Molecular phylogenesis of Mediterranean Octocorals

In order to support the conservation of the Mediterranean octocorals improvements on information regarding their taxonomic units and phylogenetic relationships are strongly needed. In the present thesis work, phylogenetic analyses based on the mitochondrial mtMSH and 16S genes were performed including 15 Mediterranean octocorals species on the 56 recognized to date. Moreover, an extended datasets with Atlanto/Pacific congeners Octocorallia species was implemented to clarify their phylogenetic relationships and estimate the divergence times of the Mediterranean species. Results indicated that: 1) there are similarity and differences among molecular and morphological traits depending on the taxonomical level considered; 2) the molecular phylogeny of the Mediterranean octocorals retrace the previous relationships based on wide octocorals analyses; and 3) the divergence time among Mediterranean and Atlanto/Pacific species varies depending on analysed taxa. At higher taxonomic level, the Mediterranean trees supported the division of the Mediterranean Octocorallia into one major clade (Alcyoniina-Holaxonia) plus two unresolved branch including the single species available of Scleraxonia and Stolonifera respectively. This topology was better supported including the Atlanto/Pacific congeners species. The molecular evidence suggested that Alcyonium palmatum and Corallium rubrum species are the youngest with a divergence time estimated around 4 MYA. Particularly, C. rubrum results were in agreement with the hypothesis that recent orogenesis process of the Mediterranean Sea promoted the allopatric speciation of this specie. Increasing the sample design and implementing the emerging next-generation genomic-sequencing technologies, further studies would be able to improve the understanding of the Mediterranean octocorals phylogenetic relationships and evolution.

Stima di abbondanza di Tursiops truncatus (Montagu, 1821) nel levante ligure ed evoluzione dei marcaggi naturali utili alla fotoidentificazione

Il bacino ligure, pur facendo parte della più grande area marina protetta del Mar Mediterraneo, il Santuario Pelagos, risulta essere una regione in cui le attività umane stanno condizionando la presenza di numerose specie di Cetacei. Fra tutte Tursiops truncatus, in virtù della sua distribuzione limitata per lo più alle acque basse (<200 metri) è la specie maggiormente soggetta alle conseguenze dirette e indirette dell’impatto antropico. Questo elaborato è stato condotto all’interno del più ampio progetto “Delfini Metropolitani” coordinato dall’Acquario di Genova. L’area di studio presa in esame è l’intero levante ligure con tre stazioni di ormeggio: Genova, Rapallo e Lerici. Tramite la tecnica della cattura-ricattura fotografica è stato possibile analizzare la distribuzione ed effettuare delle stime di abbondanza per il periodo di studio 2005 – 2012. Dai risultati e dal confronto con altri studi è emerso che il tursiope vive entro la piattaforma continentale e sembrerebbe che all’aumentare di quest’ultima aumenti la dimensione della popolazione. Per il periodo di studio considerato la popolazione non fa registrare trend demografici significativi, rimanendo costante fra 150 - 250 individui. In questo elaborato si sono anche studiate le differenze fra maschi e femmine nell’evoluzione dei marcaggi naturali. I risultati preliminari hanno mostrato una differenza significativa fra i due sessi. Il maschio ha un valore maggiore come cambiamento rispetto alle femmine, questo è dovuto al fatto che gli individui maschi hanno interazioni spesso aggressive per poter accedere alle femmine. Infine grazie all’analisi dell’evoluzione dei marcaggi naturali e delle differenze trovate, si è proposto un nuovo metodo per poter sessare gli animali. Questo qui proposto, comunque, è un metodo derivante da uno studio preliminare e si ha bisogno di successivi studi per testarne l’efficienza e l’affidabilità.

Alterazioni del sistema di trasduzione AMPc-dipendente nel mitilo mediterraneo Mytilus galloprovincialis esposto a fluoxetina

Negli ultimi decenni le nuove scoperte mediche e il miglioramento dello stile di vita nei paesi occidentali hanno determinato un aumento del consumo di sostanze terapeutiche, nonché della gamma di prodotti farmaceutici e parafarmaceutici comunemente utilizzati. Gli studi di cinetica dei farmaci dimostrano con certezza che essi, seppur metabolizzati, mantengono inalterato il loro potere d’azione, rimanendo biodisponibili anche una volta escreti dall’organismo. A causa della loro eccessiva polarità tali molecole sono inoltre difficilmente trattenute dai convenzionali impianti di depurazione dei reflui urbani, dai quali confluiscono inevitabilmente verso le acque fluviali e/o costiere le quali risultano. In ragione di ciò, la valutazione degli effetti che la loro presenza può provocare sulla qualità dei sistemi di approvigionamento idrico e sulla biologia delle specie tipiche degli ecosistemi acquatici, ha classificato tali composti come una nuova classe di inquinanti emergenti, il cui impatto ambientale non risulta ancora del tutto arginato attraverso adeguate contromisure legislative. I farmaci sono sostanze bioattive progettate per avere effetti specifici a bassissime concentrazioni negli organismi target attraverso specifici meccanismi d’azione. Nel caso in cui i bersagli cellulari su cui agiscono siano evolutivamente conservati negli organismi non target, essi possono esercitare le proprie funzioni attraverso i medesimi meccanismi di regolazione fisiologica attivati nelle specie target, dando origine a effetti specifici, o anche aspecifici, nel caso in cui tali bersagli siano deputati alla regolazioni di funzioni differenti. Pertanto lo scopo del presente lavoro di tesi è stato quello di analizzare le possibili alterazioni di carattere fisiologico in individui di mitilo mediterraneo (Mytilus galloprovincialis) esposti a concentrazioni ambientali di fluoxetina, farmaco antidepressivo appartenente alla classe degli inibitori selettivi del riassorbimento presinaptico della serotonina (SSRI). Più nel dettaglio, a seguito di un’esposizione per 7 giorni a dosaggi compresi tra 0.03 e 300 ng/L di FX, sono stati analizzati i livelli intracellulari di AMPc e l’attività dell’enzima PKA nei diversi trattamenti sperimentali effettuati. Inoltre sono stati valutati i livelli di espressione genica del recettore serotoninergico 5HTmyt1 e della la P-glicoproteina (Pgp, gene ABCB1), trasportatore di membrana responsabile del sistema di detossificazione noto come Multi-xenobiotic resistance (MXR). Nella ghiandola digestiva, la FX causa una diminuzione statisticamente significativa dei livelli di AMPc, dell’attività della PKA e dell’espressione del gene ABCB1 rispetto al controllo. Al contrario nel mantello il farmaco non produce alterazioni dei livelli intracellulari di AMPc e dell’attività della PKA mentre si apprezza una sottoespressione del gene ABCB1 nei trattamenti a dosaggi intermedi. In entrambi i tessuti si nota un aumento dell’espressione genica di 5HTmyt1 alle minori concentrazioni di FX, mentre ai dosaggi più alti non si registrano alterazioni significative rispetto al controllo. Nel loro insieme i risultati indicano che nei mitili, concentrazioni ambientali di FX producono significative alterazioni di diversi parametri fisiologici attraverso una modulazione specifica dei medesimi bersagli molecolari coinvolti nella terapia umana. La riduzione dei livelli di AMPc/PKA apprezzata nella ghiandola digestiva risulta in linea con la funzione inibitoria svolta dal recettore 5HTmyt1 su tale via di trasduzione, mentre l’assenza di variazioni significative registrata nel mantello supporta l’ipotesi di un’interazione tra il sistema serotoninergico e catecolaminergico nella regolazione dei processi legati al ciclo riproduttivo che si verificano in tale tessuto. In conclusione, i dati dimostrano che l’espressione del gene codificante la proteina Pgp è regolata dalla FX attraverso uno specifico meccanismo d'azione AMPc-dipendente modulato dalla serotonina; tuttavia, è ipotizzabile anche un effetto non specifico indotto dalla FX stessa, per esempio attraverso l’induzione di stress ossidativo. Inoltre essi evidenziano la presenza di un meccanismo di regolazione retroattivo sulla espressione dei recettori 5HTmyt1 in funzione delle concentrazioni extracellulari di serotonina modulate dall’azione della FX.

Reclutamento di invertebrati bentonici in una grotta sottomarina del Mar Mediterraneo

Le grotte marine sono habitat molto particolari che presentano situazioni molto diverse da quelle riscontrabili nell’ambiente esterno. La variabilità nella struttura geomorfologica, la topografia, la profondità, l’orientamento e l’idrodinamismo rappresentano una vasta gamma di situazioni che consentono la presenza di popolamenti caratteristici, la cui unicità determina l’importanza della loro salvaguardia. La composizione delle comunità dipende fortemente dall'arrivo dei propaguli dall'esterno, e non solo dalla riproduzione di adulti presenti. Quindi, per determinare la struttura e la dinamica delle popolazioni marine, è di fondamentale importanza comprendere i processi che agiscono sul reclutamento. In particolare per gli organismi sessili la fase larvale rappresenta l'unico stadio di dispersione. Lo scopo di questo lavoro è analizzare il reclutamento dei popolamenti bentonici sulle pareti laterali e sulla volta della grotta sottomarina della Colombara, nell’area marina protetta di Portofino (Genova), per valutare la loro diversità specifica, abbondanza e distribuzione. Per far ciò sono stati posti 14 pannelli quadrati in forex PVC all’interno della grotta (8 sulla volta e 6 sulle pareti laterali) per un periodo di tempo di venti mesi. L’abbondanza degli organismi è stata stimata in termini di ricoprimento percentuale utilizzando un reticolo di 400 sottoquadrati da 1 cm². Le possibili differenze tra le strutture dei popolamenti, l’abbondanza delle specie e gli indici di diversità tra parete e volta della grotta sono state testate con l’analisi della varianza basata su permutazioni (PERMANOVA) utilizzando il software PRIMER 6. Dai risultati ottenuti sono emerse differenze qualitative e quantitative nella distribuzione dei popolamenti fra la volta e le pareti della grotta. Analizzando le singole specie, è possibile osservare come molte di queste tendano a reclutare maggiormente sulla volta rispetto alle pareti. In generale, la distribuzione degli organismi dipende, oltre che dai più conosciuti gradienti ambientali (idrodinamismo, luce ecc) dai processi ecologici. Considerando che i fattori ambientali ed ecologici interagiscono nel definire la struttura dei popolamenti e sono interdipendenti tra loro, possiamo ipotizzare che le distribuzioni spaziali osservate per le diverse specie dipendano in gran parte dall’ecologia larvale, che porta ad un più elevato tasso di reclutamento sulla volta piuttosto che sulle pareti della grotta.

Struttura dei popolamenti meiobentonici nella zona intertidale dell'Alto Adriatico a differenti gradi di antropizzazione

The present work is part of the European project THESEUS (Innovative technologies for safer Europeans coasts in a changing climate). The main goals are to provide adequate integrated methodologies for strategic planning of sustainable coastal defence. The present study investigates the structure and composition of meiobenthonic populations of the intertidal zone in four beaches along the Northern Adriatic coast of Emilia Romagna: Lido di Spina, Bellocchio, Lido di Dante e Cervia. The four sites are different for the level of human impacts and for the different management interventions against coastal erosion. The analysis of biotic and abiotic variables revealed different responses due mainly to site-specific characteristics of the investigated sites, in particular as regards the site of Bellocchio. The growing interest in ecosystems of sandy beaches has recently highlighted the importance of the ecological role of meiofauna, emphasizing the need to develop studies aimed to conservation as well as to the use of these organisms as descriptors of the environmental status. The present study showed that the response of the organisms of meiofauna was highly sensitive to the specific environmental conditions of the four sites considered. Therefore it appears to be possible to consider the response of meiofauna to environmental and anthropogenic stressors as supplementary information to the responses of macrobenthic communities, which have been, until now, widely recognized and used as syncretic indicators of the ecosystem status.

Studio della diversa espressione di proteine del siero nelle anguille (Anguilla anguilla) gialle ed argentine mediante analisi proteomica

L’anguilla europea (Anguilla anguilla) è una specie eurialina catadroma, la cui area di riproduzione si trova a grande distanza dall’areale di distribuzione. Presenta un ciclo biologico piuttosto complesso caratterizzato da due metamorfosi: la prima, tipicamente larvale permette al “leptocefalo”, forma larvale marina tipica degli anguilliformi, di trasformarsi in anguilla “ceca”; la seconda, invece, trasforma l’anguilla “gialla” in “argentina” attraverso un processo definito di “argentinizzazione” nel quale si delineano preadattamenti alla maturazione sessuale che sarà completa durante la migrazione riproduttiva verso il Mar dei Sargassi. L’”argentinizzazione” innesca modificazioni fisiologiche (regressione del tratto digestivo), e morfologiche (aumento della massa corporea, ispessimento della pelle, modificazione dell’occhio e nuova pigmentazione). Il colore bruno verdastro con ventre giallo è prerogativa delle anguille in fase trofica, cioè quelle gialle, sessualmente immature. Quelle argentine presentano, invece, una colorazione più scura sul dorso e argenteo sul ventre. Inoltre le anguille argentine vanno incontro a cambiamenti ormonali per adattarsi all’ambiente marino, compiere la lunga migrazione e riprodursi. Per avere a disposizione risorse energetiche anche senza nutrirsi per molti mesi, devono accumulare grandi riserve di cui il 60% è destinato per lo sviluppo delle gonadi. Tuttavia i processi metabolici che consentono alle anguille argentine di effettuare lunghe migrazioni mantenendo un’alta efficienza del nuoto e nel contempo utilizzando limitate risorse, non sono sufficientemente conosciuti. Per fornire nuove informazioni, questo lavoro di tesi ha indagato se vi sia una modificazione del quadro proteico del siero delle anguille argentine rispetto alle gialle, e quali proteine eventualmente risultino sovra- o sotto- espresse in ciascuna delle due fasi del ciclo biologico. A tale fine si è applicata una tecnica innovativa, quale l’analisi proteomica, che permette di identificare in modo sistematico le proteine all’interno di un substrato biologico come iin questo caso il siero. Le anguille gialle ed argentine prese in esame sono state prelevate nelle Valli di Comacchio (FE). La valutazione quantitativa delle proteine, separate tramite elettroforesi bidimensionale su gel di poliacrilamide, si è fondata sull’analisi delle immagini attraverso specifici programmi (Proteomweaver). A tale proposito, si sono confrontati i gel di anguilla gialla ed argentina individuando gli spot corrispondenti alle proteine e quantificandoli. Gli spot differenzialmente espressi sono stati prelevati per essere poi identificati tramite spettrometria di massa (MS/MS), arrivando al riconoscimento di diverse proteine. Tra queste, sono state identificate due diverse isoforme di apolipoproteina, l’una più espressa nell’anguilla gialla, l’altra nell’argentina; tali proteine svolgono un ruolo importante nella facilitazione del trasporto lipidico e nell’assorbimento dei lipidi associato anche con la crescita degli ovociti. Il treno di spot relativo alla transferrina è decisamente più evidente nelle anguille argentine, il che potrebbe essere correlato al ruolo del ferro nell’emoglobina, mirato ad un maggiore apporto di ossigeno ai tessuti durante la lunga migrazione riproduttiva di questi animali. Lo studio è del tutto nuovo e al momento non sono disponibili sufficienti informazioni al contorno per trarre più ampie conclusioni; tuttavia esso merita di essere proseguito per contribuire alla comprensione degli eventi di metamorfosi in questa specie dal ciclo vitale complesso e in gran parte sconosciuto.

Evolution and historical biogeography of the Eastern Atlantic skates

In my thesis, I tested the hypothesis that the diversification of the Eastern Atlantic skate faunas arose through vicariance rather than dispersal, using combined approach of molecular phylogeny reconstruction and zoogeography (namely historical biogeography). This analyses have been carried out independently on four Rajidae genera belonging to two different tribes: Rajini (Raja and Dipturus) and Amblyrajini (Rajella and Leucoraja). These taxa were selected because they displayed high species diversity and richness of endemic species in the Eastern Atlantic and Mediterranean. The verification of this hypothesis was carried out by reconstructing the best phylogenetic relationships among four genera and 26 species (including several endemism) based on mtDNA and nuDNA gene variation and several statistical approaches. Divergence times of taxa have been estimated based on molecular clock and fossil calibration to explain evolutionary patterns in the context of geological framework. Main issues are (i) the evidence that Eastern Atlantic skate evolution and displacement of species diversity occurred from pulsed geographical speciation (i.e. repeated series of parallel and independent speciation events) started in the Late Eocene-Early Miocene and they have occurred prevalently during Miocene; (ii) such relatively ancient origin of diversification has been allowed the sympatric displacement and evolution of several congeneric taxa likely because they have accumulated huge differences in the genomic and physiological/behavioural phenotypic traits; (iii) recently diverged sister species and taxa showed allopatric or parapatric evolution by the presence of oceanographic or hydrogeographical barriers which likely prevent large mixing between parapatric sister species.

Genetic characterisation and global comparison of ancient Mediterranean Great White Sharks population (Carcharodon carcharias, L.1758)

This study poses as its objective the genetic characterization of the ancient population of the Great White shark, Carcharodon carcharias, L.1758, present in the Mediterranean Sea. Using historical evidence, for the most part buccal arches but also whole, stuffed examples from various national museums, research institutes and private collections, a dataset of 18 examples coming from the Mediterranean Sea has been created, in order to increase the informations regarding this species in the Mediterranean. The importance of the Mediterranean provenance derives from the fact that a genetic characterization of this species' population does not exist, and this creates gaps in the knowledge of this species in the Mediterranean. The genetic characterization of the individuals will initially take place by the extraction of the ancient DNA and the analysis of the variations in the sequence markers of the mitochondrial DNA. This approach has allowed the genetic comparison between ancient populations of the Mediterranean and contemporary populations of the same geographical area. In addition, the genetic characterization of the population of white sharks of the Mediterranean, has allowed a genetic comparison with populations from global "hot spots", using published sequences in online databases (NCBI, GenBank). Analyzing the variability of the dataset, both in terms space and time, I assessed the evolutionary relationships of the Mediterranean population of Great Whites with the global populations (Australia/New Zealand, South Africa, Pacific USA, West Atlantic), and the temporal trend of the Mediterranean population variability. This method based on the sequencing of two portions of mitochondrial DNA genes, markers showed us how the population of Great White Sharks in the Mediterranean, is genetically more similar to the populations of the Australia Pacific ocean, American Pacific Ocean, rather than the population of South Africa, and showing also how the population of South Africa is abnormally distant from all other clusters. Interestingly, these results are inconsistent with the results from tagging of this species. In addition, there is evidence of differences between the ancient population of the Mediterranean with the modern one. This differentiation between the ancient and modern population of white shark can be the result of events impacting on this species occurred over the last two centuries.

Feeding behaviour of the Corydoradinae

The evolution of a sub-family of south-american freshwater catfishes has created a great diversification of its representants into a huge number of species, usually members of characteristic mimicry communities. After the work of Alexandrou (Alexandrou, 2011) on the phylogeny of the group that discovered the existence of more deep divisions, from the taxonomic point of view, of the sub-family, even from the ecological point of view, I tried to reconfirm these statements from the ethological point of view, settling watching and recording sessions and an experiment that could show their interactions on the environment by observing their substrate mixing action.

Morphological-molecular taxonomy and population genetic structure of common and Egyptian soles of the Adriatic Sea

A total of 352 specimens were analyzed to achieve the different aims of this thesis. 255 central-northern Adriatic specimens of S. solea and S. aegyptiaca were molecularly analysed using microsatellite locus Sos(AC)40 and 205 also morphologically due to evaluate the abundance and the distribution of the cryptic species S. aegyptiaca and to confirm morphologic analyses. Morphological and molecular analyses comparated show a correspondence of 96%. A combined morphologic approach could be proposed to apply multiple criteria on the analyzed external morphological keys. The Adriatic Egyptian soles may lives in shallow waters (up 30 m) and in brackish lagoon. 127 samples of Adriatic common sole added to 326 samples of previous studies showed, using mitochondrial marker (CytB), that the Adriatic Sea as contact zone between Tyrrhenian and Aegean Sea, the divergence within the Adriatic Sea is low but significant between central-north and south, with a longitudinal strong gene flow in central-northern side. It’s also showed as in the Adriatic Sea two near-panmictic populations of common sole exist.

Andamenti temporali, display comportamentali, attività respiratoria e profili endocrini in Odobenus rosmarus presso l'Oceanogràfic di Valencia

Il presente studio è stato progettato e articolato includendo tre approcci disciplinari sviluppati parallelamente al fine di ottenere dati etologici, endocrinologici, e respiratori riguardo cinque esemplari di trichecho del pacifico (Odobenus rosmarus) ospitati presso l’Oceanografic di Valencia. Il periodo di campionamento si è sviluppato in un lasso di tempo di 12 settimane durante le quali sono stati raccolti dati riguardo i tre ambiti di studio. La raccolta di dati etologici è stata effettuata per mezzo di supporto video il quale ha permesso di generare un totale di 72 ore di filmato. Attraverso l’analisi del materiale multimediale è stato possibile elaborare un catalogo comportamentale con annesso un catalogo video atto alla semplificazione di riconoscimento dei vari moduli comportamentali; la revisione della documentazione video è stata effettuata mediante il software Noldus “Observer 5.0” che si è resa necessaria per la quantificazione dei singoli comportamenti osservati durante il periodo di studio. Succesivamente i dati ottenuti sono stati sottoposti ad analisi statistica al fine di poter valutare le differenze e le analogie comportamentali dei due soggetti principali nell’arco della singola giornata e durante le dodici settimane di analisi. In concomitanza col campionamento video, si è proceduto ialla raccolta dei dati relativi ai pattern respiratori al fine di valutare la durata delle apnee in ambiente controllato. In seguito è stato effettuato un approccio endocrinologico al fine di valutare la possibilità di rilevare e quantificare glucorticoidi quali cortisolo, testosterone e progesterone presenti nei campioni. Si è ricorso alla raccolta di materiale salivare in alternativa al campionamento ematico in modo da stabilire l’effettiva efficacia del metodo. I campioni sono stati poi processati mediante RIA e i livelli ormonali ottenuti sono stati utilizzati per effettuare una comparazione con il manifestarsi dei moduli comportamentali osservati è analizzarne le correlazioni presenti e osservarne gli effetti sull’espressione etologica.

Indagini molecolari per l'identificazione di batteri solfato riduttori in una laguna costiera.

Questo lavoro di tesi fa parte di un piano monitoraggio sulla Pialassa dei Piomboni coordinato dal Centro Interdipartimentale di Ricerca per le Scienze Ambientali (CIRSA, Università di Bologna) il cui scopo è stato quello di valutare la presenza di batteri solfato-riduttori (sulphatereducing bacteria SRB) in questa laguna costiera sia nell'acqua che nei sedimenti. Lo sviluppo di odori sgradevoli che avviene periodicamente nella Pialassa dei Piomboni ha fatto sorgere la necessità di verificare l'eventuale presenza di questi batteri. La Pialassa dei Piomboni è una laguna costiera a nord della citta di Ravenna. Si tratta di un'area in evidente stato di degrado a causa di pesanti interventi di antropizzazione e industrializzazione che stanno determinando forti problemi di inquinamento. La qualità dell’acqua di tale bacino risente infatti dei numerosi scarichi inquinati provenienti dal polo industriale e portuale, e di ingenti carichi trofici di origine agricola che entrano in laguna soprattutto attraverso l'idrovora di San Vitale. Questi input di nutrienti stimolano la proliferazione fitoplanctonica, la quale aumenta l'input di materiale organico sul fondo con conseguente riduzione della disponibilita di ossigeno e cambiamento nella struttura dei popolamenti bentonici. L'ipossia che ne consegue determina la diffusione di batteri in grado di degradare anaerobicamente la materia organica, quali ad esempio i solfato-riduttori. Questi batteri utilizzano il solfato come accettore finale di elettroni, che viene ridotto a solfuro di idrogeno. La determinare della presenza di batteri solfato-riduttori nei campioni di acqua e sedimento è stata svolta mediante utilizzo di una metodologia molecolare basata sull’estrazione dell’eDNA (environmental DNA) dalle matrici ambientali e la successiva amplificazione (PCR) di un tratto genico codificante l’enzima solfito reduttasi (dissimilatory sulfite reductase dsrAB), specifico di questi batteri.