Effetto dei campi elettromagnetici ad alta frequenza sull’espressione genica e proteica dell’enzima acetilcolinesterasi in cellule PC12

Con lo sviluppo di nuovi sistemi di telecomunicazione e con i progressi nelle applicazioni mediche ed industriali, l’uomo è sempre più esposto a campi elettromagnetici. Sorge quindi la volontà di indagare sui loro potenziali effetti nocivi, manifestatasi nel corso di diversi decenni di ricerca. Risultano di particolare interesse sanitario i campi elettromagnetici ad alta frequenza (HF-EMF) prodotti dai telefoni cellulari, in quanto il loro utilizzo implica il posizionamento dell’apparecchio in prossimità dell’orecchio, e quindi del cervello. Nel 2011 l’Agenzia Internazionale dell'OMS per la Ricerca sul Cancro (IARC), ha classificato gli HF-EMF come “possibilmente cancerogeni”, in quanto l’evidenza epidemiologica è stata giudicata “limitata”. Successivamente l’OMS si è espressa in favore di ulteriori ricerche giustificate dal crescente uso di telefoni cellulari, mentre non è stata richiesta l’adozione di misure precauzionali di limitazione al loro utilizzo. Emerge dunque la necessità di proseguire gli studi, che con questa tesi abbiamo indirizzato all’enzima acetilcolinesterasi (AChE). L’AChE svolge un ruolo importante nella trasmissione sinaptica in quanto catalizza l’idrolisi dell’acetilcolina (ACh), importante neurotrasmettitore nel sistema nervoso umano e animale. Lo studio dell’attività dell’AChE presenta una rilevante importanza dal punto di vista sanitario considerando che il deterioramento progressivo delle cellule neuronali, riscontrato nel Morbo di Alzheimer, è attribuito ad una diminuzione del livello del neurotrasmettitore ACh (Lane et al. 2005). A partire dagli anni 80, sono stati svolti studi sull’attività dell’enzima a seguito di esposizioni a EMF, i quali hanno evidenziato nella maggior parte dei casi un cambiamento dell’attività stessa. Il presente lavoro si avvale di un valido sistema di irraggiamento ad alta frequenza che simula l’esposizione ai segnali GSM; lo studio è stato svolto sulla linea cellulare PC12, cellule tumorali derivanti da feocromocitoma di ratto capaci di secernere e immagazzinare ACh e AChE. Sono state valutate in particolare l’attività enzimatica e l’espressione genica dell’AChE nelle cellule PC12 esposte ad una frequenza portante di 1,8 GHz con frequenza di modulazione di 217 Hz, condizioni alle quali lavorano comunemente gli apparati di telefonia mobile in modalità GSM, per un periodo di 24 h. I risultati ottenuti mostrano un aumento dell’attività dell’enzima AChE dei campioni irraggiati rispetto ai controlli, con variazione della Vmax ma non della Km, mentre non è stata rilevata alcuna variazione significativa dell’espressione genica, analizzata mediante PCR real-time. Nelle cellule PC12, si aveva una maggiore attività ed espressione genica dell’enzima in cellule trattate con forskolin e dbcAMP, impiegati come stimoli positivi. Questi risultati suggeriscono il coinvolgimento del sistema AMPc–dipendente nel controllo dell’espressione genica dell’enzima. L’AMPc, pur agendo tipicamente come secondo messaggero nella trasduzione del segnale chimico, in molte cellule di diversi organismi sembra essere aumentato anche in condizioni di stress. In particolare l’effetto si esplicava infatti sulla isoforma AChER, indotta in condizioni di stress. Il fatto che l’aumento dell’attività enzimatica di AChE indotto da HF-EMF non sia associato né all’aumento dell’affinità per il substrato, né all’aumento del numero di molecole, suggerisce l’ipotesi che i campi elettromagnetici ad alta frequenza agiscano sul microambiente di membrana che circonda l’enzima, per esempio determinando cambiamenti delle condizioni all’interno della matrice lipidica, influenzando fortemente la sua attività. Sarà interessante valutare in futuro come l’aumento della Vmax di reazione venga indotto in assenza di aumento dei trascritti genici. In conclusione il presente lavoro non fornisce risposte circa gli effetti del segnale GSM sulla salute umana, ma consente di affermare l’esistenza di un’interazione dei campi elettromagnetici con il modello biologico da noi utilizzato, richiamando l’attenzione sull’attività di questo enzima come possibile “indicatore” dell’interazione cellulare con tali segnali. Tale “indicatore”, ricercato da molti anni, non è mai stato individuato.

Progettazione, Sintesi e Caratterizzazione di nanoparticelle a base di HSA-MnO2 per la terapia multimodale del cancro

Una strategia promettente per potenziare l’efficacia di un trattamento antitumorale limitandone gli effetti collaterali sistemici e i fenomeni di resistenza, è quella di combinare, all’interno di un nanoveicolo, l’azione sinergica/additiva di diversi trattamenti terapeutici, come ad esempio la terapia fotodinamica (PDT) e l’immunoterapia. In questo lavoro di tesi sono state preparate nanoparticelle multimodali altamente biodegradabili e biocompatibili, a base di albumina umana (HSA) caricate con un pro-farmaco del paclitaxel (PTX), un agente chemioterapeutico approvato per il trattamento di diversi tumori solidi; una molecola fotosensibile, IR780, che illuminata a una specifica lunghezza d'onda, induce la formazione di specie radicaliche dell'ossigeno (ROS) e ossigeno di singoletto (1O2), in grado di uccidere le cellule malate; ed infine con Indoximod (IND), in grado di inibire un checkpoint immunitario, con azione indiretta sull’enzima indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO-1). Le nanoparticelle sono poi state rivestite con un guscio di MnO2, per limitare l’ipossia caratteristica dell’ambiente tumorale, potenziando così l’azione citotossica. Le nanoparticelle ottenute sono state caratterizzate in termini di dimensioni, capacità di loading, stabilità in acqua e in ambiente fisiologico. Inoltre, mediante spettroscopia UV-vis, è stata studiata la capacità dell’IR780 di produrre specie reattive all’ossigeno (ROS). In futuro, saranno studiati i fenomeni di rilascio dei diversi agenti dalle nanoparticelle e sarà verificato se la presenza dell’ossido di manganese sia in grado di migliorare l’ossigenazione del microambiente tumorale.

Produzione dei bulbi piliferi tramite bioprining

I costrutti della pelle umana bioingegnerizzati (HSC) hanno il potenziale per fornire una terapia efficace per quei pazienti con lesioni cutanee significative e consente anche uno screening farmacologico rilevante per le malattie della pelle; tuttavia, l'integrazione di appendici cutanee ingegnerizzate, come i follicoli piliferi (HF), negli HSC rimane una grande sfida. Un gruppo di ricercatori della Columbia University della Irving Medical Center (CUMC) ha dimostrato un approccio biomimetico per la generazione di HF umani all'interno di HSC ricapitolando l'organizzazione fisiologica 3D delle cellule nel microambiente degli HF usando stampi stampati in 3D. La sovraespressione di Lef-1 nelle cellule della papilla dermica (DPC) ripristina la firma trascrizionale DPC intatta e migliora significativamente l'efficienza della differenziazione degli HF negli HSC. Inoltre, la vascolarizzazione prima dell'innesto degli HSC, contenenti HF, permette un'efficiente crescita dei capelli umani nei topi immunodeficienti. La capacità di rigenerare un intero HF da cellule umane coltivate avrà un impatto trasformativo sulla gestione medica di diversi tipi di alopecia, nonché sulle ferite croniche, che rappresentano i principali bisogni medici non soddisfatti.

Valutazione delle tecniche di parallelizzazione nell'addestramento di una CNN per la diagnostica del cancro al seno.

Il cancro è un processo autosufficiente e adattivo che interagisce dinamicamente con il suo microambiente, la cui diagnosi, complessa e dispendiosa in termini di tempo e numero di specialisti impiegati, viene solitamente effettuata valutando l’imaging radiografico oppure effettuando un esame istologico. L'interpretazione di tali immagini risulta generalmente molto complessa, a questo scopo sarebbe molto utile poter addestrare un computer a comprendere tali immagini potendo di fatto affiancarsi allo specialista, senza sostituirlo, al momento della diagnosi. A questo scopo è possibile affidarsi alle tecniche di apprendimento automatico, sistema alla base dell’intelligenza artificiale (AI), le quali permettono di fatto di apprendere automaticamente la rappresentazione delle caratteristiche da immagini campione. Tali tecniche di intelligenza artificiale, hanno però bisogno, per essere addestrate, di grandi quantità di dati in cui il segnale di uscita desiderato è noto, comportando di fatto un aumento delle tempistiche di addestramento. Inoltre, in ambito sanitario, i dati sono distribuiti su più archivi, dislocati sul territorio nazionale, rendendo impossibile l’utilizzo di soluzioni centralizzate. L’obbiettivo di questa trattazione sarà cercare di trovare una soluzione a queste due problematiche, ricorrendo all’utilizzo delle tecniche di parallelizzazione. A seguito dell'introduzione dello scenario biologico e delle tecniche di diagnostica ad esso associato è presentato il percorso di creazione della rete neurale. A seguito del suo addestramento sulla GPU di una singola macchina, ottenendo un'accuratezza dell'83.94% in 5 ore 48 minuti e 43 secondi, è stata introdotto la parallelizzazione ed una sua implementazione. In conclusione, sfruttando il sistema implementato, è stata distribuita la fase di addestramento prima su due macchine e poi su tre, ottenendo una diminuzione del tempo di addestramento rispettivamente del 31.4% e del 50%.

Monitoraggio della viscoelasticità di un modello di coltura cellulare 3D per lo studio della fibrosi epatica

Lo sviluppo di fibrosi epatica si associa caratteristicamente a un eccesso di produzione e reticolazione della matrice extracellulare del tessuto, che causa un progressivo aumento del modulo elastico e della viscosità dell’organo – che a loro volta determinano ipertensione portale e insufficienza funzionale. Modelli avanzati che riproducano in vitro il microambiente epatico sono cruciali per lo studio della patogenesi del fenomeno e per la valutazione di adeguate terapie future. Un esempio chiaro di questa strategia viene presentato in un recente lavoro di ricerca, nel quale Cacopardo et al. propongono una strategia basata sull’utilizzo di tipi differenti di idrogel, con proprietà elastiche e viscosità variabili, per studiare la meccano-dinamica in un ambiente di coltura tridimensionale. Idrogel di carichi di cellule sono dunque stati differenzialmente reticolati mediante transglutaminasi microbica, utilizzando un metodo citocompatibile originale che consenta l’esposizione delle cellule a un ambiente con proprietà meccaniche che variano nel tempo. Per la coltura dei costrutti 3D è stato inoltre utilizzato un bioreattore che si è dimostrato utile anche per monitorare nel tempo le proprietà meccaniche dei costrutti cellulari. I risultati hanno mostrato che una maggiore “solidità” della matrice è coerente con l’aumento dello stress cellulare. Il metodo proposto si è dimostrato quindi in grado di imitare efficacemente il microambiente meccanico associato alla fibrosi epatica e in evoluzione nel tempo e, di conseguenza, potrebbe fornire nuove informazioni sui processi fisiopatologici correlati e suggerire più efficaci strategie terapeutiche.