Development of a polyplexes-based miRNA delivery system in a 3D-bioplotted osteoarthritis cellular model.

L'osteoartrite (OA) è una patologia infiammatorio/degenerativa ossea per la quale non sono disponibili terapie causali efficaci ma solo approcci palliativi per la riduzione del dolore cronico. E’ quindi giustificato un investimento per individuare nuove strategie di trattamento. In quest’ottica, lo scopo di questa tesi è stato quello di indagare l’efficacia di polyplexi a base di chitosano o di PEI-g-PEG in un modello cellulare 3D in vitro basato su un hydrogel di Gellan Gum Metacrilato (GGMA) con a bordo condrociti in condizioni simulate di OA. Inizialmente sono state studiate la dimensione e il potenziale-Z di un pool di formulazioni di poliplexi. Quindi se ne è valutata la citocompatibilità utilizzando cellule staminali mesenchimali immortalizzate Y201. Infine, una miscela di GGMA, cellule e polyplexi è stata utilizzata per la stampa 3D di campioni che sono stati coltivati fino a 14 giorni. La condizione OA è stata simulata trattando le cellule con una miscela di citochine implicate nello sviluppo della malattia. Tutte le formulazioni a base di chitosano e due basate su PEI-g-PEG si sono dimostrate citocompatibili e sono hanno veicolato i miRNA nelle cellule (come mostrato dai risultati di analisi in fluorescenza). I risultati delle colorazioni H&E e AlcianBlue hanno confermato che il terreno condizionato ha ben ricreato le condizioni di OA. I polyplexi a base di chitosano e PEI-g-PEG hanno controbilanciato gli effetti delle citochine. Risultati incoraggianti, anche se da approfondire ulteriormente, provengono anche dall’analisi di espressione (RT-PCR) di cinque geni specifici della cartilagine. Concludendo, questo modello ha ben riprodotto le condizioni di OA in vitro; il chitosano ha mostrato di essere un adeguato veicolo per un trattamento a base di miRNA; il PEI-g-PEG si propone come un'alternativa più economica e ragionevolmente affidabile, sebbene il rischio di citotossicità alle concentrazioni più elevate richieda una più esteva validazione sperimentale.

Functional dna nanostructures for in vitro biosensing in live cells

DNA is a fascinating biomolecule that is well known for its genetic role in living systems. The emerging area of DNA nanotechnology provides an alternative view that exploits unparallel self-assembly ability of DNA molecules for material use of DNA. Although many reports exist on the results of DNA self-assembling systems, still few of them focus on the in vitro study about the function of such DNA nanostructures in live cells. Due to this, there are still a limited research about the in vitro functionality of such designs. To address an aspect of this issue, we have designed, synthesized and characterized two multifunctional fluorescencent nanobiosensors by DNA self-assembling. Each structure was designed and implemented to be introduced in live cells in order to give information on their functioning in real-time. Computational tools were used in order to design a graphic model of two new DNA motifs and also to obtain the specific sequences to all the ssDNA molecules. By thermal self-assembly techniques we have successfully synthesized the structure and corroborate their formation by the PAGE technique. In addition, we have established the conditions to characterize their structural conformation change when they perform their sensor response. The sensing behavior was also accomplished by fluorescence spectroscopy techniques; FRET evaluation and fluorescence microscopy imaging. Providing the evidence about their adequate sensing performance outside and inside the cells detected in real-time. In a preliminary evaluation we have tried to show the in vitro functionality of our structures in different cancer cell lines with the ability to perform local sensing responses. Our findings suggest that DNA sensor nanostructures could serve as a platform to exploit further therapeutic achievements in live cells.

Valutazione sperimentale in-vitro di nuove superfici protesiche per la sostituzione totale di caviglia derivanti da un innovativo approccio morfologico

La sostituzione totale di caviglia o artroplastica totale di caviglia (Total Ankle Replacement - TAR) è un'operazione eseguita per sostituire le superfici di contatto delle ossa di tibia e astragalo mediante componenti protesiche e sta diventando una comune procedura chirurgica per il trattamento dell’ultimo stadio di osteoartrite di caviglia. La morfologia articolare della caviglia e la relativa cinematica sono molto complesse. Gli attuali dispositivi per TAR soffrono ancora di alti tassi di insoddisfazione e fallimento, probabilmente a causa dei relativi disegni protesici non pienamente rispettosi della normale morfologia di caviglia e del normale trasferimento dei carichi articolari. Recentemente, è stato proposto un nuovo disegno basato su un originale postulato che approssima la superficie articolare talare in modo maggiormente fisiologico, come un tronco di cono a sella con apice diretto lateralmente. L'obiettivo di questa tesi di laurea è di valutare sperimentalmente, mediante il supporto del navigatore chirurgico, il comportamento cinematico derivante dall’impianto del dispositivo TAR basato sul nuovo postulato e di confrontarlo con la cinematica derivante dalla caviglia intatta e derivante da modelli protesici basati sui disegni più comunemente utilizzati. Dieci arti inferiori da cadavere con caviglie intatte e normali, sono state scansionati via CT. Le immagini di caviglia sono state poi segmentate per la produzione dei modelli virtuali articolari. Questi sono stati prodotti sia basandosi sul nuovo postulato sia su quelli standard, e successivamente stampati in materiale plastico via 3D-printing. I risultati ottenuti a seguito di elaborazioni confermano che il nuovo dispositivo sembra riprodurre meglio rispetto agli altri, il fisiologico comportamento funzionale della caviglia, presentando valori prossimi a quelli della caviglia naturale.