Ruolo del gene umano CYYR1: dallo studio funzionale dell'ortologo in Danio rerio alla potenziale implicazione in processi tumorigenici

Il locus CYYR1 identificato e clonato sul cromosoma 21 umano è stato caratterizzato dal punto di vista molecolare come un sistema multitrascritto, esclusivo dei vertebrati che ad oggi è orfano di una funzione specifica. Dati presenti in lettura e rintracciati mostrano una possibile relazione tra il gene CYYR1 e il pathway di Sonic Hedgehog (SHH). In questo progetto di tesi è stato utilizzato il modello animale Danio rerio per indagare il ruolo funzionale dell’ortologo (cyyr1), attraverso esperimenti di gain e loss of function che hanno permesso di dimostrare un suo coinvolgimento nello sviluppo del sistema nervoso centrale, del cuore e del tessuto muscolare. Lo studio dell’ortologo in zebrafish è stato associato all’utilizzo di linee cellulari di rabdomiosarcoma umano. I risultati ottenuti dall’induzione al differenziamento miogenico di queste linee, insieme ai dati ottenuti in Danio rerio, confermano il possibile coinvolgimento del gene CYYR1 nella miogenesi. Lo studio delle relazione tra il pathway di SHH e l’espressione del gene CYYR1 è stato condotto in entrambi i modelli con l’utilizzo di differenti inibitori della via di segnalazione. I risultati ottenuti mostrano che sistemi inibitori agenti direttamente sul recettore SMO riducono l’espressione del gene. Un dato inaspettato in Danio rerio ottenuto durante questi esperimenti di inibizione, ha aperto una nuova linea di ricerca in collaborazione con l’Università di Warwick tesa a verificare la relazione tra il gene cyyr1 e il gene lefty1. Gli esperimenti condotti presso il laboratorio della Prof.ssa Sampath hanno dimostrato la localizzazione del prodotto proteico cyyr1 in Danio rerio e indagato co-localizzazioni con la proteina lefty1. Infine, in collaborazione con Dr. Deflorian e della Prof.ssa Pistocchi, è stato generato un mutante di Danio rerio deleto per il gene cyyr1 con la tecnica CRISPR/Cas9. La caratterizzazione del mutante cyyr1 -/- ha confermato alcuni dei dati ottenuti attraverso esperimenti di loss of function.

Towards a more sustainable aquaculture: diets effects and environmental impact of aquaculture from a microbiome perspective

There is a lot of interest to optimize aquaculture production due to its overexploitation of marine resources, ocean pollution and habitat destruction. Since feed production is one of the greatest issues in aquaculture, feeding strategy optimization is important. The study of several different feed additives or supplementation is important to secure optimal growth, gut health, and function in farmed fish. Feed additives are typically supplied to ensure good health and to help the animal ward off pathogens during both normal and challenging conditions, which could stress animals and promote insurgence of pathologies or pathogens invasions. In this context has an increasing interest the study of host associated microbiome to understand the influence of novel functional feed on the health and physiology of animals. To achieve a more sustainable aquaculture sector, show a great importance the understanding of the environmental impact of this human activity in terms of habitat destruction, ocean pollution and reduction marine environments biodiversity. Marine microbiomes, either free-living or associated with multicellular hosts, is acquiring an increasing interest because their role in supporting the functioning and biodiversity of marine ecosystems, providing essential ecological services. Becoming extremely important to understand how these activities can affect marine microbiomes by altering their function and diversity. In this thesis work, we were able to present a comprehensive evaluation of different functional feeds assessing their effects in terms of growth and gut health of three fish species, Rainbow Trout (Oncorhynchus mykiss), Gilthead seabream (Sparus aurata) and Zebrafish (Danio rerio). We also explored the impact of Aquaculture on the surrounding marine microbiomes, using Patella caerulea as a model holobionts. Finally, we provided a synoptical study on the microbiomes of the water column and surface sediments in North-Western Adriatic Sea (Italy), providing the finest-scale mapping of marine microbiomes in the Mediterranean Sea.

Anticancer drug screening from images of zebrafish embryogenesis

During the previous 10 years, global R&D expenditure in the pharmaceuticals and biotechnology sector has steadily increased, without a corresponding increase in output of new medicines. To address this situation, the biopharmaceutical industry's greatest need is to predict the failures at the earliest possible stage of the drug development process. A major key to reducing failures in drug screenings is the development and use of preclinical models that are more predictive of efficacy and safety in clinical trials. Further, relevant animal models are needed to allow a wider testing of novel hypotheses. Key to this is the developing, refining, and validating of complex animal models that directly link therapeutic targets to the phenotype of disease, allowing earlier prediction of human response to medicines and identification of safety biomarkers. Morehover, well-designed animal studies are essential to bridge the gap between test in cell cultures and people. Zebrafish is emerging, complementary to other models, as a powerful system for cancer studies and drugs discovery. We aim to investigate this research area designing a new preclinical cancer model based on the in vivo imaging of zebrafish embryogenesis. Technological advances in imaging have made it feasible to acquire nondestructive in vivo images of fluorescently labeled structures, such as cell nuclei and membranes, throughout early Zebrafishsh embryogenesis. This In vivo image-based investigation provides measurements for a large number of features at cellular level and events including nuclei movements, cells counting, and mitosis detection, thereby enabling the estimation of more significant parameters such as proliferation rate, highly relevant for investigating anticancer drug effects. In this work, we designed a standardized procedure for accessing drug activity at the cellular level in live zebrafish embryos. The procedure includes methodologies and tools that combine imaging and fully automated measurements of embryonic cell proliferation rate. We achieved proliferation rate estimation through the automatic classification and density measurement of epithelial enveloping layer and deep layer cells. Automatic embryonic cells classification provides the bases to measure the variability of relevant parameters, such as cell density, in different classes of cells and is finalized to the estimation of efficacy and selectivity of anticancer drugs. Through these methodologies we were able to evaluate and to measure in vivo the therapeutic potential and overall toxicity of Dbait and Irinotecan anticancer molecules. Results achieved on these anticancer molecules are presented and discussed; furthermore, extensive accuracy measurements are provided to investigate the robustness of the proposed procedure. Altogether, these observations indicate that zebrafish embryo can be a useful and cost-effective alternative to some mammalian models for the preclinical test of anticancer drugs and it might also provides, in the near future, opportunities to accelerate the process of drug discovery.

Role of (R)-9-hydroxystearic acid in zebrafish development

9-hydroxystearic acid (9-HSA) belongs to a class of lipid peroxidation products identified in several human and murine cell lines. These products are greatly diminished in tumors compared to normal tissues and their amount is inversely correlated with the malignancy of the tumor. 9-HSA activity has been tested in cancer cell lines, where it showed to act as a histone deacetylase 1 (HDAC1) inhibitor. In particular, in a colon cancer cell line (HT29), its administration resulted in an inhibition of proliferation together with an induction of differentiation. In this thesis the effect of (R)-9-hydroxystearic acid has been tested in vivo on cell proliferation and differentiation processes, in the early stages of zebrafish development. The final aim of this work was to elucidate the role of (R)-9-HSA in the control of cell differentiation and proliferation during normal development, in order to better understand its molecular control of cancerogenesis. The molecule has been administered via injection in the yolk of zebrafish embryos. The analysis of the histone acetylation pattern showed a hyperacetilation of histone H4 after treatment with the molecule, as detectable in HDAC1 mutants. (R)-9-HSA was also demonstrated to interfere with the signaling pathways that regulate proliferation and differentiation in zebrafish retina and hindbrain. This resulted in a reduction of proliferation in the hindbrain at 24 hours post injection (hpi), and in a hyperproliferation at 48 and 72 hpi in the retina, with a concomitant inhibition of differentiation. Finally, (R)-9-HSA effects were evident on proliferation of stem cell located in the ciliary marginal zone (CMZ) of the retina. The presence of ROS and 4-hydroxynoneal in the CMZ of wild-type embryos supports the hypothesis that oxidative stress could regulate stem cells fate in zebrafish retina.

Bioimaging of animal embryogenesis: mathematical methods and computational algorithms

Some fundamental biological processes such as embryonic development have been preserved during evolution and are common to species belonging to different phylogenetic positions, but are nowadays largely unknown. The understanding of cell morphodynamics leading to the formation of organized spatial distribution of cells such as tissues and organs can be achieved through the reconstruction of cells shape and position during the development of a live animal embryo. We design in this work a chain of image processing methods to automatically segment and track cells nuclei and membranes during the development of a zebrafish embryo, which has been largely validates as model organism to understand vertebrate development, gene function and healingrepair mechanisms in vertebrates. The embryo is previously labeled through the ubiquitous expression of fluorescent proteins addressed to cells nuclei and membranes, and temporal sequences of volumetric images are acquired with laser scanning microscopy. Cells position is detected by processing nuclei images either through the generalized form of the Hough transform or identifying nuclei position with local maxima after a smoothing preprocessing step. Membranes and nuclei shapes are reconstructed by using PDEs based variational techniques such as the Subjective Surfaces and the Chan Vese method. Cells tracking is performed by combining informations previously detected on cells shape and position with biological regularization constraints. Our results are manually validated and reconstruct the formation of zebrafish brain at 7-8 somite stage with all the cells tracked starting from late sphere stage with less than 2% error for at least 6 hours. Our reconstruction opens the way to a systematic investigation of cellular behaviors, of clonal origin and clonal complexity of brain organs, as well as the contribution of cell proliferation modes and cell movements to the formation of local patterns and morphogenetic fields.

La risonanza olistica. Arte, pedagogia e scienza della voce nelle culture dello spettacolo

La ricerca impostata considera campi disciplinari specifici e distinti, verso la loro integrazione, mirando a produrre un avanzamento relativo alla scienza della voce attraverso la pratica e lo studio della sua applicazione in campo artistico. A partire dall’analisi delle teorie novecentesche relative alla fonazione nel mondo della scena (Antonin Artaud, Stanislavskij e altri) per giungere alle acquisizioni prodotte dalle terapie corporee e vocali (Tomatis, Lowen, Wilfart in particolare), Marco Galignano ha sviluppato un percorso originale che è passato inoltre attraverso lo studio della pratica di una serie di artisti contemporanei (tra cui Baliani, Belli, Bergonzoni, Jodorowski, Hera, Lucenti e Manfredini) e di pedagoghi e terapeuti (da Serge Wilfart al maestro Paolo Zedda). Galignano ha inoltre riferito, nel suo lavoro, gli esiti della sua personale esperienza di formatore, sviluppata a Bologna all’interno di diversi Dipartimenti dell’Università Alma Mater, del Conservatorio di Musica G.B. Martini, dell’Accademia di Belle Arti e del Teatro Duse in particolare. L’obiettivo della tesi è dunque quello di fondare le basi teoriche per una rinnovata pedagogia vocale, a partire dalla possibile riscoperta del suono naturale fino a giungere alle potenzialità terapeutiche ed artistiche del linguaggio. Gli obiettivi di questo lavoro contemplano l’istituzione di una nuova modalità pedagogica, la sua diffusione attraverso una presentazione opportunamente composta e la sua inscrizione in diverse occorrenze artistiche e professionali. Molte le personalità di spicco del panorama internazionale della scienza e dell’arte della voce che hanno contribuito, negli anni, alla presente ricerca: Francesca Della Monica, insegnante di canto e performer, Tiziana Fuschini, logopedista, Franco Fussi, foniatra, Silvia Magnani, foniatra ed esperta di teatro, Gianpaolo Mignardi, logopedista, Dimitri Pasquali, pedagogo, Livio Presutti, medico chirurgo otorinolaringoiatra, Simonetta Selva, medico dello sport, Serge Wilfart, terapeuta della voce, Paolo Zedda, professore di canto in diverse realtà e Maestro di dizione al Conservatorio Nazionale di Parigi, e molti altri, oltre agli artisti citati in fondo, con le loro ricerche hanno contribuito direttamente alla redazione dell’elaborato finale, che mira a fondare le basi di una rinnovata pedagogia vocale per il teatro in Italia. La ricerca vuole infatti colmare in parte la penuria di apporti scientifici specificamente rivolti alla formazione vocale dell’attore teatrale. II lavoro vorrebbe inoltre raccogliere l’eredita di quei teorici, maestri e registi-pedagoghi che nel Novecento hanno posto le basi per la formazione dell’attore, e al tempo stesso prolungare la linea genealogica che da Stanislavskji trascorre in Grotowski, senza escludere esperienze fondate su presupposti alternativi alla formazione del repertorio vocale del performer: psicofisicità, terapie olistiche, fisica quantistica. Come accennato, una parte della ricerca è stata condotta in collaborazione col Prof. Franco Fussi, correlatore, e grazie al lavoro di redazione nel gruppo della rivista Culture Teatrali, diretto da Marco De Marinis, relatore. II percorso ha inteso infatti sviluppare alcune delle linee di ricerca aperte da Fussi virandole verso lo specifico dell’attività e del training vocale dell’attore, e ha avuto una tappa di verifica rilevante nel Convegno Internazionale di Foniatria e Logopedia “La Voce Artistica” di cui Fussi è direttore, a cui Galignano ha partecipato in veste di relatore. 1. II concetto guida del lavoro di Galignano risiede nell’idea di vibrazione e nel rapporto che questa intrattiene col suono. Il suono, per l’essere umano, costituisce la base materiale della fonazione, del linguaggio codificato comunitariamente così come dei particolari idioletti in continua evoluzione, basi della comunicazione verbale e paraverbale. Il linguaggio umano è costituito principalmente da sonorità vocale e da articolazione consonantica (rumori), e cioè composto di suoni armonici e di rumori prodotti da apparati articolari del corpo che risultano efficaci solo se integrati nel corpo da cui originano. A partire da un tentativo di definizione di salute corporea e di equilibrio psicofisico, attraverso l’analisi della rigenerazione cellulare e delle dinamiche comportamentali, Galignano definisce scientificamente la lingua parlata come emersione di codici comunicativi che originano da una schematizzazione del mondo intimo-personale del soggetto e si fondano su memorie molecolari, sull’attitudine comportamentale abituale, tra spontaneità, automatismi e capacità episodica di attenzione psicofisica. Ciò costituisce, per Galignano, la “risonanza olistica” alla base dell’efficacia comunicativa in sede pedagogica. L’argomento, che verrà sviluppato per la presentazione editoriale dell’elaborato e di cui la tesi di dottorato è solo una prima tappa in fieri, è stato sviscerato anche sulla base di nozioni di fisica classica e di fisica quantistica. Ciò senza dimenticare gli studi approfonditi sulla vocalità in ambito filosofico, da Bologna a Cavarero, da Napolitano a Zumthor. La tesi è composta attraverso una progressione che, a partire da una dichiarazione di poetica, trascorre poi verso l’analisi della fisiologia e della psicologia della voce, per approdare a una zona di approfondimento scientifico, teorico ed empirico, di una serie di metodi d’avanguardia di abilitazione e riabilitazione. In ultimo, come appendice, vengono riferiti i risultati del percorso laboratoriale condotto nel corso degli anni del dottorato di ricerca. Le esperienze sul campo maturate nell’ambito dell’attività pedagogica e laboratoriale si sono inoltre sviluppate a partire da un Progetto Strategico d’Ateneo dell’Università di Bologna intitolato “La Voce nel Corpo. La Recitazione e il Movimento Coreografico”, di cui Marco Galignano è responsabile scientifico. Un tempo specifico della tesi di dottorato è dunque composto a partire dai risultati maturati attraverso le varie azioni, laboratoriali e artistiche, che fin qui il progetto “La Voce nel Corpo” ha prodotto. In definitiva, attraverso il tessuto composto da esperienze pedagogiche, pratica artistica e ricerca scientifica, la tesi di dottorato di Galignano, work in progress, mira a comporre un sistema integrato, teorico-pratico, per l’insegnamento e la trasmissione di una specifica tecnica vocale calata nella pratica attoriale, ma utile a fini ulteriori, da quello riabilitativo fino alle tecniche di cura del sé su cui s’e appuntata la riflessione filosofica erede della teoresi artaudiana. La parte conclusiva della ricerca riguarda i suoi possibili futuri sviluppi, specifici, impostati attraverso la collaborazione, attuale, passata o in divenire, con artisti quali Marco Baliani, Matteo Belli, Alessandro Bergonzoni, Albert Hera, Michela Lucenti, Danio Manfredini e altri a cui Marco Galignano è particolarmente riconoscente.

Ricerca di nuove strategie differenziative: Analisi degli effetti di stimoli fisici e molecolari su cellule mesenchimali umane isolate da tessuto adiposo

Introduzione. Le cellule mesenchimali derivate dal tessuto adiposo (hASC) rappresentano un importante strumento per la terapia cellulare, in quanto derivano da un tessuto adulto abbondante e facilmente reperibile. Con il dispositivo medico Lipogems l’isolamento di tali cellule è eseguito esclusivamente mediante sollecitazioni meccaniche. Il prodotto ottenuto è quindi minimamente manipolato e subito utilizzabile. Ad oggi, il condizionamento pro-differenziativo delle staminali è per lo più attuato mediante molecole di sintesi. Tuttavia, altri fattori possono modulare la fisiologia cellulare, come gli stimoli fisici e molecole naturali. Onde elettromagnetiche hanno indotto in modelli cellulari staminali l’espressione di alcuni marcatori di differenziamento e, in cellule adulte, una riprogrammazione, mentre estratti embrionali di Zebrafish sono risultati antiproliferativi sia in vitro che in vivo. Metodi. La ricerca di nuove strategie differenziative sia di natura fisica che molecolare, nel particolare onde acustiche ed estratti embrionali di Zebrafish, è stata condotta utilizzando come modello cellulare le hASC isolate con Lipogems. Onde acustiche sono state somministrate mediante l’utilizzo di due apparati di trasduzione, un generatore di onde meccaniche e il Cell Exciter . I trattamenti con gli estratti embrionali sono stati effettuati utilizzando diverse concentrazioni e diversi tempi sperimentali. Gli effetti sull’espressione dei marcatori di staminalità e differenziamento relativi ai trattamenti sono stati saggiati in RT-PCR quantitativa relativa e/o in qPCR. Per i trattamenti di tipo molecolare è stata valutata anche la proliferazione. Risultati e conclusioni. La meta-analisi dei dati delle colture di controllo mostra la stabilità d’espressione genica del modello. I trattamenti con i suoni inducono variazioni dell’espressione genica, suggerendo un ruolo regolatorio di tali stimoli, in particolare del processo di commitment cardiovascolare. Due degli estratti embrionali di Zebrafish testati inibiscono la proliferazione alle 72 ore dalla somministrazione. L’analisi d’espressione associata ai trattamenti antiproliferativi suggerisce che tale effetto abbia basi molecolari simili ai processi di differenziamento.