"Assisted factorial experimental design" per l'ottimizzazione della determinazione di benzene ematico in gc-fid

La quantificazione del benzene ematico è un tema di grande interesse nell'ambito della tossicologia occupazionale. La determinazione dell'analita, estratto nello spazio di testa di un vial, è eseguita mediante l'utilizzo di un gascromatografo con rilevatore a ionizzazione di fiamma (GC-FID). Si è cercato di ottimizzare il processo di estrazione del benzene dal sangue allo spazio di testa ed il successivo trasferimento dell'analita nella colonna cromatografica, mediante l'applicazione di un disegno sperimentale fattoriale a tre fattori e due livelli (DoE). I fattori individuati per impostare il piano sperimentale sono stati: variazione della temperatura di incubazione (A) del vial contenente il campione di sangue, pH del campione (B), modulato mediante aggiunta di una soluzione di H2SO4 e forza ionica (C), regolata mediante una soluzione acquosa di NaCl. I livelli scelti per ciascuna variabile sono stati: per A 40 e 60 °C; per B pH naturale del campione e pH a seguito dell'aggiunta di 1 mL di H2SO4 1.8 M; per C FI naturale del campione e FI dovuta all'aggiunta di una soluzione acquosa di sodio cloruro (5 g/L). Dall'analisi dei risultati forniti dal DoE, si è osservato che A, B e C hanno effetti tra loro contrastanti, per questo motivo non sembra essere vantaggioso combinare variabili differenti. In compenso, sia l'aumento di temperatura che l'aggiunta di acido solforico portano a significativi miglioramenti nell'estrazione di benzene dal sangue. Tra i tre trattamenti risulta essere B quello più efficace, motivo per il quale si ritiene che l'aggiunta di una soluzione acquosa di H2SO4 al campione di sangue porti ad una maggiore sensibilità e risoluzione strumentale. Sicuramente la sensibilità del metodo elaborato non può essere paragonata alle tradizionali determinazioni con spettrometro di massa, ma si ritiene possa essere sufficientemente soddisfacente per valutare l'esposizione a benzene dei lavoratori a rischio e come analisi di screening rapida ed economica.

Stock boundaries of Parapenaeus longirostris (Lucas, 1846) populations in the Italian seas: Development of genomic 2b-RAD markers and biological variation analysis.

This thesis is developed in the contest of Ritmare project WP1, which main objective is the development of a sustainable fishery through the identification of populations boundaries in commercially important species in Italian Seas. Three main objectives are discussed in order to help reach the main purpose of identification of stock boundaries in Parapenaeus longirostris: 1 -Development of a representative sampling design for Italian seas; 2 -Evaluation of 2b-RAD protocol; 3 -Investigation of populations through biological data analysis. First of all we defined and accomplished a sampling design which properly represents all Italian seas. Then we used information and data about nursery areas distribution, abundance of populations and importance of P. longirostris in local fishery, to develop an experimental design that prioritize the most important areas to maximize the results with actual project funds. We introduced for the first time the use of 2b-RAD on this species, a genotyping method based on sequencing the uniform fragments produced by type IIB restriction endonucleases. Thanks to this method we were able to move from genetics to the more complex genomics. In order to proceed with 2b-RAD we performed several tests to identify the best DNA extraction kit and protocol and finally we were able to extract 192 high quality DNA extracts ready to be processed. We tested 2b-RAD with five samples and after high-throughput sequencing of libraries we used the software “Stacks” to analyze the sequences. We obtained positive results identifying a great number of SNP markers among the five samples. To guarantee a multidisciplinary approach we used the biological data associated to the collected samples to investigate differences between geographical samples. Such approach assures continuity with other project, for instance STOCKMED, which utilize a combination of molecular and biological analysis as well.