Espressione della proteina CRM197 in escherichia coli e purificazione mediante cromatografia di affinità

In questo lavoro di tesi sono stati confrontati diversi protocolli per la purificazione della proteina CRM197 mediante cromatografia di affinità a cationi divalenti. Il CRM197 è una variante della tossina difterica caratterizzata da stessa massa molecolare e struttura. A causa di un’unica mutazione (G52E), tale variante è atossica e presenta numerose applicazioni in campo farmaceutico (in particolare nella preparazione di vaccini coniugati). Fino ad ora, per la produzione del CRM197 è stato utilizzato il ceppo originale di derivazione, cioè Corynebacterium diphteriae, e la produzione eterologa nel batterio Escherichia coli ha mostrato notevoli difficoltà. In particolare, mentre è stato possibile definire un valido protocollo di sovraespressione e di estrazione proteica, le fasi successive di purificazione e di refolding (rinaturazione) sono ancora problematiche e causano basse rese finali, ostacolando le prospettive di scale-up su scala industriale. Il CRM197, infatti, per le sue caratteristiche strutturali, come l’elevata percentuale di amminoacidi idrofobici e la presenza di foglietti β esposti al solvente, è suscettibile alla formazione di aggregati insolubili che impone, lungo tutto il processo, il controllo delle interazioni idrofobiche (con agenti denaturanti e/o detergenti). In un precedente lavoro di tesi, è stato sviluppato un protocollo valido per ottenere un’elevata espressione proteica intracellulare. Il primo passaggio di purificazione prevede una cromatografia di affinità su colonna che viene sfruttata anche per eseguire il refolding proteico. Tuttavia, durante la messa a punto di tale processo, sono stati osservati evidenti fenomeni di aggregazione della proteina, oltre all’instaurarsi di legami aspecifici proteina-proteina o proteina-resina cromatografica. In questo lavoro di tesi sono state affrontate alcune problematiche legate a tale passaggio di purificazione per cercare di individuare le condizioni ottimali per ottenere il CRM197 in forma nativa e biologicamente attiva.

Sintesi di PNA a libertà conformazionale ridotta

The present work started a research project aimed at the synthesis of conformationally “locked” PNA (Peptide Nucleic Acids) monomers. Compared to classic aeg-PNA, this structural modification would result in an improvement in the pairing properties with natural nucleic acids, due to entropic variations in the process. Specifically, an attempt was made to build a PNA monomer around a β-lactam ring. That ring could be imagined as obtained by linking the methylene groups in α position of both the nucleobase and the carboxyl function. These structural properties would imply pre-organization of the final oligomer, improving the pairing process in biological systems. The first step of this work was the investigation of the Staudinger reaction for the ciclization of the lactam ring, and in particular the activation method of the carboxylic group of the nucleobase derivatives. Use of triazine chloride led to the synthesis of the adenine-based β-lactam-PNA. Attempts to synthesize the same monomer based on cytosine, guanine and thymine were unsuccessful, so alternative methods for carboxylic group activation were investigated. Conversion of carboxylic acids to acyl chlorides led to a partial result: despite the method worked well with analogues of the final reactants, it didn’t worked with substrates needed for lactam based PNAs. Search for a valid activation process continued involving carbonyl diimidazole, Mukayama reagent, and LDA (with methylester derivative of nucelobase) without good results. Last, it was investigated a different synthetic approach by first synthesizing a proper backbone with a chlorine in the β- lactam ring. This chlorine ring should undergo substitution by a nucleobase anion to give the desired PNA monomer. Unluckily also this synthetic route didn’t lead to the desired monomers.

Espressione eterologa e purificazione della istone deacetilasi umana 1 (HDAC1)

La proteina umana HDAC1 fa parte della famiglia delle HDAC (Istone Deacetilasi); questi enzimi, ad azione deacetilasica, catalizzano la reazione di rimozione di un gruppo acetile a livello degli istoni, componenti fondamentali della cromatina, la cui struttura influenza il ciclo cellulare e la regolazione dell’espressione genica. L’importanza della proteina in questione, a scopo terapeutico, risiede nello studio degli inibitori ad essa associati, i quali risultano utili a livello farmacologico, come coadiuvanti nelle terapie per la cura di tumori. La produzione di HDAC1 ha previsto l’utilizzo di due diversi ceppi del batterio Escherichia coli, denominati TOP10 e BW25993, che sono serviti come sistemi “ospiti” per l’inserimento del vettore di espressione pBAD-HDAC1 contenente la porzione di DNA che codifica per la proteina ricombinante. Sono state determinate le condizioni più idonee, per entrambi i sistemi analizzati, in modo da massimizzare l’espressione della proteina indotta mediante aggiunta di arabinosio al terreno di coltura. A seconda della combinazione ceppo-vettore, infatti, il livello di espressione ottenuto cambia significativamente. In seguito, gli estratti proteici totali sono stati sottoposti a purificazione mediante diversi passaggi cromatografici ed è stata determinata la resa finale del processo. La caratterizzazione della proteina ricombinante purificata ha evidenziato una forma aggregata, di tipo ottamerico, che potrebbe influenzare l’attività enzimatica. Per questo motivo sono stati portati avanti numerosi tentativi di dissociazione dell’oligomero incubando HDAC1 con diversi agenti. Un effetto disaggregante è stato osservato solo in presenza di due detergenti, SDS (anionico) e CTAB (cationico), i quali hanno permesso di ottenere la proteina in forma monomerica. Tra i due detergenti, l’SDS è risultato più efficace, mentre per il CTAB si richiedono ulteriori indagini ed approfondimenti. Altri studi, infine, sono auspicabili ai fini di migliorare ulteriormente la fase di espressione, in modo da rendere il protocollo di produzione adatto ad un’applicazione a livello industriale.