Analisi quantitativa dell'espressione genica mediante real-time rt-pcr.

Il primo capitolo di questo lavoro di tesi introduce i concetti di biologia necessari per comprendere il fenomeno dell’espressione genica. Il secondo capitolo descrive i metodi e le tecniche di laboratorio utilizzate per ottenere il cDNA, il materiale genetico che verrà amplificato nella real-time PCR. Nel terzo capitolo si descrive la tecnica di real-time PCR, partendo da una descrizione della PCR convenzionale fino a delineare le caratteristiche della sua evoluzione in real-time PCR. Si prosegue con la spiegazione del principio fisico alla base della tecnica e delle molecole necessarie (fluorofori e sonde) per realizzarla; infine si descrive l’hardware e il software dello strumento. Il quarto capitolo presenta le tecniche di analisi del segnale che utilizzano metodi di quantificazione assoluta o relativa. Infine nel quinto capitolo è presentato un caso di studio, cioè un’analisi di espressione genica con real-time PCR condotta durante l’esperienza di tirocinio presso il laboratorio ICM. e delle molecole necessarie (fluorofori e sonde) per realizzarla; infine si descrive l’hardware e il software dello strumento. Il quarto capitolo presenta le tecniche di analisi del segnale che utilizzano metodi di quantificazione assoluta o relativa. Infine nel quinto capitolo è presentato un caso di studio, cioè un’analisi di espressione genica con real-time PCR condotta durante l’esperienza di tirocinio presso il laboratorio ICM.

Oli extra vergini di oliva prodotti da varieta autoctone dell'areale di Brisighella: Profilo sensoriale e relazioni con la frazione fenolica

Il progetto sperimentale è stato focalizzato alla valutazione qualitativa di oli extra vergini di oliva monovarietali (Nostrana di Brisighella, Ghiacciola, Don Carlo), prodotti da olive coltivate nell’areale Brisighellese analizzandoli sia per alcuni parametri chimici che per alcune caratteristiche sensoriali rilevabili in fase gustativa (attributi di amaro e piccante). Per ogni campione sono stati valutati i parametri di qualità stabiliti dal Reg. CEE n. 2568/91 e successive modifiche: acidità libera, numero di perossidi, estinzioni specifiche nell’ultravioletto, composizione in acidi grassi ed analisi sensoriale secondo il metodo del “Panel test”. Gli oli sono stati anche sottoposti alla caratterizzazione della frazione biofenolica mediante estrazione secondo metodo COI (COI/T.20/Doc. n.29) seguita da separazione cromatografica HPLC ed identificazione guidata sia da rivelatore a fotodiodi (DAD) che da spettrometro di massa (MSD). I dati ottenuti sono stati elaborati con l’ausilio di tecniche di analisi multivariata (PCA) valutando sia le correlazioni esistenti tra le variabili, che la possibilità di discriminare i campioni in gruppi omogenei per caratteristiche chimiche e/o sensoriali. Più specificatamente, si è rivolta l'attenzione alle relazioni esistenti tra la concentrazione in singole molecole a struttura fenolica e l'intensità degli attributi sensoriali positivi, amaro e piccante. In ultima analisi, si è proceduto a determinare il contenuto totale in derivati fenolici dell’idrossitirosolo e tirosolo (semplici e complessi) presenti in 20 g di olio per verificare la conformità al claim salutistico approvato dall'EFSA nel 2011 “i polifenoli dell’olio di oliva contribuiscono alla protezione dei lipidi ematici dallo stress ossidativo”, che è possibile inserire in etichetta qualora il prodotto soddisfi il limite richiesto dal Reg. UE 432/2012.

Engineering the synthesis of lantibiotics in e. Coli by combining the cynnamicin and nisin modification systems.

I lantibiotici sono molecole peptidiche prodotte da un gran numero di batteri Gram-positivi, posseggono attività antibatterica contro un ampio spettro di germi, e rappresentano una potenziale soluzione alla crescente problematica dei patogeni multi-resistenti. La loro attività consiste nel legame alla membrana del bersaglio, che viene quindi destabilizzata mediante l’induzione di pori che determinano la morte del patogeno. Tipicamente i lantibiotici sono formati da un “leader-peptide” e da un “core-peptide”. Il primo è necessario per il riconoscimento della molecola da parte di enzimi che effettuano modifiche post-traduzionali del secondo - che sarà la regione con attività battericida una volta scissa dal “leader-peptide”. Le modifiche post-traduzionali anticipate determinano il contenuto di amminoacidi lantionina (Lan) e metil-lantionina (MeLan), caratterizzati dalla presenza di ponti-tioetere che conferiscono maggior resistenza contro le proteasi, e permettono di aggirare la principale limitazione all’uso dei peptidi in ambito terapeutico. La nisina è il lantibiotico più studiato e caratterizzato, prodotto dal batterio L. lactis che è stato utilizzato per oltre venti anni nell’industria alimentare. La nisina è un peptide lungo 34 amminoacidi, che contiene anelli di lantionina e metil-lantionina, introdotti dall’azione degli enzimi nisB e nisC, mentre il taglio del “leader-peptide” è svolto dall’enzima nisP. Questo elaborato affronta l’ingegnerizzazione della sintesi e della modifica di lantibiotici nel batterio E.coli. In particolare si affronta l’implementazione dell’espressione eterologa in E.coli del lantibiotico cinnamicina, prodotto in natura dal batterio Streptomyces cinnamoneus. Questo particolare lantibiotico, lungo diciannove amminoacidi dopo il taglio del leader, subisce modifiche da parte dell’enzima CinM, responsabile dell’introduzione degli aminoacidi Lan e MeLan, dell’enzima CinX responsabile dell’idrossilazione dell’acido aspartico (Asp), e infine dell’enzima cinorf7 deputato all’introduzione del ponte di lisinoalanina (Lal). Una volta confermata l’attività della cinnamicina e di conseguenza quella dell’enzima CinM, si è deciso di tentare la modifica della nisina da parte di CinM. A tal proposito è stato necessario progettare un gene sintetico che codifica nisina con un leader chimerico, formato cioè dalla fusione del leader della cinnamicina e del leader della nisina. Il prodotto finale, dopo il taglio del leader da parte di nisP, è una nisina completamente modificata. Questo risultato ne permette però la modifica utilizzando un solo enzima invece di due, riducendo il carico metabolico sul batterio che la produce, e inoltre apre la strada all’utilizzo di CinM per la modifica di altri lantibiotici seguendo lo stesso approccio, nonché all’introduzione del ponte di lisinoalanina, in quanto l’enzima cinorf7 necessita della presenza di CinM per svolgere la sua funzione.

Studio della struttura locale di droganti in quantum dots mediante spettroscopia di assorbimento di raggi X

La capacità della spettroscopia di assorbimento di riuscire a determinare la struttura locale di campioni di ogni tipo e concentrazione, dagli elementi puri ai più moderni materiali nanostrutturati, rende lo studio dei meccanismi di incorporazione di droganti in matrici di semiconduttori il campo che meglio ne esprime tutto il potenziale. Inoltre la possibilità di ottenere informazioni sulla struttura locale di un particolare elemento in traccia posto in sistemi senza ordine a lungo raggio risulta, ovviamente, nello studio dei semiconduttori di grandissimo interesse. Tuttavia, la complessità di determinate strutture, generate dalla incorporazione di elementi eterovalenti che ne modificano la simmetria, può far si che all’analisi sperimentale si debbano affiancare dei metodi avanzati ab-initio. Questi approcci garantiscono, attraverso la simulazione o di strutture atomiche o dello stesso spettro XAS, di ottenere una più completa e precisa interpretazione dei dati sperimentali. Nella fase preliminare di questo elaborato si illustrerà la fenomenologia della spettroscopia di assorbimento e i fondamenti teorici che stanno alla base dell’analisi della struttura fine di soglia. Si introdurranno contemporaneamente le tecniche sperimentali con cui si realizzano le misure di spettri di assorbimento su una beamline che sfrutta sorgente di radiazione di sincrotrone facendo riferimento agli strumenti montati sulla linea LISA (o BM08) presso l’European Synchrotron Radiation Facility di Grenoble su cui si sono realizzati gli esperimenti di questo lavoro. Successivamente si realizzerà una rassegna di alcuni esperimenti simbolo della analisi della struttura locale di droganti in semiconduttori mediante XAFS, andando ad approfondire i metodi sperimentali associati. Nella parte principale della tesi verranno descritti alcuni tipi di analisi avanzate effettuate su Colloidal Quantum Dots a base di solfuro di piombo drogati con antimonio. Tali sistemi, particolarmente interessanti per potenziali applicazioni in campo optoelettrico, sono stati analizzati mediante misure di fluorescenza ottenute sulla beamline LISA. La fase di analisi ha visto la progettazione di una suite di programmi in C++ per realizzare simulazioni di uno spettro XAS teorico completo basato su strutture ottenute (anche esse) da metodi ab-initio.

Studio di celle fotovoltaiche di terza generazione: celle tandem

Il fotovoltaico (FV) costituisce il modo più diretto di conversione dell’energia solare in energia elettrica e si basa sull’effetto osservato da Becquerel nel 1839. Si può affermare che tale effetto è rimasto una curiosità di laboratorio dalla metà del XIX secolo fino al 1954, quando la prima cella solare in silicio con un’efficienza di conversione del 6% fu costruita ai Laboratori Bell. Da allora la ricerca in questo settore ha sperimentato una crescita costante ed oggi si può contare su tecnologie mature, in grado di sviluppare alte prestazioni in via di ulteriore miglioramento. Le celle tandem costituiscono ora il migliore esempio di dispositivi fotovoltaici in grado di convertire buona parte della potenza irraggiata dal sole. Aumentare l’efficienza con le celle tandem significa sfruttare le differenti lunghezze d’onda dello spettro solare. Questi dispositivi sono infatti costruiti impilando semiconduttori, disponendoli dal basso in modo crescente secondo i loro valori di energia di gap. A partire dall’analisi delle caratteristiche principali della radiazione solare e del principio di funzionamento delle celle fotovoltaiche, questo lavoro si propone di mettere in evidenza le potenzialità della tecnologia a multigiunzione, che ha già dimostrato rilevanti capacità di ottimizzazione delle prestazioni delle celle solari, facendo ben sperare per il futuro.

The effect of diffusion gradient direction number on tractography of corticospinal tract in human brain: an along-tract analysis

Nel presente lavoro di tesi ho sviluppato un metodo di analisi di dati di DW-MRI (Diffusion-Weighted Magnetic Resonance Imaging)cerebrale, tramite un algoritmo di trattografia, per la ricostruzione del tratto corticospinale, in un campione di 25 volontari sani. Il diffusion tensor imaging (DTI) sfrutta la capacità del tensore di diffusione D di misurare il processo di diffusione dell’acqua, per stimare quantitativamente l’anisotropia dei tessuti. In particolare, nella sostanza bianca cerebrale la diffusione delle molecole di acqua è direzionata preferenzialmente lungo le fibre, mentre è ostacolata perpendicolarmente ad esse. La trattografia utilizza le informazioni ottenute tramite il DW imaging per fornire una misura della connettività strutturale fra diverse regioni del cervello. Nel lavoro si è concentrata l’attenzione sul fascio corticospinale, che è coinvolto nella motricità volontaria, trasmettendo gli impulsi dalla corteccia motoria ai motoneuroni del midollo spinale. Il lavoro si è articolato in 3 fasi. Nella prima ho sviluppato il pre-processing di immagini DW acquisite con un gradiente di diffusione sia 25 che a 64 direzioni in ognuno dei 25 volontari sani. Si è messo a punto un metodo originale ed innovativo, basato su “Regions of Interest” (ROIs), ottenute attraverso la segmentazione automatizzata della sostanza grigia e ROIs definite manualmente su un template comune a tutti i soggetti in esame. Per ricostruire il fascio si è usato un algoritmo di trattografia probabilistica che stima la direzione più probabile delle fibre e, con un numero elevato di direzioni del gradiente, riesce ad individuare, se presente, più di una direzione dominante (seconda fibra). Nella seconda parte del lavoro, ciascun fascio è stato suddiviso in 100 segmenti (percentili). Sono stati stimati anisotropia frazionaria (FA), diffusività media, probabilità di connettività, volume del fascio e della seconda fibra con un’analisi quantitativa “along-tract”, per ottenere un confronto accurato dei rispettivi percentili dei fasci nei diversi soggetti. Nella terza parte dello studio è stato fatto il confronto dei dati ottenuti a 25 e 64 direzioni del gradiente ed il confronto del fascio fra entrambi i lati. Dall’analisi statistica dei dati inter-subject e intra-subject è emersa un’elevata variabilità tra soggetti, dimostrando l’importanza di parametrizzare il tratto. I risultati ottenuti confermano che il metodo di analisi trattografica del fascio cortico-spinale messo a punto è risultato affidabile e riproducibile. Inoltre, è risultato che un’acquisizione con 25 direzioni di DTI, meglio tollerata dal paziente per la minore durata dello scan, assicura risultati attendibili. La principale applicazione clinica riguarda patologie neurodegenerative con sintomi motori sia acquisite, quali sindromi parkinsoniane sia su base genetica o la valutazione di masse endocraniche, per la definizione del grado di contiguità del fascio. Infine, sono state poste le basi per la standardizzazione dell’analisi quantitativa di altri fasci di interesse in ambito clinico o di studi di ricerca fisiopatogenetica.

Novel transparent and flexible transistors for radiation harsh environment

La scoperta dei semiconduttori amorfi ha segnato l’era della microelettronica su larga scala rendendo possibile il loro impiego nelle celle solari o nei display a matrice attiva. Infatti, mentre i semiconduttori a cristalli singoli non sono consoni a questo tipo di applicazioni e i s. policristallini presentano il problema dei bordi di grano, i film amorfi possono essere creati su larga scala (>1 m^2) a basse temperature (ad es. <400 °C) ottenendo performance soddisfacenti sia su substrati rigidi che flessibili. Di recente la ricerca sta compiendo un grande sforzo per estendere l’utilizzo di questa nuova elettronica flessibile e su larga scala ad ambienti soggetti a radiazioni ionizzanti, come lo sono i detector di radiazioni o l’elettronica usata in applicazioni spaziali (satelliti). A questa ricerca volge anche la mia tesi, che si confronta con la fabbricazione e la caratterizzazione di transistor a film sottili basati su ossidi semiconduttori ad alta mobilità e lo studio della loro resistenza ai raggi X. La micro-fabbricazione, ottimizzazione e caratterizzazione dei dispositivi è stata realizzata nei laboratori CENIMAT e CEMOP dell’Università Nova di Lisbona durante quattro mesi di permanenza. Tutti i dispositivi sono stati creati con un canale n di ossido di Indio-Gallio-Zinco (IGZO). Durante questo periodo è stato realizzato un dispositivo dalle ottime performance e con interessanti caratteristiche, una delle quali è la non variazione del comportamento capacitivo in funzione della frequenza e la formidabile resistenza alle radiazioni. Questo dispositivo presenta 114 nm di dielettrico, realizzato con sette strati alternati di SiO2/ Ta2O5. L’attività di ricerca svolta al Dipartimento di Fisica e Astronomia di Bologna riguarda prevalentemente lo studio degli effetti delle radiazioni ionizzanti su TFTs. Gli esperimenti hanno rivelato che i dispositivi godono di una buona stabilità anche se soggetti alle radiazioni. Infatti hanno mostrato performance pressoché inalterate anche dopo un’esposizione a 1 kGy di dose cumulativa di raggi X mantenendo circa costanti parametri fondamentali come la mobilità, il threshold voltage e la sub-threshold slope. Inoltre gli effetti dei raggi X sui dispositivi, così come parametri fondamentali quali la mobilità, si sono rivelati essere notevolmente influenzati dallo spessore del dielettrico.

Produzione di 2-metilfurano da furfurale in fase gas con metanolo come reagente di H-transfer

La furfurale (FU) rappresenta una delle più importanti molecole piattaforma per la produzione di biocarburanti e prodotti chimici a partire dalle biomasse. L’elevato interesse che si nutre nei confronti di tale molecola è giustificato dall’ampio spettro di reazioni che possono essere condotte su di essa al fine di ottenere prodotti di interesse industriale, quali, ad esempio, il furfuril alcool (FAL) e il metilfurano (MFU). I processi attualmente utilizzati per la produzione di tali molecole usano H2 e costosi catalizzatori a base di metalli nobili. Un’alternativa interessante a questi processi è quella che prevede di utilizzare un alcool come fonte di idrogeno tramite un processo di H-transfer su catalizzatori a base di ossidi misti. Lo scopo di questa tesi è stata quindi la sintesi e lo studio delle proprietà catalitiche del sistema FeVO4, nella reazione di riduzione in fase gas della furfurale, usando metanolo come agente di H-transfer. Il catalizzatore è stato ottenuto mediante coprecipitazione dei precursori di Fe e V e successivamente calcinato. La caratterizzazione Raman e XRD ha confermato la bontà della procedura di sintesi. I risultati dei test catalitici hanno mostrato che nelle condizioni ottimali il sistema è altamente selettivo nella riduzione della FU a MFU, mentre i prodotti secondari sono 2-vinilfurano e 2,5-dimetilfurano. A causa della deposizione di specie carboniose sulla superficie del catalizzatore, la conversione della FU tende a diminuire col passare delle ore di reazione. Tuttavia il sistema risulta rigenerabile grazie ad un trattamento in aria a 450°C. Inoltre l’analisi XRD dei catalizzatori scaricati ha mostrato che l’ossido misto subisce un processo di riduzione a seguito dell’interazioni con il metanolo, in quanto la stechiometria Fe:V:O passa dal valore di 1:1:4 a valori di 1:1:3. Sulla base di questi dati il processo di produzione del MFU è stato ulteriormente ottimizzato effettuando un pretrattamento riduttivo del catalizzatore prima dei test catalitici.

Nuove procedure sintetiche sostenibili per la preparazione di strutture poliuretaniche

Questo lavoro di tesi si inserisce in un contesto di ricerca molto attuale, il quale, studia nuove procedure sintetiche sostenibili per la preparazione di strutture poliuretaniche. Partendo dall’etilene carbonato e dall’esametilendiammina, due molecole che possono essere ricavate da fonti rinnovabili, sono state ottimizzate la sintesi e la purificazione di un carbammato: bis(2-idrossietil)-esan-1,6-diildicarbammato (BHEDC), senza l’impiego di solventi ed in condizioni blande. Il BHEDC è conosciuto in letteratura, ma è poco studiato e non viene attualmente utilizzato come monomero. In questo lavoro il bis(2-idrossietil)-esan-1,6-diildicarbammato è stato polimerizzato in massa con diverse percentuali di bis(2-idrossietil)-tereftalato (BHET), il quale non è ricavabile da fonti naturali ma è ottenibile dal riciclo chimico del Poli-Etilene Tereftalato (PET). Sono state successivamente analizzate la struttura chimica e le proprietà termiche nonché spettroscopiche dei nuovi composti poliuretanici, così da poterne definire le correlazioni tra la struttura e le prestazioni finali. Infine, è stata messa a punto una procedura di tipo one-pot per la preparazione dei poliuretani sopra citati; questa prevede la sintesi diretta dei polimeri senza la necessità dello stadio di purificazione del bis(2-idrossietil)-esan-1,6-diildicarbammato.

Characterization of hydrothermal carbonization products from woodchip

L’idrotermocarbonizzazione è un processo che permette di convertire un’elevata quantità di materie prime solide in carbone. Ciò viene realizzato inserendo come sostanza in input, oltre alla materia prima iniziale, acqua liquida e, successivamente, riscaldando fino a 180°C, temperatura alla quale inizia la reazione esotermica ed il processo diventa di tipo stand-alone. Tale reazione presenta un tempo di reazione variabile nel range di 4÷12 h. I prodotti in uscita sono costituiti da una sostanza solida che ha le caratteristiche del carbone marrone naturale e un’acqua di processo, la quale è altamente inquinata da composti organici. In questo elaborato viene illustrata una caratterizzazione dei prodotti in uscita da un impianto di idrotermo carbonizzazione da laboratorio, il quale utilizza in input pezzi di legno tagliati grossolanamente. Inizialmente tale impianto da laboratorio viene descritto nel dettaglio, dopodiché la caratterizzazione viene effettuata attraverso DTA-TGA dei materiali in ingresso ed uscita; inoltre altre sostanze vengono così analizzate, al fine di confrontarle col char ed i pezzi di legno. Quindi si riporta anche un’analisi calorimetrica, avente l’obiettivo di determinare il calore di combustione del char ottenuto; attraverso questo valore e il calore di combustione dei pezzi di legno è stato possibile calcolare l’efficienza di ritenzione energetica del processo considerato, così come la densificazione energetica riscontrata nel materiale in uscita. In aggiunta, è stata eseguita un’analisi delle specie chimiche elementari sul char ed il legno in modo da determinare i seguenti parametri: fattori di ritenzione e fattori di ritenzione pesati sulla massa in termini di concentrazione di C, H, N e S. I risultati ottenuti da tale analisi hanno permesso di effettuare una caratterizzazione del char. Un tentativo di attivazione del char viene riportato, descrivendo la procedura di attivazione seguita e la metodologia utilizzata per valutare il buon esito o meno di tale tentativo di attivazione. La metodologia consiste di uno studio isotermo dell’adsorbimento di acido acetico sul char “attivato” attraverso una titolazione. I risultati sperimentali sono stati fittati usando le isoterme di Langmuir e Freundlich e confrontati con le capacità di adsorbimento del semplice char e di un campione di carbone attivo preso da un’azienda esterna. Infine si è considerata l’acqua di processo, infatti un’analisi fotometrica ne ha evidenziato le concentrazioni di TOC, COD, ioni nitrato e ioni fosfato. Questi valori sono stati conseguentemente confrontati con i limiti italiani e tedeschi massimi ammissibili per acque potabili, dando quindi un’idea quantitativa della contaminazione di tale acqua di processo.

Digeribilità e bioaccessibilità di composti bioattivi in diverse cultivar di peperoni dolci

Un discreto numero di molecole biologicamente attive contenute nei cibi vegetali si suppone esercitino un ruolo preventivo e favorevole su molteplici funzioni dell’organismo, con meccanismi d’azione spesso legati alla modulazione diretta e indiretta dello stress ossidativo. Acido ascorbico, tocoferoli, carotenoidi, polifenoli, posseggono attività antiossidante e giocano un ruolo positivo nella conservazione dello stato di salute. L’elevato contenuto di essi nei peperoni dolci (Capsicum Annuum L.) ha incrementato l’interesse nei confronti di questi vegetali da parte del settore agronomico e dell’industria alimentare. È tuttavia noto che la concentrazione di composti bioattivi può essere molto diversa anche tra cultivar della stessa specie vegetale ed è pertanto importante evidenziare il contenuto quali-quantitativo delle varie molecole nelle diverse cultivar di peperoni dolci, in modo da evidenziare le più ricche di tali componenti. Occorre però tenere conto anche della biodisponibilità e bioaccessibilità dei diversi componenti funzionali. Infatti il possibile effetto positivo di tali molecole non dipende solo dal loro contenuto nell’alimento ma soprattutto dalla quantità che viene rilasciata dalla matrice alimentare durante il processo digestivo, e che quindi risulta essere potenzialmente biodisponibile e attivo nell’organismo. Scopo della ricerca presentata è stato valutare e confrontare la digeribilità e la bioaccessibilità di alcuni composti bioattivi antiossidanti in peperoni dolci rossi e gialli appartenenti a due diverse cultivar, Lamuyo e Corno di Toro. Il contenuto fenolico totale e di vitamina C, l’attività antiossidante totale sono stati determinati nei campioni di peperone digeriti in vitro, e comparati ai prodotti freschi, evidenziando differenze significative in termini di bioaccessibilità in particolare tra i peperoni rossi delle due cultivar. Sebbene il processo di digestione in vitro sia una simulazione parziale ed incompleta di quanto accade in vivo, la valutazione di un alimento dopo averlo sottoposto a tale processo rappresenta un importante progresso nello studio delle proprietà e del valore nutrizionale degli alimenti.

Caratterizzazione del microbiota della "colomba" durante le fasi del processo produttivo.

Il consumo di prodotti da forno lievitati in Italia, è rilevante in occasione di alcune feste religiose quali Pasqua e Natale. Prodotti come il Panettone e Colomba hanno acquisito una diffusione nazionale ed internazionale. Questi prodotti sono ottenuti mediante procedure specifiche caratterizzate da passaggi simili. In ogni caso la loro preparazione parte dall’utilizzo di un lievito madre continuamente rinfrescato. Il lievito madre (o impasto acido) è una miscela di acqua e farina fermentata da un microbiota complesso che include LAB, che producono acido lattico, e lieviti fermentativi che producono CO2 ed etanolo con conseguenze sulle caratteristiche reologiche e organolettiche, soprattutto per il profilo aromatico del prodotto finale. In questo lavoro mi sono occupato di valutare l’evoluzione della composizione microbica della Colomba nelle diverse fasi del processo produttivo, cercando di individuare le relazioni fra il microbiota e alcune caratteristiche chimico-fisiche del prodotto. Il lavoro di caratterizzazione del microbiota del prodotto, effettuato nelle diverse fasi del processo produttivo, ha mostrato come l’impasto madre sia caratterizzato da una bassa biodiversità sia di LAB che di lieviti. I microorganismi dominanti risultano essere due biotipi della specie L. sanfranciscensis e, per i lieviti, un solo biotipo della specie T. delbrueckii, con la comparsa di C. humilis solo in un campione con una frequenza relativa molto bassa. Per quel che riguarda l’evoluzione del microbiota durante il processo produttivo, l’aggiunta del lievito commerciale altera i rapporti tra LAB/ lieviti dove le concentrazioni dei LAB, durante impastamento, si riducono incidendo sulle caratteristiche chimico-fisiche degli impasti stessi in termini di maggiori valori di pH e ridotto contenuto in acido lattico. L’aggiunta di S. cerevisiae e successiva lievitazione incidono significativamente sul profilo aromatico del prodotto, in termini di riduzione di acidi (acido acetico) e di esteri ed aumento di molecole: etanolo, alcol fenetilico, acetaldeide ed acetoino, derivanti del lievito commerciale.

Caratterizzazione della microflora spontanea di un alimento fermentato vegano

Tra i prodotti vegani più richiesti vi sono i “formaggi” vegani, alimenti fermentati a base di frutta secca o ottenuti attraverso trattamenti su latte di mandorla e latte di soia, e successivamente fermentati. Nella mia attività ho caratterizzato un alimento fermentato vegano e studiato la successione microbica durante la fermentazione di un “formaggio” ottenuto partendo da anacardi e preparato in maniera artigianale. Oltre agli aspetti microbiologici, ho analizzato anche alcune caratteristiche fisico chimiche. Durante il processo di produzione gli anacardi vengono messi in ammollo per 8 ore a temperatura ambiente e, successivamente, i semi vengono scolati e risciacquati sotto acqua corrente. Gli anacardi vengono poi addizionati di acqua e microrganismi probiotici e tritati in un mixer fino al raggiungimento di una crema omogenea. A questo punto il prodotto viene lasciato riposare a temperatura ambiente per 48 ore durante le quali ha luogo la fermentazione e poi addizionato di ingredienti. Le indagini chimico fisiche effettuate hanno evidenziato che il pH si mostra già basso prima dell’inizio della fermentazione vera e propria e scende a 4.5 dopo 48 ore di riposo a causa dell’accumulo di acidi organici, ed in particolare di acido lattico e acetico che indicando un’attività fermentativa condotta dai batteri lattici. Le analisi microbiologiche hanno confermato che l’effettivo agente di fermentazione era costituito da questi batteri che sono stati identificati a livello molecolare. Le specie identificate due eterofermentanti (Weissella e Leuconostoc), presenti soprattutto nelle prime fasi della fermentazione, ed una omofermentante (Pediococcus), prende il sopravvento mano a mano che la fermentazione procede. Il lavoro svolto ha permesso di ottenere alcune importanti informazioni per la produzione industriale di un “formaggio” vegano fermentato. Il processo studiato presenta numerosi punti di rischio che devono essere presi in considerazione prima di poter giungere alla messa a punto di un prodotto definitivo.

Valutazione sperimentale della purezza radionuclidica per diversi lotti di radiofarmaco "Xofigo" (223Ra-cloruro)

Nell'ambito della terapia medico-nucleare si fa uso di radionuclidi legati a molecole di interesse biologico per poter irradiare le cellule cancerogene di un determinato tessuto, al fine di provocarne l'inattivazione e la morte. Il 223Ra-cloruro è un radiofarmaco di recente introduzione volto al trattamento di metastasi ossee dovute al tumore della prostata. Esso è un emettitore alfa ed è ottenuto tramite un generatore caricato con 227Ac/227Th all'equilibrio. Il radiofarmaco, oltre al breakthrough del progenitore, può contenere anche tracce di 226Ra e 228Th, derivanti dal suo processo produttivo. In questo lavoro di tesi è stato valutato il valore di purezza radionuclidica del 223Ra-cloruro, ricercando la presenza dei suddetti contaminanti, attraverso l'analisi del radiofarmaco mediante uno spettrometro gamma con rivelatore HPGe. Nonostante in uno dei lotti sia stata effettivamente rilevata la presenza del progenitore 227Ac, le misure eseguite hanno comunque confermato l'alto valore di purezza radionuclidica riportato nel Summary of Product Characteristics (SPC) del radiofarmaco. Ciò conferma che non viene somministrata una dose di radiazione ingiustificata al paziente dovuta alla presenza dei contaminanti e semplifica la relativa gestione dei rifiuti radioattivi e le procedure autorizzative.

Attivita tirosina decarbossilasica di enterococcus faecalis in terreno sintetico

Le ammine biogene sono composti azotati a basso peso molecolare che vengono prodotti in seguito alla decarbossilazione degli aminoacidi da parte di specifici enzimi microbici della famiglia delle decarbossilasi. Questi composti sono presenti in diversi alimenti e, in particolare, in quelli fermentati. Nonostante la capacità dell’organismo di metabolizzare tali molecole tramite appositi sistemi di detossificazione una loro eccessiva assunzione provoca sintomatologie deleterie per la salute umana. La tiramina, in particolare, è una delle ammine biogene attualmente più studiate in ragione della diffusa presenza dell’enzima tirosina decarbossilasi (tyrDC) nel pool enzimatico di diversi batteri lattici, specialmente quelli appartenenti al genere Enterococcus. Seppure in letteratura vi siano numerosi studi riguardanti il rapporto fra contenuto di tiramina e l’attività degli enterococchi in molti alimenti, ad oggi sono ridotte le informazioni inerenti la regolazione e il ruolo fisiologico di tale molecola per la cellula microbica. Alla luce di tali considerazioni questa tesi mi sono occupata di approfondire le conoscenze relative l’attività dell’enzima tyrDC in un terreno di coltura a composizione nota da parte dei due ceppi di Enterococcus faecalis EF37 e ATCC29212. A tal fine i ceppi sono stati inoculati in cinque diversi terreni e incubati a tre diverse temperature (20°C, 30°C e 40°C), dopo averli pre-coltivati in terreni contenenti o meno tirosina, allo scopo di valutare se la fase di pre-adattamento fosse in grado di influenzare le performance dei ceppi considerati. Dai risultati ottenuti è emerso che è presente un’estrema eterogeneità nell’attività dell’enzima tyrDC anche all’interno della medesima specie, infatti se il ceppo EF37 ha performance migliori in termini di decarbossilazione quando pre-adattato, il ceppo ATCC29212 non sembra essere influenzato da questo fattore, seppur entrambi presentino una crescita cellulare più accentuata quando pre-adattati. È stata inoltre confermata, alle condizioni adattate, la capacità di produrre 2-feniletilamina da parte del solo ceppo EF37.