetto alle colture pure. Grazie alla maggiore capacità di crescita, al miglior utilizzo di nutrienti e alla migliore efficienza fotosintetica, O. ovata si dimostra in grado di dare origine a importanti eventi di fioritura, mentre per P. lima i parametri di crescita studiati non evidenziano questa capacità. Le analisi in corso circa la quantità di tossine emesse nel mezzo di coltura permetterano di completare il quadro delineato dal presente studio. Allo stato attuale, non si può concludere che esista attività allelopatica di una specie nei confronti dell’altra.

Modelling growth dynamics and toxin production in Ostreopsis cf. ovata

The benthic dinoflagellate O. ovata represents a serious threat for human health and for the ecology of its blooming areas: thanks to its toxicity this microalga has been responsible for several cases of human intoxication and mass mortalities of benthic invertebrates. Although the large number of studies on this dinoflagellate, the mechanisms underpinning O. ovata growth and toxin production are still far to be fully understood. In this work we have enriched the dataset on this species by carrying out a new experiment on an Adriatic O. cf. ovata strain. Data from this experiment (named Beta) and from another comparable experiment previously conducted on the same strain (named Alpha), revealed some interesting aspects of this dinoflagellate: it is able to grow also in a condition of strong intracellular nutrient deficiency (C:P molar ratio > 400; C:N > 25), reaching extremely low values of chlorophyll-a to carbon ratio (0.0004). Was also found a significant inverse relationships (r > -0.7) between cellular toxin to carbon and cellular nutrient to carbon ratios of experiment Alpha. In the light of these result, we hypothesized that in O. cf. ovata nutrient-stress conditions (intended as intracellular nutrient deficiency) can cause: i) an increase in toxin production; ii) a strong decrease in chlorophyll-a synthesis; iii) a lowering of metabolism associated with the formation of a sort of resting stage. We then used a modelling approach to test and critically evaluate these hypotheses in a mechanistic way: newly developed formulation describing toxin production and fate, and ad hoc changes in the already existent formulations describing chlorophyll synthesis, rest respiration, and mortality, have been incorporated in a simplified version of the European Regional Seas Ecosystem Model (ERSEM), together with a new ad hoc parameterization. The adapted model was able to accurately reproduce many of the trends observed in the Alpha experiment, allowing us to support our hypotheses. Instead the simulations of the experiment Beta were not fully satisfying in quantitative terms. We explained this gap with the presumed different physiological behaviors between the algae of the two experiments, due to the different pre-experimental periods of acclimation: the model was not able to reproduce acclimation processes in its simulations of the experiment Beta. Thus we attempt to simulate the acclimation of the algae to nutrient-stress conditions by manual intervention on some parameters of nutrient-stress thresholds, but we received conflicting results. Further studies are required to shed light on this interesting aspect. In this work we also improve the range of applicability of a state of the art marine biogeochemical model (ERSEM) by implementing in it an ecological relevant process such as the production of toxic compounds.

Struttura filogenetica della comunità batterica associata ad Ostreopsis cf. Ovata in colture batch e dinamiche di crescita

Negli ultimi 10 anni i blooms attribuibili alla dinoflagellata bentonica Ostreopsis cf. ovata sono aumentati in termini di frequenza ed intensità lungo le coste del Mediterraneo, avendo ripercussioni negative sulla salute umana e forti impatti sulle comunità marine bentoniche, ciò a seguito della produzione di potenti tossine (composti palitossina-simili) da parte della microalga. Tra i fattori ecologici che innescano o regolano le dinamiche dei bloom tossici le interazioni tra microalghe e batteri sono in misura sempre maggiore oggetto di ricerca. In questo studio è stata analizzata la struttura filogenetica della comunità batterica associata ad O. cf. ovata in colture batch e valutate le dinamiche successionali della stessa in relazione alle differenti fasi di crescita della microalga (oltre che in relazione alle dinamiche di abbondanza virale). Lo studio filogenetico è stato effettuato tramite l’ausilio di metodiche molecolari di sequenziamento di next generation (Ion Torrent). Le abbondanze dei batteri e delle particelle virali sono state determinate tramite microscopia ad epifluorescenza; l’abbondanza cellulare algale è stata stimata tramite metodo Uthermohl. Il contributo della frazione batterica ad elevata attività respiratoria è stato determinato tramite doppia colorazione con coloranti DAPI e CTC. Dai dati emersi si evince che la comunità batterica attraversa due fasi di crescita distinte, una più marcata e concomitante con la fase esponenziale di O. cf. ovata, l'altra quando la microalga è in fase media stazionaria. Per quanto concerne la composizione filogenetica della comunità sono stati rilevati 12 phyla, 17 classi e 150 generi, sebbene i dati ottenuti abbiano rilevato una forte dominanza del phylum Proteobacteria con la classe Alphaproteobacteria, seguita dal phylum Bacteroidetes con la classe Sphingobacteria. Variazioni nella struttura filogenetica della comunità batterica, a livello di generi, tra le diverse fasi di crescita della microalga ha permesso di evidenziare ed ipotizzare particolari interazioni di tipo mutualistico e di tipo competitivo.

Dinamiche di produzione di Dimetilsolfoniopropionato (DMSP) nella dinoflagellata tossica Ostreopsis cf. ovata in colture batch

Il Dimetilsolfoniopropionato (DMSP) è un metabolita secondario prodotto da vari organismi marini, tra cui molte microalghe. Ad oggi pochi studi riguardano gli effetti dei fattori ambientali sulla produzione di DMSP nelle microalghe tossiche, tuttavia si ipotizza che la carenza di azoto (N-dep) possa influire sulla produzione di tossine e DMSP. In questo lavoro è stata indagata nella dinoflagellata Ostreopsis cf. ovata: la presenza e l’andamento del DMSP lungo tutte le fasi di crescita; i possibili effetti di differenti condizioni di crescita (i.e. bilanciata e N-dep) sulla produzione del metabolita e delle tossine. La scelta della dinoflagellata è giustificata dalle sue frequenti fioriture dannose nel Mediterraneo e dall’osservazione, in studi pregressi, di una comunità batterica associata ai suoi blooms in grado di utilizzare il DMSP come fonte energetica. Lo studio mostra per la prima volta da parte di O. cf ovata la produzione del DMSP, riportando un trend temporale simile nelle due condizioni. Si evidenzia: un minimo a fine fase esponenziale; un massimo nella prima fase stazionaria; una riduzione al termine della fase stazionaria. Il confronto fra le due condizioni evidenzia un effetto positivo di N-dep nella produzione di DMSP, evidenziato anche dal maggior tasso di produzione, che potrebbe avvenire per: utilizzare il DMSP rispetto ad altri osmoliti azotati; rilasciare nell’ambiente composti carboniosi e sulfurei, prodotti a seguito dello stress cellulare. I risultati indicherebbero come N-dep possa interferire nella sintesi di tossine e DMSP in maniera opposta, non per competizione diretta del nutriente nei processi di sintesi, ma a seguito dei cambiamenti fisiologici della microalga dovuti alla carenza nutrizionale. Infine la produzione di DMSP da parte della microalga conferma l’instaurarsi di una fase d’interazione mutualistica con i batteri ad essa associati facilitata dal DMSP, importante per lo sviluppo della popolazione algale e dei conseguenti rischi sanitari ed ecosistemici.

Individuazione dei valori ottimali di crescita di dinoflagellate bentoniche, valutazione della tossicità e di interazioni allopatiche.

Individuazione dei valori ottimali di crescita di dinoflagellate bentoniche, valutazione della tossicità e di interazioni allelopatiche. Il fitoplancton rappresenta la base della catena trofica in ambiente marino, nonché oltre la metà  della produzione primaria a livello mondiale. Le dinoflagellate, assieme alle diatomee, costituiscono la maggior parte del fitoplancton, comprendendo numerose e diversificate specie di microalghe dalla differente distribuzione, ecologia e fisiologia. Alcune specie appartenenti a tale gruppo sono in grado di dare luogo, in determinate condizioni, a estesi fenomeni di fioriture algali, che diventano particolarmente impattanti se le specie coinvolte sono responsabili della produzione di biotossine, le quali possono direttamente uccidere altri organismi o accumularsi nei loro tessuti. Gli effetti nocivi di questi fenomeni si ripercuotono pesantemente sull'ecosistema marino, con ingenti morie di organismi acquatici (da pesci a molluschi, dal bentos al necton) e profonde alterazioni nelle comunità specifiche. Un forte coinvolgimento si ha di conseguenza anche per le attività umane, in seguito a forti esternalità negative su pesca, turismo, attività ricreative, o spesso con rischi direttamente correlati alla salute umana, dovuti perlopiù ad ingestione di organismi contaminati o all'inalazione di tossine per via aerea. Negli ultimi anni le fioriture algali tossiche si sono fortemente intensificate in distribuzione, estensione e frequenza, attirando l'interesse globale della comunità scientifica. Diversi studi condotti in questo senso hanno portato all'identificazione di numerose specie di dinoflagellate tossiche e all'isolamento di una lunga serie di composti chimici con effetti dannosi da esse sintetizzate. Tuttavia si conosce ancora ben poco sull'ecologia di queste specie, in particolare su quali siano i fattori che possano indurre o regolare la proliferazione e lo sviluppo di un bloom algale. Questo studio si è focalizzato su due specie di dinoflagellate bentoniche tossiche, Ostreopsis ovata e Coolia monotis, entrambe appartenenti alla famiglia Ostreopsidaceae, note già da tempo nei paesi tropicali poiché associate alla sindrome da ciguatera. Negli ultimi anni, Ostreopsis ovata è stata oggetto di numerose ricerche in Europa, poiché ha dato luogo a fenomeni di bloom, collegati con danni respiratori nell'uomo, anche lungo i litorali italiani; soltanto recentemente grazie ad una tecnica analitica basata sulla combinazione di cromatografia liquida e spettrometria di massa (LC-MS), è stato possibile isolare la diverse tossine responsabili. Durante i vari monitoraggi e campionamenti delle acque, questa dinoflagellata è stata sempre riscontrata in presenza di Coolia monotis (e Prorocentrum lima), di cui invece si conosce ben poco, visto che la sua tossicità in Mediterraneo non è ancora stata dimostrata, né la sua tossina caratterizzata. Il primo step di questo studio è stato quello di valutare, attraverso il mantenimento di colture in vitro, l'importanza della temperatura nella crescita di O. ovata e C. monotis (singolarmente) provenienti dalla zona del monte Conero (Ancona, Marche). Esistono già studi di questo tipo su ceppi adriatici di O. ovata, tuttavia è stato effettuato un esperimento similare utilizzando un nuovo ceppo, isolato in anni recenti; per C. monotis invece non sono presenti molti studi in letteratura, in particolare nessuno riguardante ceppi italiani. La valutazione della crescita è stata effettuata attraverso conteggio delle cellule, misura dell'efficienza fotosintetica e consumo dei macronutrienti. Quindi, visto che le due specie vivono in associazione nell'ambiente marino, si è cercato di evidenziare l'instaurarsi di eventuali processi competitivi o di fenomeni di allelopatia. Dall'analisi dei risultati è emerso che, se coltivate individualmente, sia C. monotis che O. ovata mostrano un optimum di crescita alla temperatura di 20°C, con tasso di crescita, numero di cellule e rendimento fotosintetico raggiunti più elevati, seppure non di molto rispetto alle colture a 25°C. Le colture a 30°C al contrario hanno mostrato valori sensibilmente inferiori. Se fatte crescere assieme, invece, C. monotis mantiene lo stesso pattern riscontrato nella monoculture a 20 e 25°C, seppur raggiungendo numeri di cellule inferiori, mentre a 30°C ha una crescita bassissima. Al contrario, O. ovata alla temperatura più elevata raggiunge lo stesso numero di cellule della monocultura, alla temperatura intermedia registra il tasso di crescita, ma non il numero di cellule, più elevato, mentre alla temperatura più bassa (che era l'optimum per la monocultura) si ha il maggior stress per la specie, evidenziando forti fenomeni di competizione. Esperimenti su C. monotis fatta crescere in un filtrato di O. ovata non hanno invece chiarito l'esistenza o meno di eventuali effetti allelopatici di Ostreopsis su Coolia, dato che non sono apparse differenze evidenti tra il controllo e il filtrato, mentre hanno messo in luce l'importanza dei batteri associati alle microalghe come supporto alla loro crescita, poiché le colture cresciute in filtrato sterile hanno manifestato tutte quante un rendimento quantico fotosintetico inferiore.