Analisi della resa di purificazione di componenti della dna polimerasi III di escherichia coli

Nella seguente tesi sono stati affrontati differenti protocolli di purificazione di componenti della DNA polimerasi III di Escherichia coli, previamente sovraespressi nel microrganismo. A distanza di oltre 20 anni dall’identificazione della DNA polimerasi III quale enzima responsabile della replicazione del genoma di E. coli, sono stati fatti progressi riguardo la sua conoscenza. Tuttavia molti sono gli aspetti rimasti incogniti riguardo al meccanismo d’azione dell’enzima, così come il ruolo svolto dalle sue subunità e parte della loro struttura. Al fine di migliorare la comprensione di questo enzima, è necessario insistere sulla diffrattometria di raggi X, per la quale è indispensabile l’isolamento di cristalli delle proteine. Si intuisce la necessità di sviluppare metodi appropriati che consentano di ottenere una resa il più possibile elevata dei suoi componenti. Una metodica generale per la sovraespressione del core catalitico e della singola subunità α, deputata all’attività polimerasica a carico di entrambi i filamenti di DNA, era già stata perfezionata presso il laboratorio ospitante. Con il presente lavoro sono stati sperimentati alcuni procedimenti, volti ad aumentare la resa di purificazione, adottando differenti soluzioni. In primo luogo, si è cercato di recuperare le proteine contenute nel flow through eluito da una colonna cromatografica Q-Sepharose, alla quale non erano riuscite a legarsi durante il primo stadio di purificazione. Inoltre, sono stati sperimentati metodi alternativi di lisi cellulare di estrazione delle proteine. In sintesi, il contenuto della tesi potrebbe agevolare la valutazione di diverse strategie per incrementare la resa di purificazione della subunità α e del core polimerasico della DNA Polimerasi III di E. coli.

Semplificazione della geometria per l'analisi modale FEM di un carter motociclistico

Creazione di un modello semplificato per l’analisi modale FEM di un carter motociclistico. La scelta degli elementi da considerare nel modello è stata fatta in funzione della loro importanza in termini di variazione di massa del basamento completo, elemento fondamentale che ha influenzato anche la scelta delle semplificazioni da apportare ai vari elementi.

Statistical methods for the analysis of DNA sequences: application to dinucleotide distribution in the human genome

Questa tesi si inserisce nell'ambito delle analisi statistiche e dei metodi stocastici applicati all'analisi delle sequenze di DNA. Nello specifico il nostro lavoro è incentrato sullo studio del dinucleotide CG (CpG) all'interno del genoma umano, che si trova raggruppato in zone specifiche denominate CpG islands. Queste sono legate alla metilazione del DNA, un processo che riveste un ruolo fondamentale nella regolazione genica. La prima parte dello studio è dedicata a una caratterizzazione globale del contenuto e della distribuzione dei 16 diversi dinucleotidi all'interno del genoma umano: in particolare viene studiata la distribuzione delle distanze tra occorrenze successive dello stesso dinucleotide lungo la sequenza. I risultati vengono confrontati con diversi modelli nulli: sequenze random generate con catene di Markov di ordine zero (basate sulle frequenze relative dei nucleotidi) e uno (basate sulle probabilità di transizione tra diversi nucleotidi) e la distribuzione geometrica per le distanze. Da questa analisi le proprietà caratteristiche del dinucleotide CpG emergono chiaramente, sia dal confronto con gli altri dinucleotidi che con i modelli random. A seguito di questa prima parte abbiamo scelto di concentrare le successive analisi in zone di interesse biologico, studiando l’abbondanza e la distribuzione di CpG al loro interno (CpG islands, promotori e Lamina Associated Domains). Nei primi due casi si osserva un forte arricchimento nel contenuto di CpG, e la distribuzione delle distanze è spostata verso valori inferiori, indicando che questo dinucleotide è clusterizzato. All’interno delle LADs si trovano mediamente meno CpG e questi presentano distanze maggiori. Infine abbiamo adottato una rappresentazione a random walk del DNA, costruita in base al posizionamento dei dinucleotidi: il walk ottenuto presenta caratteristiche drasticamente diverse all’interno e all’esterno di zone annotate come CpG island. Riteniamo pertanto che metodi basati su questo approccio potrebbero essere sfruttati per migliorare l’individuazione di queste aree di interesse nel genoma umano e di altri organismi.

Sovraespressione, purificazione e caratterizzazione cinetica della polimerasi DnaE di Deinococcus radiodurans

Il passo preliminare del presente elaborato è quello di mettere a punto un metodica solida e riproducibile per la sovraespressione della subunità α di D. radiodurans per via eterologa. L’ospite ideale per realizzare la sovraespressione è E. coli, microorganismo ampiamente discusso e impiegato per via della sua semplice manipolazione. Per realizzare la sovraespressione il ceppo di E. coli prescelto è stato trasformato con il plasmide pBAD-dnaE e la proteina in esame è stata ottenuta come corpi di inclusione (biologicamente inattiva). Successivamente alla fase di rinaturazione e alla purificazione tramite cromatografia liquida dell’enzima è stato possibile ottenere quantità sufficienti di proteina pura e biologicamente attiva con la quale condurre saggi spettrofotometrici di attività enzimatica per valutare il comportamento dell’enzima in vitro simulando le condizioni di substrato attese in vivo. È proprio in quest’ultimo frangente che si condensa lo scopo di questo lavoro. La conduzione dei saggi di attività enzimatica in condizioni ricombinative e non ricombinative (quindi in presenza o meno di RecAEc nell’ambiente di reazione) ci ha consentito di comprendere meglio il comportamento della pol III-α durante la fase di strand invasion mediata dalla ricombinasi e la successiva sintesi del neofilamento, contribuendo a chiarire alcuni aspetti dei meccanismi che intervengono lungo la via di riparazione del genoma danneggiato in D. radiodurans ancora poco discussi. Inoltre l’elaborazione di un sistema di espressione per la singola subunità α getterebbe le basi per sviluppare un sistema di co-espressione più complesso ove siano coinvolte anche altre subunità dell’oloenzima (τ-δ-δ’), in modo da poter verificare la tipologia di subassemblaggio che spontaneamente avverrebbe in vivo e gli stimoli relativi tra le diverse subunità che ne migliorerebbero l’efficienza.

Sviluppo e sperimentazione di sensori per il monitoraggio della qualità dell'aria

Individuare e conoscere la natura degli inquinanti atmosferici e disporre dei dati delle emissioni sono azioni fondamentali per formulare politiche ambientali incentrate sul miglioramento della qualità dell'aria e monitorarne l'efficacia. Sorge l'esigenza di un controllo costante della qualità dell'aria, processo che avviene utilizzando delle centraline di monitoraggio fisse sparse nelle vie delle maggiori città o nei pressi dei principali insediamenti industriali. Lo scopo di questo progetto è quello di realizzare una stazione di monitoraggio mobile al fine di aumentare la superficie di controllo, realizzando un oggetto dinamico capace di acquisire dati sull'inquinamento. Questo è stato fatto applicando ad un drone un sistema di sensori capaci di rilevare le variazioni dei livelli di concentrazione degli agenti inquinanti. Ciò permette di eliminare le stazioni di monitoraggio fisse, le quali rappresentano una spesa ingente. Inoltre, attraverso l'utilizzo di un drone, è possibile monitorare siti più vasti, permettendo un monitoraggio costante e ripetuto nel tempo. La prima parte dell'elaborato analizza il sistema Embedded utilizzato per l'acquisizione dei dati, concentrando l'attenzione prevalentemente sui moduli utilizzati. La seconda descrive quali sono i primi passi per cominciare ad utilizzare i sensori posti sulla Gases Board 2.0 e risponde ai dubbi più comuni su quali parametri di configurazione adottare per un avere una risposta adeguata, quale processo di calibrazione seguire o come trasformare i dati acquisiti, espressi in tensioni, in valori di concentrazione di gas. La terza parte illustra i test effettuati per verificare il corretto funzionamento del sistema completo, con l’esposizione delle problematiche individuate, e una presentazione delle alternative più valide per superarle.

Progettazione di Data Warehouse di dati genomici su piattaforma Hadoop

Negli ultimi anni la biologia ha fatto ricorso in misura sempre maggiore all’informatica per affrontare analisi complesse che prevedono l’utilizzo di grandi quantità di dati. Fra le scienze biologiche che prevedono l’elaborazione di una mole di dati notevole c’è la genomica, una branca della biologia molecolare che si occupa dello studio di struttura, contenuto, funzione ed evoluzione del genoma degli organismi viventi. I sistemi di data warehouse sono una tecnologia informatica che ben si adatta a supportare determinati tipi di analisi in ambito genomico perché consentono di effettuare analisi esplorative e dinamiche, analisi che si rivelano utili quando si vogliono ricavare informazioni di sintesi a partire da una grande quantità di dati e quando si vogliono esplorare prospettive e livelli di dettaglio diversi. Il lavoro di tesi si colloca all’interno di un progetto più ampio riguardante la progettazione di un data warehouse in ambito genomico. Le analisi effettuate hanno portato alla scoperta di dipendenze funzionali e di conseguenza alla definizione di una gerarchia nei dati. Attraverso l’inserimento di tale gerarchia in un modello multidimensionale relativo ai dati genomici sarà possibile ampliare il raggio delle analisi da poter eseguire sul data warehouse introducendo un contenuto informativo ulteriore riguardante le caratteristiche dei pazienti. I passi effettuati in questo lavoro di tesi sono stati prima di tutto il caricamento e filtraggio dei dati. Il fulcro del lavoro di tesi è stata l’implementazione di un algoritmo per la scoperta di dipendenze funzionali con lo scopo di ricavare dai dati una gerarchia. Nell’ultima fase del lavoro di tesi si è inserita la gerarchia ricavata all’interno di un modello multidimensionale preesistente. L’intero lavoro di tesi è stato svolto attraverso l’utilizzo di Apache Spark e Apache Hadoop.

Verifica di un rilevatore preliminare di collisioni tra oggetti orbitanti utilizzando Two Line Elements

Lo scopo principale di questo elaborato di tesi è stato lo sviluppo del rilevatore di collisioni descritto nell’articolo di Alfano "Sulla selezione dei parametri dei filtri per la congiunzione satellitare" in ambiente Matlab. Questo andrà a far parte di un simulatore complessivo, elaborato nella tesi di laurea di Boccolari Elisa. Nel simulatore presentato si vanno ad identificare possibili collisioni di satelliti utilizzando tre tipi di ricerche diverse. Uno di questi è proprio il rilevatore descritto, in particolare si tratta del ramo di ricerca “1 vs tutti”. Alfano et al. descrive un rilevatore costituito da tre filtri in cascata. Il loro scopo è quello di identificare rapidamente coppie di satelliti (da un catalogo di oggetti orbitanti nel formato TLE) che non sono abbastanza vicini in un periodo di tempo stabilito, da poter essere considerati un pericolo, e che non vengono considerate per ulteriori computazioni. Il presente documento parte descrivendo gli strumenti matematici ed i formati dei dati utilizzati nel lavoro, passando poi a descrivere lo sviluppo del codice stesso con i filtri, fino al test del rilevatore completo. Le conclusioni sintetizzano infine i risultati raggiunti.

Progetto preliminare di una camera a vuoto per il test di propulsori al plasma

L'obiettivo della seguente tesi è realizzare il progetto preliminare di una camera a vuoto adatta al test di propulsori elettrici in generale. Di seguito, vengono analizzati i principali vantaggi e svantaggi delle tecnologie maggiormente utilizzate nei sistemi per l'alto vuoto, i criteri per la scelta del tipo di architettura di pompaggio più adatta e per il dimensionamento delle pompe. La ricerca di alcuni test, presenti in letteratura, permette di avere parametri di riferimento in base al tipo e alla potenza dei thruster utilizzati. Tramite l'analisi strutturale di una camera sottoposta a pressione esterna è possibile ricavare dimensioni e spessore delle pareti; viene, poi, realizzato un disegno CAD della camera e verificato il dimensionamento strutturale, simulando il carico di pressione esterna, tramite un'analisi FEM-FEA utilizzando il software Solidworks. Infine, vengono elencate le caratteristiche finali della camera a vuoto e, tramite lo studio di modelli matematici che permettono di studiare e quantificare i principali fattori di perdita (outgassing, infiltrazione, throughput del thruster ecc.), si ricava la curva della pressione rispetto al tempo del sistema completo.