Genetic variability and structuring of deep Corallium rubrum (Linnaeus, 1758) populations

ABSTRACT Given the decline of shallow-water red coral populations resulting from over-exploitation and mass mortality events, deeper populations below 50 metres depth (mesophotic populations) are currently the most harvested; unfortunately, very little is known about their biology and ecology. The persistence of these populations is tightly linked to their adult density, reproductive success, larval dispersal and recruitment. Moreover, for their conservation, it is paramount understand processes such as connectivity within and among populations. Here, for the first time, genetic variability and structuring of Corallium rubrum populations collected in the Tyrrhenian Sea ranging from 58 to 118 metres were analyzed using ten microsatellite loci and two mitochondrial markers (mtMSH and MtC). The aims of the work were 1) to examine patterns of genetic diversity within each geographic area (Elba, Ischia and Praiano) and 2) to define population structuring at different spatial scales (from tens of metres to hundreds of kilometres). Based on microsatellite data set, significant deviations from Hardy-Weinberg equilibrium due to elevated heterozygote deficiencies were detected in all samples, probably related to the presence of null alleles and/or inbreeding, as was previously observed in shallow-water populations. Moreover, significant levels of genetic differentiation were observed at all spatial scale, suggesting a recent isolation of populations. Biological factors which act at small spatial scale and/or abiotic factors at larger scale (e.g. summer gyres or absence of suitable substrata for settlement) could determine this genetic isolation. Using mitochondrial markers, significant differences were found only at wider scale (between Tuscany and Campania regions). These results could be related to the different mutation rate of the molecular makers or to the occurrence of some historical links within regions. A significant isolation by distance pattern was then observed using both data sets, confirming the restricted larval dispersal capability of the species. Therefore, the hypothesis that deeper populations may act as a source of larvae helping recovery of threatened shallow-water populations is not proved. Conservation strategies have to take into account these results, and management plans of deep and currently harvested populations have to be defined at a regional or sub regional level, similarly to shallow-water populations. Nevertheless, further investigations should be needed to understand better the genetic structuring of this species in the mesophotic zone, e.g. extending studies to other Mediterranean deep-water populations.

Genetic characterisation and global comparison of ancient Mediterranean Great White Sharks population (Carcharodon carcharias, L.1758)

This study poses as its objective the genetic characterization of the ancient population of the Great White shark, Carcharodon carcharias, L.1758, present in the Mediterranean Sea. Using historical evidence, for the most part buccal arches but also whole, stuffed examples from various national museums, research institutes and private collections, a dataset of 18 examples coming from the Mediterranean Sea has been created, in order to increase the informations regarding this species in the Mediterranean. The importance of the Mediterranean provenance derives from the fact that a genetic characterization of this species' population does not exist, and this creates gaps in the knowledge of this species in the Mediterranean. The genetic characterization of the individuals will initially take place by the extraction of the ancient DNA and the analysis of the variations in the sequence markers of the mitochondrial DNA. This approach has allowed the genetic comparison between ancient populations of the Mediterranean and contemporary populations of the same geographical area. In addition, the genetic characterization of the population of white sharks of the Mediterranean, has allowed a genetic comparison with populations from global "hot spots", using published sequences in online databases (NCBI, GenBank). Analyzing the variability of the dataset, both in terms space and time, I assessed the evolutionary relationships of the Mediterranean population of Great Whites with the global populations (Australia/New Zealand, South Africa, Pacific USA, West Atlantic), and the temporal trend of the Mediterranean population variability. This method based on the sequencing of two portions of mitochondrial DNA genes, markers showed us how the population of Great White Sharks in the Mediterranean, is genetically more similar to the populations of the Australia Pacific ocean, American Pacific Ocean, rather than the population of South Africa, and showing also how the population of South Africa is abnormally distant from all other clusters. Interestingly, these results are inconsistent with the results from tagging of this species. In addition, there is evidence of differences between the ancient population of the Mediterranean with the modern one. This differentiation between the ancient and modern population of white shark can be the result of events impacting on this species occurred over the last two centuries.

Identification of stock units of Mullus barbatus (Linnaeus, 1758) in the Italian seas: development of genomic 2b-RAD markers and biological variation analysis.

This thesis is settled within the STOCKMAPPING project, which represents one of the studies that were developed in the framework of RITMARE Flagship project. The main goals of STOCKMAPPING were the creation of a genomic mapping for stocks of demersal target species and the assembling of a database of population genomic, in order to identify stocks and stocks boundaries. The thesis focuses on three main objectives representing the core for the initial assessment of the methodologies and structure that would be applied to the entire STOCKMAPPING project: individuation of an analytical design to identify and locate stocks and stocks boundaries of Mullus barbatus, application of a multidisciplinary approach to validate biological methods and an initial assessment and improvement for the genotyping by sequencing technique utilized (2b-RAD). The first step is the individuation of an analytical design that has to take in to account the biological characteristics of red mullet and being representative for STOCKMAPPING commitments. In this framework a reduction and selection steps was needed due to budget reduction. Sampling areas were ranked according the individuation of four priorities. To guarantee a multidisciplinary approach the biological data associated to the collected samples were used to investigate differences between sampling areas and GSAs. Genomic techniques were applied to red mullet for the first time so an initial assessment of molecular protocols for DNA extraction and 2b-RAD processing were needed. At the end 192 good quality DNAs have been extracted and eight samples have been processed with 2b-RAD. Utilizing the software Stacks for sequences analyses a great number of SNPs markers among the eight samples have been identified. Several tests have been performed changing the main parameter of the Stacks pipeline in order to identify the most explicative and functional sets of parameters.

Studio della presenza di capodogli (Physeter macrocephalus, Linnaeus 1758) in due aree del Mar Balear mediante metodi acustici passivi

I capodogli (Physeter macrocephalus) sono mammiferi marini con distribuzione cosmopolita; sono presenti anche nel Mar Mediterraneo, soprattutto nella zona occidentale del bacino. Per individuare la presenza di questi animali possono essere utilizzate differenti modalità. Questo studio è stato condotto tramite l’uso di metodi acustici passivi, in quanto i capodogli (P. macrocephalus) sono animali che emettono suoni. L’uso di metodi acustici ha alcuni vantaggi, infatti permette di individuare la presenza di un animale anche se si trova al di sotto della superficie dell’acqua, purché stia emettendo suoni. Le registrazioni possono essere effettuate indipendentemente dalle condizioni meteorologiche e per lunghi periodi di tempo, permettendo la continuità nella raccolta dei dati. Il lavoro di tesi è stato svolto nell’ambito di un Progetto di Ricerca de L’Oceanogràfic di Valencia. Le registrazioni sono state effettuate tramite lo strumento EAR (Ecological Acoustic Recorder) in due aree del Mar Balear, il Mar di Bamba e il Parco Nazionale di Cabrera, in differenti periodi, profondità e con diverse frequenze di campionamento (50 kHz e 5 kHz). I dati ottenuti sono stati analizzati tramite i programmi X-BAT (Extensible Bioacoustic Tool) e Adobe Audition 3.0 al fine di rilevare i pulsi emessi dai capodogli. Per entrambe le aree di studio i dati sono stati elaborati in modo da ottenere modelli giornalieri e stagionali delle ore positive e del numero di pulsi emessi. La presenza di P. macrocephalus è stata confermata in entrambe le aree di studio, e dal confronto delle analisi spettrali dei pulsi si può affermare che, nonostante le differenze, i pulsi registrati in entrambe le aree sono effettivamente emessi da capodogli. Il lavoro di Tesi permette di suggerire che per futuri studi sia applicata la frequenza di registrazione di 20 kHz utilizzando lo strumento SAMARUC, alla cui progettazione ha partecipato L’Oceanogràfic di Valencia.

Struttura di età di nasello (Merluccius merluccius, Linnaeus, 1758) in alto-medio Adriatico mediante analisi degli otoliti e frequenza di taglia

The aim of present study is to define the general framework of Merluccius merluccius population structure, to estimate the growth rate and to assess the recruitment dynamics of juveniles from Northern and Central Adriatic, through otoliths analysis. The otoliths of hake specimens collected during the MedITS trawl survey in the 2012 in GSA 17, were cleaned and 102 otoliths out of 506 were embedded, sectioned, grindined and polished to obtain frontal and sagittal sections. The whole sample were analysed under stereomicroscope and optical microscope, with camera and connected to PC provided of an image analyses program. The frequency analysis of size classes and age revealed that the species is dominated by hake with >200mm TL and > one year old. The fish average size of M. merluccius at the end of the first year of life is about 199 mm TL. Allometrics analyses between fish TL and Feret (major axis), MiniFeret (minor axis), Area, Perimeter, showed a direct proportionality among lengths. Among the 88 otoliths sections analysed, the number of daily increments read ranged from 86 to 206, within 55 and 175mm TL range. The age estimate ranged from about 2-3 to 9 months and the growth rate from 20.99 to 27.15mm TL. The hatch-date distribution, obtained by back calculation, showed that the hatching occurs in November-March. In conclusion, strong preventive measures are needed for hake adults because the success of this species seems to be linked to deep water ecosystem protection where big spawners dwell.

Influenze ontogenetiche e ambientali sui fattori di condizione di Merluccius merluccius Linnaeus, 1758 (Pisces: Gadiformes) e Galeus melastomus Rafinesque, 1810 (Pisces: Carcharhiniformes): Implicazioni sulla gestione delle risorse

In ecologia della pesca, i fattori o indicatori della “condizione” di un organismo forniscono molte informazioni sulle caratteristiche di adattamento dei pesci all’ambiente e sul loro ruolo nell’ecosistema. La “condizione” include molte caratteristiche strutturali ed energetiche che possono variare in funzione dell’ontogenesi, del ciclo riproduttivo, ma anche in funzione delle caratteristiche dell’ambiente, incluso il grado di stress al quale è sottoposta una specie (es. la pressione di pesca). L’obiettivo del presente studio sperimentale è stato valutare eventuali differenze nell’abbondanza, nei parametri di popolazione, nella struttura demografica e negli indicatori di “condizione” di due specie, Merluccius merluccius (Pisces: Gadiformes) e Galeus melastomus (Pisces: Carcharhiniformes), in due diverse aree: Toscana settentrionale e meridionale, differenti per caratteristiche ambientali e pressione di pesca. Nella prima parte dell’analisi, sono stati confrontati gli indici di densità e biomassa, la struttura di taglia delle due popolazioni, su dati estratti dagli archivi storici delle campagne di pesca sperimentale MEDITS dal 1994 al 2013. Nella seconda parte dell’analisi invece, sono stati analizzati 1000 individui provenienti dalla campagna MEDITS 2014, integrati con campioni provenienti dallo sbarcato commerciale per il biennio 2014-2015. Gli individui di M. merluccius sono stati ripartiti in due classi di taglia (I = individui ≤ 18 cm LT; II = individui > 18 cm LT), quelli di G. melastomus in tre classi di taglia (I = individui ≤ 20 cm LT; II = individui 20 cm< x ≤ 35 cm LT; III= individui > 35 cm LT), suddivisi rispettivamente in 50 maschi e 50 femmine, per ogni classe. E’ stato condotto lo studio della crescita relativa attraverso l’analisi della relazione taglia/peso e lo studio della condizione tramite i seguenti indicatori: il fattore K di Fulton, l’indice epatosomatico (HSI) e l’indice gonadosomatico (GSI). I risultati di questa tesi hanno evidenziato differenze nei popolamenti, riconducibili alle diverse condizioni ambientali e alla pressione di pesca, tra le due aree indagate. L’area sud, interessata da un più intenso sforzo di pesca esercitato sui fondali della piattaforma e della scarpata continentale e da una morfologia del fondale differente, mostra una diversità in termini di crescita relativa e stato della “condizione”, che risulta più elevata in entrambe le specie, rispetto all’area settentrionale, caratterizzata invece da uno sforzo di pesca meno intenso, incentrato sull’ampia piattaforma continentale.

Accrescimento di Chamelea gallina (Linneo, 1758) in Adriatico

La vongola Chamelea gallina è un mollusco appartenente alla famiglia Veneridae avente un'ampia distribuzione nel Mediterraneo. L’animale vive su fondali sabbiosi o sabbiosi – fangosi, con distribuzione aggregata, in prossimità della costa, a bassa profondità da 0 a 15metri. Nel presente studio è stata stimata sia la biomassa di Chamelea gallina espressa in kg/mq che la distribuzione di taglia, per valutare l’accrescimento della specie. L’accrescimento della vongola, così come per altre specie fossorie è influenzato da fattori biotici e abiotici, come la temperatura, lo stato trofico delle acque, la natura dei sedimenti ed infine la densità. Lo scopo di questa tesi è stato quello di monitorare l’attività di pesca delle vongole nel Compartimento di Rimini e raccogliere gli elementi conoscitivi esistenti a fine di ottimizzare la gestione della risorsa. A tal fine sono state realizzate a Rimini due campagne di pesca nel mese di Luglio e Dicembre 2014, utilizzando una draga idraulica di tipo commerciale conforme agli standard previsti dalla legge. Il campionamento è stato effettuato su 9 transetti perpendicolari alla costa con stazioni a 0,25-0,50-0,75 e proseguendo 1 Miglio qualora nei campioni vi sia ancora la presenza di vongole. A fine di valutare la frazione di individui con taglia inferiore a quella commerciale (25mm), all’interno della draga è stato posto un retino campionatore. Il materiale contenuto nella draga è stato selezionato al vibro-vaglio installato a bordo, attrezzato con griglie aventi fori del diametro di 19mm di apertura. Tutte le vongole trattenute dal vaglio sono state analizzate per ottenere una distribuzione di taglia. I risultati acquisiti nel corso della presente indagine hanno evidenziato una generale situazione di sofferenza per la taglia commerciale. In particolare sono state catturate molte vongole della prima maturità sessuale (14mm). Tutto ciò potrebbe essere proprio un’indicazione di banco in ricostituzione e ripresa dopo una situazione di crisi. Per quanto riguarda le forme giovanili i risultati ottenuti dalle due campagne di pesca indicano una notevole differenza di densità dei banchi di Chamelea gallina. Tali risultati sono stati ottenuti con il software ImageJ, il quale è in grado di rilevare la larghezza massima delle singole vongole. Infine sono stati registrati i valori di biomassa espressi in kg/mq, evidenziando una discreta oscillazione di valori tra le stazioni campionate. Infatti in entrambi i campionamenti le stazioni situate all’ interno degli strati più costieri presentano nella maggior parte dei casi valori, sia in biomassa che in numero, maggiori rispetto a quelle di largo. Concludendo, l’insieme dei dati raccolti ha evidenziato la necessità di urgenti misure di controllo e regolamentazione della risorsa, dei parametri eco-ambientali e della pesca esercitata, al fine di acquisire quelle informazioni utili per avviare un corretto piano di gestione della risorsa.

First assessment on genetic structure and phylogeography of Mediterranean blue shark (prionace glauca, L. 1758) population using mitochondrial gene variation: a comparison with the Atlantic.

The blue shark, Prionace glauca, is one of the most vagile shark species worldwide distributed. The particular body shape allows blue sharks make transoceanic movements, leading to a circumglobal distribution. Due to its reproductive cycle, an extraordinarily high number of specimens is globally registered but, even if it is still a major bycatch of longline fishery rather than a commercial target, it is characterized by a high vulnerability. In this perspective it is important to increase the amount of informations regarding its population extent in the different worldwide areas, evaluating the possible phylogeographic patterns between different locations. This study, included in the "MedBlueSGen" European project, aims exactly at filling a gap in knowledges regarding the genetic population structure of the Mediterranean blue sharks, which has never been investigated before, with a comparison with the North-Eastern Atlantic blue shark population. To reach this objective, we used a dataset of samples from different Mediterranean areas implementing it with some samples from North-Eastern Atlantic. Analyzing the variability of the two mitochondrial markers control region and cytochrome b, with the design of new species-specific primer pairs, we assessed the mitochondrial genetic structure of Mediterranean and North-Eastern Atlantic samples, focusing on the analysis of their possible connectivity, and we tried to reconstruct their demographic history and population size. Data analyses highlighted the absence of a genetic structuring within the Mediterranean and among it and North-Eastern Atlantic, suggesting that the Strait of Gibraltar doesn't represent a phylogeographic barrier. These results are coherent to what has been found in similar investigations on other worldwide blue shark populations. Analysis of the historical demographic trend revealed a general stable pattern for the cytochrome-b and a slightly population expansion for the control region marker.

Sclerocronologia di Chamelea gallina (Linnaeus, 1758) in Adriatico

La conoscenza dell’età e della crescita dei bivalvi è un requisito fondamentale per uno studio di dinamica di popolazione e per una gestione ottimale della risorsa. Lo scopo di questa tesi è quello di individuare una metodologia valida per riconoscere la precisa natura dell’origine dei microincrementi di crescita nel guscio di Chamelea gallina, riconoscendo le discontinuità annuali all’interno del guscio. Sono stati prelevati gusci di individui di C. gallina provenienti da un precedente campionamento nella baia della Vallugola il 06/09/2013. Le valve sono state incluse in resina epossidica e sezionate dall’umbone al margine centrale e levigate così da poter osservare le fettine ottenute allo stereomicroscopio a luce trasmessa. Il vantaggio riscontrato di questa metodologia è rappresentato dalla inaccessibilità delle strutture di deposizione alle perturbazioni ambientali anche se risulta impossibile annullare i possibili effetti dovuti all’attività di pesca o di altri eventi stressanti. Sono stati individuati solamente organismi con uno o due anni di età. I picchi di rallentamento della crescita sincronizzati in ogni classe di taglia potrebbero indicare tassi di accrescimento costanti entro le classi di taglia. Si può notare inoltre una certa ciclicità con cui si presentano i picchi di rallentamento della crescita. Essi si presentano circa ogni 10-12 crestine corrispondenti ipoteticamente ad una annualità. Un limite di questa metodica è dato dal fatto che si riesce a leggere l’informazione contenuta nel guscio ma, senza una validazione non è possibile associarla ad un preciso periodo di vita dell’organismo. A causa delle tempistiche limitate, non è stato possibile condurre esperimenti di crescita in campo per validare la periodicità delle micro linee di accrescimento ma sarebbe auspicabile in futuro riuscire a svolgere almeno una delle diverse metodiche di validazione.