Studio della diversa espressione di proteine del siero nelle anguille (Anguilla anguilla) gialle ed argentine mediante analisi proteomica

L’anguilla europea (Anguilla anguilla) è una specie eurialina catadroma, la cui area di riproduzione si trova a grande distanza dall’areale di distribuzione. Presenta un ciclo biologico piuttosto complesso caratterizzato da due metamorfosi: la prima, tipicamente larvale permette al “leptocefalo”, forma larvale marina tipica degli anguilliformi, di trasformarsi in anguilla “ceca”; la seconda, invece, trasforma l’anguilla “gialla” in “argentina” attraverso un processo definito di “argentinizzazione” nel quale si delineano preadattamenti alla maturazione sessuale che sarà completa durante la migrazione riproduttiva verso il Mar dei Sargassi. L’”argentinizzazione” innesca modificazioni fisiologiche (regressione del tratto digestivo), e morfologiche (aumento della massa corporea, ispessimento della pelle, modificazione dell’occhio e nuova pigmentazione). Il colore bruno verdastro con ventre giallo è prerogativa delle anguille in fase trofica, cioè quelle gialle, sessualmente immature. Quelle argentine presentano, invece, una colorazione più scura sul dorso e argenteo sul ventre. Inoltre le anguille argentine vanno incontro a cambiamenti ormonali per adattarsi all’ambiente marino, compiere la lunga migrazione e riprodursi. Per avere a disposizione risorse energetiche anche senza nutrirsi per molti mesi, devono accumulare grandi riserve di cui il 60% è destinato per lo sviluppo delle gonadi. Tuttavia i processi metabolici che consentono alle anguille argentine di effettuare lunghe migrazioni mantenendo un’alta efficienza del nuoto e nel contempo utilizzando limitate risorse, non sono sufficientemente conosciuti. Per fornire nuove informazioni, questo lavoro di tesi ha indagato se vi sia una modificazione del quadro proteico del siero delle anguille argentine rispetto alle gialle, e quali proteine eventualmente risultino sovra- o sotto- espresse in ciascuna delle due fasi del ciclo biologico. A tale fine si è applicata una tecnica innovativa, quale l’analisi proteomica, che permette di identificare in modo sistematico le proteine all’interno di un substrato biologico come iin questo caso il siero. Le anguille gialle ed argentine prese in esame sono state prelevate nelle Valli di Comacchio (FE). La valutazione quantitativa delle proteine, separate tramite elettroforesi bidimensionale su gel di poliacrilamide, si è fondata sull’analisi delle immagini attraverso specifici programmi (Proteomweaver). A tale proposito, si sono confrontati i gel di anguilla gialla ed argentina individuando gli spot corrispondenti alle proteine e quantificandoli. Gli spot differenzialmente espressi sono stati prelevati per essere poi identificati tramite spettrometria di massa (MS/MS), arrivando al riconoscimento di diverse proteine. Tra queste, sono state identificate due diverse isoforme di apolipoproteina, l’una più espressa nell’anguilla gialla, l’altra nell’argentina; tali proteine svolgono un ruolo importante nella facilitazione del trasporto lipidico e nell’assorbimento dei lipidi associato anche con la crescita degli ovociti. Il treno di spot relativo alla transferrina è decisamente più evidente nelle anguille argentine, il che potrebbe essere correlato al ruolo del ferro nell’emoglobina, mirato ad un maggiore apporto di ossigeno ai tessuti durante la lunga migrazione riproduttiva di questi animali. Lo studio è del tutto nuovo e al momento non sono disponibili sufficienti informazioni al contorno per trarre più ampie conclusioni; tuttavia esso merita di essere proseguito per contribuire alla comprensione degli eventi di metamorfosi in questa specie dal ciclo vitale complesso e in gran parte sconosciuto.

La spettroscopia di forza basata sull'AFM nello studio dello spazio conformazionale e dei processi aggregativi di proteine prioniche

Le malattie neurodegenerative sono caratterizzate da aggregazione proteica, dipendente dalla perdita della usuale struttura fisiologica funzionale delle proteine coinvolte, a favore di conformazioni tossiche (patologiche). Il modello corrente descrive questi cambiamenti conformazionali come eventi rari e ritiene che non esista una sola conformazione patogena, ma che tali possibili conformazioni siano piuttosto eterogenee. La caratterizzazione di queste strutture è, di conseguenza, difficile con le tradizionali tecniche in bulk che permettono di studiare solo la conformazione media e non rendono possibile il riconoscimento delle caratteristiche dei conformeri individuali. Lo sviluppo delle tecniche di singola molecola ha permesso di studiare in modo approfondito le conformazioni possibili. In questo lavoro la spettroscopia di forza di singola molecola basata sull'AFM viene applicata a PrP (proteina responsabile delle encefalopatie spongiformi trasmissibili). Si studiano gli equilibri conformazionali del monomero e quelli di costrutti oligomerici, allo scopo di caratterizzare gli step iniziali dei processi aggregativi. Nel corso di questo lavoro di tesi è stato, in particolare, sviluppato un sistema di analisi dati, al fine di studiare in modo quantitativo le distribuzioni di eventi ottenute. Grazie a tale strumento è stato possibile riconoscere i segnali di unfolding della conformazione nativa del monomero e notare come essa sia presente anche in costrutti oligomerici, ad indicare come questo ripiegamento sia stabile anche in presenza di più monomeri ravvicinati. Si è osservato l'effetto del pH sulla stabilità di tale struttura, notando come pH acidi destabilizzino il ripiegamento nativo. Inoltre si è studiato il ruolo dell'orientazione dei monomeri nella formazione di strutture dimeriche. Monomeri e oligomeri di PrP sono stati descritti come proteine parzialmente strutturate il cui panorama energetico contiene molti minimi locali, dando origine a parecchie conformazioni transienti.

Effetto dell'erbicida Terbutilazina sulla crescita di flagellate marine in coltura

Il fitoplancton è costituito da organismi molto importanti per l'ambiente marino e molto diversificati sia dal punto di vista morfologico che fisiologico.Questi organismi sono normalmente soggetti ai cambiamenti stagionali e alle variazioni dell'ambiente dovute sia a fenomeni naturali che all'impatto antropico, sempre più rilevante. Con questa tesi si è voluto approfondire l'effetto di erbicidi comunemente usati dall'uomo in agricoltura su delle microalghe flagellate rappresentative del Mar Adriatico. L'inquinante scelto è la Terbutilazina, sostanza utilizzata per il diserbo del mais e diffusa in tutta l'area padano-venera, come dimostrano i dati dei campionamenti ARPA, che riportano la presenza di Terbutilazina e del suo prodotto di degradazione Desetil-Terbutilazina a concentrazioni superiori al limite fissato sia nelle acque superficiali che in quelle sotterranee. Anche in mare come riportato in letteratura (Carafa et. al 2009)è stato riscontrato a concentrazioni superiori al limite previsto dalla normativa vigente in Italia. In particolare il meccanismo d'azione di questo erbicida interferisce con la fotosintesi, agendo sulle proteine di membrana dei cloroplasti, rimpiazzando il chinone accettore di elettroni QB della proteina D1 del fotosistema II. Più specie di microalghe fatte crescere in colture 'batch' sono state testate a diverse concentrazioni di erbicida in condizione di luce nutrienti costanti. Questi esperimenti sono stati inoltre condotti a due diverse temperature (20 e 25°C) per studiare l'effetto di questo inquinante in correlazione con l'attuale aumento di temperatura in atto nel pianeta. In una prima fase di screening è stato valutato l'effetto della Terbutilazina su 9 specie di flagellate rappresentative dell'Adriatico, tramite misure dell'efficienza fotosintetica. Grazie a questa prima fase sono state individuate le microalghe e le relative concentrazioni di Terbutilazina da utilizzare negli esperimenti. Per gli esperimenti, sono state scelte le due specie algali Gonyaulax spinifera e Prorocentrum minimum sulle quali si è approfondito lo studio dell'effetto dell'inquinante alle due temperature, attraverso una serie di analisi volte ad individuare le risposte in termini di crescita e di fisiologia delle alghe quali: conteggio delle cellule, torbidità, efficienza fotosintetica, consumo di nutrienti, quantità di clorofilla e di polisaccaridi extracellulari prodotti. La scelta di queste microalghe è stata dettata dal fatto che Gonyaulax spinifera si è rivelata la microalga più sensibile a concentrazioni di erbicida più vicine a quelle ambientali fra tutte le alghe valutate, mentre Prorocentrum minimum è fra le dinoflagellate più frequenti e rappresentative del Mar Adriatico (Aubry et al. 2004), anche se non particolarmente sensibile; infatti P. minimum è stato testato ad una concentrazione di erbicida maggiore rispetto a quelle normalmente ritrovate in ambiente marino. Dai risultati riportati nella tesi si è visto come l'erbicida Terbutilazina sia in grado di influenzare la crescita e la fotosintesi di microalghe flagellate dell'Adriatico anche a concentrazioni pari a quelle rilevate in ambiente, e si è evidenziato che gli effetti sono maggiori alle temperature in cui le microalghe hanno una crescita meno efficiente. Questi studi hanno messo in evidenza anche l'utilità delle misure di fotosintesi tramite fluorimetro PAM nel valutare le risposte delle microalghe agli erbicidi triazinici. Inoltre la diversa risposta delle microalghe osservata, potrebbe avere conseguenze rilevanti sulle fioriture estive di fitoplancton in caso di presenza in mare di Terbutilazina, anche a concentrazioni non particolarmente elevate. Questo lavoro si inserisce in un contesto più ampio di ricerca volto alla modellizzazione della crescita algale in presenza di inquinanti ed in concomitanza con le variazioni di temperatura. Infatti i dati ottenuti insieme a misure di carbonio cellulare, non ancora effettuate, saranno utili per la messa a punto di nuove parametrizzazioni che si avvicinino maggiormente ai dati reali, per poi simulare i possibili scenari futuri variando le condizioni ambientali e le concentrazioni dell'inquinante studiato.

Effetto dei modulatori del sistema serotoninergico sulla trasduzione del segnale AMPc-dipendente nel mitilo

Lo sviluppo della medicina ha determinato un utilizzo sempre crescente di sostanze farmacologiche, le quali una volta escrete dagli organismi raggiungono le acque dei fiumi e dei laghi, per arrivare poi all’ambiente marino costiero, che ne risulta sempre maggiormente contaminato. Negli organismi non bersaglio esposti ai residui dei farmaci in ambiente, queste sostanze potrebbero indurre effetti simili a quelli specifici nel caso i bersagli molecolari siano stati conservati durante l’evoluzione, oppure avere effetti inattesi se i bersagli molecolari sono conservati ma hanno una differente funzione. Questo lavoro di tesi è volto a studiare i potenziali effetti indotti dalla fluoxetina (FX, farmaco antidepressivo inibitore dell’uptake della serotonina), e dal propranololo (PROP, farmaco bloccante sia dei recettori β-adrenergici che serotoninergici nell’uomo) nei mitili Mytilus galloprovincialis, esposti a tali sostanze, valutandone l’interazione con i meccanismi di trasduzione del segnale AMPc-dipendente. Sono stati valutati in particolare i livelli di AMPc e l’attività dell’enzima PKA, inoltre si è studiato se i farmaci influiscano con i meccanismi di regolazione del gene ABCB1, che codifica per la P-glicoproteina (Pgp), che ha il compito di estrudere all’esterno della cellula gli xenobiotici che vi sono entrati. Gli studi sono stati condotti dopo esposizione dei mitili in vivo ai due farmaci ed alla loro miscela per 7 giorni in acquario. I risultati hanno indicato che la FX causa una diminuzione statisticamente significativa dei livelli di AMPc, dell’attività della PKA e anche dell’espressione del gene ABCB1 rispetto al controllo, sia nel mantello che nella ghiandola digestiva. Nella ghiandola digestiva il PROP provoca una significativa riduzione dei livelli di AMPc, dell’attività della PKA e dell’espressione del gene ABCB1 rispetto ai valori di controllo. Nel mantello, invece, il PROP aumenta i livelli di AMPc e l’espressione del gene ABCB1, anche se non ha effetti significativi sull’attività della PKA. Per caratterizzare i recettori per la serotonina (5HT), e il possibile ruolo di antagonista giocato dal PROP, abbiamo inoltre trattato in vitro emociti di mitilo con la 5HT l’agonista fisiologico del recettore, usata da sola ed in presenza del PROP. I dati ottenuti dimostrano che negli emociti di mitilo sono espressi recettori 5HT1 accoppiati a proteine G inibitrici, e che il PROP blocca l’effetto della 5HT, agendo come antagonista dei recettori 5HT1. Nell’insieme i dati dimostrano che i farmaci possono avere effetti sugli organismi acquatici anche a concentrazioni molto basse come quelle ambientali. I dati della tesi non dimostrano che PROP e FX hanno effetti deleteri sulle popolazioni o le comunità dei molluschi, ma debbono essere considerati come indicatori della vulnerabilità degli animali a questi composti. Si è dimostrato per la prima volta che gli emociti di mitilo possiedono recettori di tipo 5HT1 correlati alla riduzione dei livelli intracellulari di AMPc, e soprattutto che il sistema AMPc/PKA è deputato alla regolazione dell’espressione dei geni ABCB1 codificanti per proteine del complesso Multi Xenobiotic Resistance.

Caratterizzazione dei parametri fisiologici di microalghe utilizzabili nei processi di fitodepurazione

La depurazione è un processo finalizzato a ridurre in modo significativo le sostanze inquinanti presenti nelle acque reflue prima del loro rilascio in ambiente. L’uso delle alghe in impianti di depurazione di acque reflue prende il nome di ficorimedio e potrebbe rappresentare un’alternativa o una integrazione alla depurazione tradizionale dei reflui per il fatto che le alghe operano la rimozione di nutrienti e metalli pesanti dalle acque e al tempo stesso possono fornire biomassa utilizzabile come nuova fonte di energia. Lo scopo principale di questo lavoro è stato di saggiare la capacità depurativa di microalghe idonee per la depurazione dei reflui, questo è stato fatto tramite due esperimenti. Il primo esperimento è stato realizzato in modo tale da simulare un sistema continuo di crescita di Scenedesmus sp. andando a ricreare le stesse condizioni di un sistema all’aperto come negli open ponds, in particolare prelevando periodicamente una parte di biomassa e sostituendola con terreno nuovo. Sono state applicate tre diverse condizioni per analizzare quale metodo permetteva di ottenere maggiori valori di produttività di biomassa e per valutare come questa si diversifica nel tempo nella sua componente biochimica, inoltre si è valutata anche la componente fisiologica, attraverso la misura dell’efficienza fotosintetica. Nel successivo esperimento è stata utilizzata una popolazione algale naturale, proveniente dalla vasca di sedimentazione terziaria del depuratore di Ravenna, e fatta crescere nell’effluente primario. L’esperimento era volto a comprendere i processi di successione delle microalghe in un sistema aperto attraverso uno studio della composizione delle specie nel tempo e a confrontare la crescita e l’efficienza di fitodepurazione della popolazione mista con quelle di Scenedesmus sp. Nelle colture di Scenedesmus sp. in semicontinuo si è visto che il tempo di residenza idraulica minore determina una concentrazione di biomassa inferiore a quella che si ottiene nelle colture con tempi di residenza idraulica maggiori. La produttività dei polisaccaridi (g/L/day) risulta più elevata all’aumentare dei tempi di residenza idraulica, mentre per le proteine l’andamento è inverso. I valori di efficienza fotosintetica evidenziano fenomeni di fotoinibizione nella coltura con minor tempo di residenza idraulica senza che vi sia un danno dell’apparato fotosintetico. L’esperimento basato sulla crescita di una popolazione naturale in coltura batch ha mostrato che la velocità di crescita e la densità di biomassa raggiunta sono di poco inferiori a quelle della monocoltura di Scenedesmus sp. La popolazione è in grado di rimuovere i nutrienti presenti nell’effluente primario dopo 7 giorni, in un tempo maggiore rispetto a quello impiegato da Scenedesmus sp. Questo esperimento ha evidenziato che, sebbene Scenedesmus sp. fosse presente in scarsa quantità all’inizio dell’esperimento, la sua concentrazione aumenta nel tempo dimostrando così di essere maggiormente competitiva rispetto alle altre microalghe presenti nella coltura e di resistere a grazers e patogeni. I risultati ottenuti in questo studio sono importanti per la conduzione di esperimenti di ficodepurazione su scala più ampia e ha permesso di comprendere come la biomassa algale si caratterizza nel tempo andando a simulare le condizioni di crescita in un sistema continuo.

Interfaccia grafica per l'elaborazione di immagini microscopiche di colture batteriche geneticamente modificate

Le moderne tecniche di imaging e i recenti sviluppi nel campo della visione computazionale consentono sempre più diffusamente l'utilizzo di metodi di image analysis, specialmente in ambito medico e biologico, permettendo un maggiore supporto sia alla diagnosi, sia alla ricerca. Il lavoro svolto in questa tesi si pone in un contesto di ricerca di carattere interdisciplinare, e riguarda il progetto e la realizzazione di un‘interfaccia grafica per l'analisi di colture batteriche geneticamente modificate, marcate con proteine fluorescenti (GFP), acquisite tramite un microscopio ad epifluorescenza. Nota la funzione di risposta del sistema di acquisizione delle immagini, l'analisi quantitativa delle colture batteriche è effettuata mediante la misurazione di proprietà legate all'intensità della risposta al marcatore fluorescente. L'interfaccia consente un'analisi sia globale dei batteri individuati nell'immagine, sia di singoli gruppi di batteri selezionati dall'utente, fornendo utili informazioni statistiche, sia in forma grafica che numerica. Per la realizzazione dell'interfaccia sono state adottate tecniche di ingegneria del software, con particolare enfasi alla interazione uomo-macchina e seguendo criteri di usability, al fine di consentire un corretto utilizzo dello strumento anche da parte di personale senza conoscenza in campo informatico.