Analisi della resa di purificazione di componenti della dna polimerasi III di escherichia coli

Nella seguente tesi sono stati affrontati differenti protocolli di purificazione di componenti della DNA polimerasi III di Escherichia coli, previamente sovraespressi nel microrganismo. A distanza di oltre 20 anni dall’identificazione della DNA polimerasi III quale enzima responsabile della replicazione del genoma di E. coli, sono stati fatti progressi riguardo la sua conoscenza. Tuttavia molti sono gli aspetti rimasti incogniti riguardo al meccanismo d’azione dell’enzima, così come il ruolo svolto dalle sue subunità e parte della loro struttura. Al fine di migliorare la comprensione di questo enzima, è necessario insistere sulla diffrattometria di raggi X, per la quale è indispensabile l’isolamento di cristalli delle proteine. Si intuisce la necessità di sviluppare metodi appropriati che consentano di ottenere una resa il più possibile elevata dei suoi componenti. Una metodica generale per la sovraespressione del core catalitico e della singola subunità α, deputata all’attività polimerasica a carico di entrambi i filamenti di DNA, era già stata perfezionata presso il laboratorio ospitante. Con il presente lavoro sono stati sperimentati alcuni procedimenti, volti ad aumentare la resa di purificazione, adottando differenti soluzioni. In primo luogo, si è cercato di recuperare le proteine contenute nel flow through eluito da una colonna cromatografica Q-Sepharose, alla quale non erano riuscite a legarsi durante il primo stadio di purificazione. Inoltre, sono stati sperimentati metodi alternativi di lisi cellulare di estrazione delle proteine. In sintesi, il contenuto della tesi potrebbe agevolare la valutazione di diverse strategie per incrementare la resa di purificazione della subunità α e del core polimerasico della DNA Polimerasi III di E. coli.

Effetto di composti d'aroma sulla risposta fisiologica di Listeria monocytgenes

La citofluorimetria è una tecnica applicata per misurare le caratteristiche fisiche, morfologiche e fisiologiche di cellule microbiche ed ha il pregio di generare un dato per ogni singola particella (cellula) analizzata. Poiché è noto che l’assenza di sviluppo in piastra non implica necessariamente l’assenza di forme microbiche vitali, questa tecnica ha un grande potenziale nello studio dei trattamenti termici che mirano alla stabilizzazione ed alla sicurezza igienico-sanitaria dei prodotti alimentari. Infatti, nel contesto industriale la tendenza è quella di ridurre l’entità di questi trattamenti (tempi/temperature). Ciò può avvenire anche grazie all’utilizzo di composti d’aroma, la cui attività antimicrobica è ben documentata, poiché il trattamento termico, incrementando la tensione di vapore di queste sostanze, ne potenzia l’attività antimicrobica. Questa tesi è incentrata su due aspetti: da una parte, l’effetto dell’esposizione di L. monocytogenes a diverse concentrazioni di timolo e carvacrolo (terpenoidi prevalenti in oli essenziali di Labiatae tra cui timo e origano), dall’altra la valutazione degli effetti di trattamenti termici subletali (45, 50, 55°C), anche in presenza di composti d’aroma, sulla disattivazione e sul successivo recupero di L. monocytogenes. I risultati hanno confermato la forte sinergia tra trattamento termico e presenza di sostanze terpeniche. È stato inoltre dimostrato che la presenza di tali composti incide drasticamente sulle potenzialità di recupero degli eventuali sopravvissuti dopo il trattamento termico. I risultati a volte discordanti tra l’analisi citofluorimetrica (focalizzata sull’integrità della membrana) e i conteggi in piastra hanno evidenziato come i due approcci debbano essere utilizzanti in modo complementare. L’utilizzo di altri coloranti legati ad altre funzioni biologiche e metaboliche permetterà l’ottenimento di informazioni aggiuntive circa la risposta fisiologica di questo microrganismo.

Problematiche igienico - sanitarie nella produzione di uova e ovoprodotti: analisi critica e gestione dei rischi

In questo mio elaborato vengono analizzate le principali problematiche igienico sanitarie della filiera di produzione delle uova e ovoprodotti, In particolare dopo un’analisi economica del settore di produzione delle uova e ovoprodotti vengono illustrati i principali metodi di allevamento delle galline ovaiole anche alla luce delle recenti tendenze a favorire allevamenti con sistemi alternativi a quelli delle gabbie tradizionali. Sono state inoltre illustrate le diverse fasi lavorazione delle uova in guscio (dalla raccolta alla selezione e confezionamento) e degli ovoprodotti includendo la descrizione delle diverse tipologie di prodotti d’uovo disponibili sul mercato. Accanto alla descrizione dei processi produttivi si sono illustrati anche i riferimenti normativi che disciplinano tali prodotti con particolare riferimento ai regolamenti relativi in materia di igiene, produzione e commercializzazione delle uova di categoria A. In relazione al focus principale della mia tesi sono stati inoltre descritti i principali rischi sanitari per l’uomo derivanti dal consumo di uova e ovoprodotti contaminati, accanto alle principali anomalie fisiche ed alle più comuni frodi alimentari. Più in particolare sono stati illustrati i dati raccolti a livello europeo sui focolai tossinfettivi nei quali sono state coinvolte le uova e ovoprodotti facendo particolare attenzione alle infezioni da S.enteritidis, principale microrganismo contaminante questi prodotti alimentari. Infine sono stati illustrati i principali interventi di gestione del rischio sanitario per le uova e ovoprodotti, partendo dalla fase di produzione fino ad arrivare ad interventi del consumatore, con i quali limitare la diffusione delle malattie a trasmissione alimentare.

Studio propedeutico del potenziale di crescita di Listeria monocytogenes durante la shelf life di confezioni monoporzione di battuta di vitello

Scopo della tesi è la valutazione del potenziale di crescita (δ) di Listeria monocytogenes espressa come differenza tra il carico cellulare (log10 ufc/g) alla fine e all’inizio della prova, in monoporzioni di battuta di vitello (tartare) confezionate sottovuoto e conservate a temperatura di refrigerazione. Si tratta di un alimento ready to eat – RTE – prodotto dalla Ditta INALCA Spa e destinato ad una catena di ristorazione. I challenge test hanno lo scopo di fornire informazioni sul comportamento in determinate condizioni di conservazione, di L. monocytogenes inoculata artificialmente in un alimento. L. monocytogenes è un microrganismo patogeno ubiquitario nell’ambiente e resistente a diverse condizioni ambientali. E’ stato dimostrato che il batterio è responsabile della contaminazione post-processo degli alimenti, in quanto è stato isolato da impianti di trasformazione, macchine per l’imballaggio, nastri trasportatori, guanti, congelatori e guarnizioni. Sono state oggetto di studio: - i) 3 u.c. inoculate con soluzione fisiologica sterile su cui sono stati valutati Aw, pH, carica aerobia mesofila, batteri lattici, Pseudomonas, Enterobacteriaceae, muffe e lieviti; - ii) 1 u.c. non soggetta ad alcun inoculo per la ricerca qualitativa/quantitativa di L. monocytogenes; - iii) 9 u.c. contaminate con una miscela di 5 ceppi di L. monocytogenes (circa 100 ufc/g). Le confezioni inoculate sono state conservate per 21 giorni (pari alla shelf-life commerciale), di cui i primi 7 alla temperatura di +3°C, ed i successivi 14 giorni a +5°C. Il valore δ è risultato pari a 0.57: essendo superiore, seppure di poco, al valore soglia 0.5, le tartare in esame sono classificate come alimenti pronti che costituiscono terreno favorevole alla crescita di L. monocytogenes (categoria 1.2); in base al regolamento (CE) 2073/2005, il microrganismo deve essere assente in 25 g alla produzione e < 100 ufc/g durante la shelf–life (nota 5 e 7).

Valutazione statistica della ripetibilità di esperimenti di sequenziamento del DNA in specie batteriche

I progressi della biologia molecolare assieme alle nuove tecnologie di sequenziamento applicate su scala genomica alla genetica molecolare, hanno notevolmente elevato la conoscenza sulle componenti di base della biologia e delle patologie umane. All’interno di questo contesto, prende piede lo studio delle sequenze genetiche dei batteri, consentendo dunque, una migliore comprensione di ciò che si nasconde dietro le malattie legate all’uomo. Il seguente lavoro di tesi si propone come obiettivo l’analisi del DNA del batterio Listeria monocytogenes, un microrganismo presente nel suolo e in grado di contaminare l’acqua e gli alimenti. Lo scopo principale è quello di confrontare la variabilità tecnica e biologica, al fine di capire quali siano gli SNPs reali (Single Nucleotide Polymorphism) e quali artefatti tecnici. La prima parte, quindi, comprende una descrizione del processo di individuazione degli SNPs presenti nel DNA dei campioni in esame, in particolare di tre isolati diversi e tre copie. Nella seconda parte, invece, sono effettuate delle indagini statistiche sui parametri relativi agli SNPs individuati, ad esempio il coverage o il punteggio di qualità assegnato alle basi. Il fine ultimo è quello di andare a verificare se sussistano particolari differenze tra gli SNPs dei vari isolati batterici.

Espressione genica di Lactobacilullus paracasei A13 esposto a livelli sub-letali di alte pressioni di omogeneizzazione

L’obiettivo della mia tesi è stato quello di valutare gli effetti delle alte pressioni di omogeneizzazione sulla vitalità, idrofobicità, modulazione degli acidi grassi di membrana e la risposta genica, legata soprattutto alla biosintesi di acidi grassi, di Lactobacillus paracasei A13 quando sottoposto a trattamenti ad alta pressione di omogeneizzazione compresi tra 50 e 200 MPa. I dati di carico cellulare, registrati anche dopo trattamento a 200 MPa, hanno dimostrato che Lb. paracasei A13 è fortemente baro tollerante. Inoltre, il trattamento iperbarico induce un incremento di idrofobicità del ceppo, soprattutto quando trattato a 150 MPa, influenzando potenzialmente in modo positivo l’interazione tra il microrganismo oggetto di studio e l’intestino dell’ospite. I dati riguardanti gli acidi grassi hanno dimostrato che la membrana cellulare, ritenuta uno dei bersagli più suscettibili alla pressione, è in grado di rispondere agli stress sub letali provocati dal trattamento iperbarico. In particolare, all’aumentare della pressione, aumenta il grado d’insaturazione della membrana, accompagnato anche da un incremento degli acidi grassi ciclici, da una riduzione della catena carboniosa degli acidi grassi C12, 13, 14 e da una diminuzione degli idrossiacidi, giustificata con la ben nota capacità di molti batteri lattici di trasformarli, in condizioni di stress, in molecole quorum sensing quali ad esempio i furanoni. I dati relativi allo studio di specifici geni, indicano chiaramente una iperespressione dei geni fabH e fabD, responsabili delle prime fasi di biosintesi degli acidi grassi. Pertanto, la loro significativa iperespressione a 150 e 200 MPa rende ragione del significativo incremento di acidi grassi a corta catena registrato in tali condizioni. Anche il significativo aumento degli acidi grassi insaturi può essere spiegato attraverso l’incremento di espressione di fabF e fabZ responsabili dell’introduzione di doppi legami nella catena carboniosa.

Effetto di starter autoctoni sulla qualità e la sicurezza di salami tradizionali spagnoli

Il lavoro svolto in questa tesi aveva l’obiettivo di valutare il potenziale tecnologico e bioprotettivo di ceppi di batteri lattici (LAB) isolati da salami tradizionali spagnoli. In particolare due ceppi (Lactiplantibacillus paraplantarum BPF2 e Pediococcus acidilactici ST6) che avevano dimostrato buone performance in vitro sono stati utilizzati, da soli o in miscela, come colture starter per la produzione salami e i prodotti ottenuti sono stati confrontati con un controllo a fermentazione spontanea ed un prodotto addizionato di uno starter commerciale contenente LAB e stafilococchi. Per quanto riguarda gli aspetti tecnologici, il pH ha mostrato cinetiche di acidificazione simili in tutti i prodotti, mentre il calo peso era più lento nel controllo. A livello microbiologico, i campioni addizionati di colture starter hanno mostrato carichi di LAB molto più elevati già al tempo zero, senza differenze significative in relazione al ceppo utilizzato. Enterobatteri e lieviti hanno mostrato andamenti simili in tutti i campioni. L’utilizzo di colture starter ha invece avuto un impatto rilevante sul contenuto di ammine biogene, con valori totali doppi nel campione ottenuto con fermentazione spontanea, e sul profilo in metaboliti volatili (soprattutto a carico di composti derivanti dall’acido piruvico). L’aspetto più rilevante di questa tesi è stato ottenuto nel challenge test, utilizzando come microrganismo target Listeria monocytogenes (inoculo 3 log ufc/g): infatti, nel controllo e nei campioni contenenti starter commerciale, L. monocytogenes era in grado di crescere fino a valori superiori a 5.7 log ufc/g, mentre i ceppi BPF2 e ST6 hanno determinato una riduzione del suo carico cellulare (2.4 log ufc/g). Questo conferma quindi le grandi potenzialità anti-listeria dei due ceppi testati e la loro attitudine ad essere utilizzati, oltre che come starter per i salami, anche come colture bioprotettive con lo specifico compito di contrastare lo sviluppo di L. monocytogenes.