Stock boundaries of Parapenaeus longirostris (Lucas, 1846) populations in the Italian seas: Development of genomic 2b-RAD markers and biological variation analysis.

This thesis is developed in the contest of Ritmare project WP1, which main objective is the development of a sustainable fishery through the identification of populations boundaries in commercially important species in Italian Seas. Three main objectives are discussed in order to help reach the main purpose of identification of stock boundaries in Parapenaeus longirostris: 1 -Development of a representative sampling design for Italian seas; 2 -Evaluation of 2b-RAD protocol; 3 -Investigation of populations through biological data analysis. First of all we defined and accomplished a sampling design which properly represents all Italian seas. Then we used information and data about nursery areas distribution, abundance of populations and importance of P. longirostris in local fishery, to develop an experimental design that prioritize the most important areas to maximize the results with actual project funds. We introduced for the first time the use of 2b-RAD on this species, a genotyping method based on sequencing the uniform fragments produced by type IIB restriction endonucleases. Thanks to this method we were able to move from genetics to the more complex genomics. In order to proceed with 2b-RAD we performed several tests to identify the best DNA extraction kit and protocol and finally we were able to extract 192 high quality DNA extracts ready to be processed. We tested 2b-RAD with five samples and after high-throughput sequencing of libraries we used the software “Stacks” to analyze the sequences. We obtained positive results identifying a great number of SNP markers among the five samples. To guarantee a multidisciplinary approach we used the biological data associated to the collected samples to investigate differences between geographical samples. Such approach assures continuity with other project, for instance STOCKMED, which utilize a combination of molecular and biological analysis as well.

Valutazione degli stock di alici (Engraulis encrasicolus) e sardine (Sardina pilchardus) con metodi di dinamica di popolazione

Il presente studio si occupa di indagare lo stato delle popolazioni di alici, Engraulis encrasicolus, e sardine, Sardina pilchardus, presenti nel Mar Adriatico Centrale e Settentrionale attraverso l’utilizzo di metodi di dinamica di popolazione. L’attenzione per queste specie è dovuta alla loro importanza commerciale; sono, infatti, specie “target” della flotta peschereccia italiana, in particolare nell’area adriatica. I metodi di dinamica di popolazione sono uno degli aspetti più importanti delle scienze della pesca. Attraverso lo stock assessment si possono acquisire informazioni sull’abbondanza in mare delle risorse nel tempo e nello spazio, nonché sulla mortalità dovuta all’attività di pesca, che sono di primaria importanza per l’adozione di misure gestionali. I metodi di dinamica di popolazione esaminati e confrontati in questa tesi sono stati due: Virtual Population Analysis (VPA) e Integrated Catch-at-Age Analysis (ICA). Prima, però, è stato necessario esaminare le modalità con cui ottenere i dati di “input”, quali: tassi di crescita delle specie, mortalità naturale, sforzo di pesca, dati di cattura. Infine, è stato possibile ricostruire nel tempo la storia dello stock in questione e il suo stato attuale, dando indicazioni per lo sfruttamento futuro in un’ottica di conservazione dello stock stesso. Attraverso la determinazione della curva di crescita si sono potuti ottenere i parametri di crescita delle specie in esame, necessari per definire i tassi di mortalità naturale. L’abbondanza di questi stock è stata valutata con i programmi Age Length Key (ALK) e Iterative Age Length Key (IALK). Nei programmi di stock assessment utilizzati si è preferito utilizzare la stima di abbondanza calcolata con il primo metodo, in quanto più rappresentativo dello stock in esame. Un parametro di fondamentale importanza e di difficile stima è la mortalità; in particolare, in questo studio ci siamo occupati di determinare la mortalità naturale. Questa è stata determinata utilizzando due programmi: ProdBiom (Abella et al., 1998) e il sistema ideato da Gislason et al. (2008). Nonostante l’approccio conservativo suggerisca l’utilizzo dei valori ricavati da ProdBiom, in quanto più bassi, si è preferito utilizzare i tassi di mortalità naturale ricavati dalla seconda procedura. Questa preferenza è stata determinata dal fatto che il programma ProdBiom consegna indici di mortalità naturale troppo bassi, se confrontati con quelli presentati in letteratura per le specie in esame. Inoltre, benché nessuno dei due programmi sia stato costruito appositamente per le specie pelagiche, è comunque preferibile la metodologia ideata da Gislason et al. (2008), in quanto ottenuta da un esame di 367 pubblicazioni, in alcune delle quali erano presenti dati per queste specie. Per quanto riguarda i dati di cattura utilizzati in questo lavoro per il calcolo della Catch Per Unit Effort (CPUE, cioè le catture per unità di sforzo), si sono utilizzati quelli della marineria di Porto Garibaldi, in quanto questa vanta una lunga serie temporale di dati, dal 1975 ad oggi. Inoltre, in questa marineria si è sempre pescato senza imposizione di quote e con quantitativi elevati. Determinati questi dati è stato possibile applicare i programmi di valutazione degli stock ittici: VPA e ICA. L’ICA risulta essere più attendibile, soprattutto per gli anni recenti, in quanto prevede un periodo nel quale la selettività è mantenuta costante, riducendo i calcoli da fare e, di conseguenza, diminuendo gli errori. In particolare, l’ICA effettua i suoi calcoli considerando che i dati di cattura e gli indici di “tuning” possono contenere degli errori. Nonostante le varie differenze dei programmi e le loro caratteristiche, entrambi concordano sullo stato degli stock in mare. Per quanto riguarda l’alice, lo stock di questa specie nel Mar Adriatico Settentrionale e Centrale, altamente sfruttato in passato, oggi risulta moderatamente sfruttato in quanto il livello di sfruttamento viene ottenuto con un basso livello di sforzo di pesca. Si raccomanda, comunque, di non incrementare lo sforzo di pesca, in modo da non determinare nuove drastiche diminuzioni dello stock con pesanti conseguenze per l’attività di pesca. Le sardine, invece, presentano un trend diverso: dalla metà degli anni ottanta lo stock di Sardina pilchardus ha conosciuto un continuo e progressivo declino, che solo nell’ultimo decennio mostra un’inversione di tendenza. Questo, però, non deve incoraggiare ad aumentare lo pressione di pesca, anzi bisogna cercare di mantenere costante lo sforzo di pesca al livello attuale in modo da permettere il completo ristabilimento dello stock (le catture della flotta italiana sono, infatti, ancora relativamente basse). Questo lavoro, nonostante i vari aspetti da implementare (quali: il campionamento, le metodologie utilizzate, l’introduzione di aspetti non considerati, come ad es. gli scarti,… etc.) e le difficoltà incontrate nel suo svolgimento, ha fornito un contributo di approfondimento sugli spinosi aspetti della definizione del tasso di mortalità naturale, individuando una procedura più adatta per stimare questo parametro. Inoltre, ha presentato l’innovativo aspetto del confronto tra i programmi ICA e VPA, mostrando una buon accordo dei risultati ottenuti. E’ necessario, comunque, continuare ad approfondire questi aspetti per ottenere valutazioni sempre più precise e affidabili, per raggiungere una corretta gestione dell’attività di pesca e ai fini della preservazione degli stock stessi.

Species identification, distributioin and reproductive interactions of common smoot-hound and blackspotted smooth-hound shark (Genus mustelus) in the Adriatic Sea

Longstanding taxonomic ambiguity and uncertainty exist in the identification of the common (M. mustelus) and blackspotted (M. punctulatus) smooth-hound in the Adriatic Sea. The lack of a clear and accurate method of morphological identification, leading to frequent misidentification, prevents the collation of species-specific landings and survey data for these fishes and hampers the delineation of the distribution ranges and stock boundaries of the species. In this context, adequate species-specific conservation and management strategies can not be applied without risks of population declining and local extinction. In this thesis work I investigated the molecular ecology of the two smooth-hound sharks which are abundant in the demersal trawl surveys carried out in the NC Adriatic Sea to monitor and assess the fishery resources. Ecological and evolutionary relationships were assessed by two molecular tests: a DNA barcoding analysis to improve species identification (and consequently the knowledge of their spatial ecology and taxonomy) and a hybridization assay based on the nuclear codominant marker ITS2 to evaluate reproductive interactions (hybridization or gene introgression). The smooth-hound sharks (N=208) were collected during the MEDITS 2008 and 2010 campaigns along the Italian and Croatian coasts of the Adriatic Sea, in the Sicilian Channel and in the Algerian fisheries. Since the identification based on morphological characters is not strongly reliable, I performed a molecular identification of the specimens producing for each one the cytochrome oxidase subunit 1 (COI) gene sequence (ca. 640 bp long) and compared them with reference sequences from different databases (GenBank and BOLD). From these molecular ID data I inferred the distribution of the two target species in the NC Adriatic Sea. In almost the totality of the MEDITS hauls I found no evidence of species sympatry. The data collected during the MEDITS survey showed an almost different distribution of M. mustelus (confined along the Italian coasts) and M. punctulatus (confined along the Croatian coasts); just one sample (Gulf of Venice, where probably the ranges of the species overlap) was found to have catches of both the species. Despite these data results suggested no interaction occurred between my two target species at least during the summertime (the period in which MEDITS survey is carried out), I still wanted to know if there were inter-species reproductive interactions so I developed a simple molecular genetic method to detect hybridization. This method is based on DNA sequence polymorphism among species in the nuclear ribosomal Internal Transcribed Spacer 2 locus (ITS2). Its application to the 208 specimens collected raised important questions regarding the ecology of this two species in the Adriatic Sea. In fact results showed signs of hybridization and/or gene introgression in two sharks collected during the trawl survey of 2008 and one collected during the 2010 one along the Italian and Croatian coasts. In the case that it will be confirmed the hybrid nature of these individuals, a spatiotemporal overlapping of the mating behaviour and ecology must occur. At the spatial level, the northern part of the Adriatic Sea (an area where the two species occur with high frequency of immature individuals) could likely play the role of a common nursery area for both species.

Identification of stock units of Mullus barbatus (Linnaeus, 1758) in the Italian seas: development of genomic 2b-RAD markers and biological variation analysis.

This thesis is settled within the STOCKMAPPING project, which represents one of the studies that were developed in the framework of RITMARE Flagship project. The main goals of STOCKMAPPING were the creation of a genomic mapping for stocks of demersal target species and the assembling of a database of population genomic, in order to identify stocks and stocks boundaries. The thesis focuses on three main objectives representing the core for the initial assessment of the methodologies and structure that would be applied to the entire STOCKMAPPING project: individuation of an analytical design to identify and locate stocks and stocks boundaries of Mullus barbatus, application of a multidisciplinary approach to validate biological methods and an initial assessment and improvement for the genotyping by sequencing technique utilized (2b-RAD). The first step is the individuation of an analytical design that has to take in to account the biological characteristics of red mullet and being representative for STOCKMAPPING commitments. In this framework a reduction and selection steps was needed due to budget reduction. Sampling areas were ranked according the individuation of four priorities. To guarantee a multidisciplinary approach the biological data associated to the collected samples were used to investigate differences between sampling areas and GSAs. Genomic techniques were applied to red mullet for the first time so an initial assessment of molecular protocols for DNA extraction and 2b-RAD processing were needed. At the end 192 good quality DNAs have been extracted and eight samples have been processed with 2b-RAD. Utilizing the software Stacks for sequences analyses a great number of SNPs markers among the eight samples have been identified. Several tests have been performed changing the main parameter of the Stacks pipeline in order to identify the most explicative and functional sets of parameters.

Coca cola hbc italia: Modello per il calcolo di inventory stock target e production cycles ottimali

Approccio unificato alla gestione e alla valutazione del planning in stabilimenti e magazzini, presso Coca Cola HBC Italia