Produzione di virus sintetici per lo studio dei meccanismi di interazione coinvolti nell'induzione di resistenza

Beet soil-borne mosaic virus (BSBMV) and Beet necrotic yellow vein virus (BNYVV) are members of Benyvirus genus. BSBMV has been reported only in the United States while BNYVV has a worldwide distribution. Both viruses are vectored by Polymyxa betae, possess similar host ranges, particles number and morphology. Both viruses are not serologically related but have similar genomic organizations. Field isolates consist of four RNA species but some BNYVV isolates contain a fifth RNA. RNAs 1 and 2 are essential for infection and replication while RNAs 3 and 4 play important roles on plant and vector interactions, respectively. Nucleotide and amino acid analyses revealed BSBMV and BNYVV are different enough to be classified in two different species. Additionally in BNYVV/BSBMV mixed infections, a competition was previous described in sugar beet, where BNYVV infection reduces BSBMV accumulation in both susceptible and resistant cultivars. Considering all this observations we hypothesized that BNYVV and BSBMV crossed study, exploiting their similarities and divergences, can improve investigation of molecular interactions between sugar beets and Benyviruses. The main achievement of our research is the production of a cDNA biologically active clones collection of BNYVV and BSBMV RNAs, from which synthetic copies of both Benyviruses can be transcribed. Moreover, through recombination experiments we demonstrated, for the first time, the BNYVV RNA 1 and 2 capability to trans-replicate and encapsidate BSBMV RNA 3 and 4, either the BSBMV RNA 1 and 2 capability to replicate BNYVV RNA2 in planta. We also demonstrated that BSBMV RNA3 support long-distance movement of BNYVV RNA 1 and 2 in B. macrocarpa and that 85 foreign sequence as p29HA, GFP and RFP, are successfully expressed, in C. quinoa, by BSBMV RNA3 based replicon (RepIII) also produced by our research. These results confirm the close correlation among the two viruses. Interestingly, the symptoms induced by BSBMV RNA-3 on C. quinoa leaves are more similar to necrotic local lesions caused by BNYVV RNA-5 p26 than to strongly chlorotic local lesions or yellow spot induced by BNYVV RNA- 3 encoded p25. As previous reported BSBMV p29 share 23% of amino acid sequence identity with BNYVV p25 but identity increase to 43% when compared with sequence of BNYVV RNA-5 p26. Based on our results the essential sequence (Core region) for the longdistance movement of BSBMV and BNYVV in B. macrocarpa, is not only carried by RNA3s species but other regions, perhaps located on the RNA 1 and 2, could play a fundamental role in this matter. Finally a chimeric RNA, composed by the 5��� region of RNA4 and 3��� region of RNA3 of BSBMV, has been produced after 21 serial mechanically inoculation of wild type BSBMV on C. quinoa plants. Chimera seems unable to express any protein, but it is replicated and transcript in planta. It could represent an important tool to study the interactions between Benyvirus and plant host. In conclusion different tools, comprising a method to study synthetic viruses under natural conditions of inoculum through P. Betae, have been produced and new knowledge are been acquired that will allow to perform future investigation of the molecular interactions between sugar beets and Benyviruses.

Sviluppo della lotta autocida contro Aedes albopictus (Skuse) (Diptera: Culicidae)

SCOPO DELLA RICERCA Aedes albopictus �� diventata in pochi anni dalla sua introduzione in Italia la specie di zanzara pi�� nociva e pi�� importante sotto il profilo sanitario. Essendo una zanzara tipicamente urbana e ad attivit�� diurna, limita fortemente la fruizione degli spazi aperti ed incide negativamente su alcune attivit�� economiche. Il recente episodio epidemico di Chikungunya, che ha colpito il nostro Paese, ha allarmato le autorit�� sanitarie nazionali ed europee che stanno attivando misure di prevenzione e contrasto per fronteggiare il rischio che il virus diventi endemico o che altri virus possano essere introdotti nelle nostre aree. Le misure di lotta contro Aedes albopictus attualmente in essere (lotta larvicida, rimozione dei microfocolai, informazione e coinvolgimento dei cittadini) non danno risultati sufficienti in termini di capacit�� di contenimento delle densit�� del vettore. Per questo �� stato avviato un progetto di ricerca centrato sull'applicazione del metodo dell'autocidio a questa specie. L���attivit�� di ricerca svolta ha avuto come scopo la messa a punto delle metodiche di allevamento massale e di sterilizzazione in grado di permettere la produzione di maschi di qualit�� sufficiente a garantire una buona fitness nelle condizioni di campo e competitivit�� coi maschi selvatici nella fase di accoppiamento. Le prove condotte possono essere raggruppate sotto tre principali campi di indagine: Prove di allevamento, Prove di Irraggiamento e Prove di Competizione. 1. Prove di allevamento In questo ambito sono state esaminate nuove diete larvali al fine di ottenere una pi�� elevata produttivit�� in termini di pupe con tempi di impupamento e dimensioni delle pupe pi�� omogenei. �� stata inoltre valutata la possibile reazione fagostimolante dell���ATP addizionato al pasto di sangue delle femmine adulte con lo scopo di incrementare la produttivit�� di uova prodotte dai ceppi di Ae.albopictus in allevamento. 2. Prove di irraggiamento Attraverso prove di laboratorio sono stati investigati in gabbia gli effetti sterilizzanti di diverse dosi radianti (20 - 85 Gy) sulle pupe maschio di Ae. albopictus per la valutazione dei livelli di sterilit��, fertilit�� e fecondit�� indotti sulle femmine. Si sono compiute inoltre indagini per valutare eventuali alterazioni dello stato fisiologico dei maschi irraggiati e dei livelli di sterilit�� indotti su femmine, in funzione dell���et�� pupale alla quale venivano sottoposti a radiazioni. Analisi degli effetti delle radiazioni sui tempi di rotazione genitale, sulla velocit�� ed efficacia degli accoppiamenti e sui tempi di sfarfallamento degli adulti sono state condotte su maschi irraggiati a diverse dosi. Infine su femmine di Ae. albopictus si sono realizzate prove in gabbia per lo studio dei tempi di recettivit�� all'accoppiamento. Prove di competizione L'effetto negativo della colonizzazione in condizioni artificiali e l'irraggiamento sono riconosciuti come i fattori principali che incidono sulla competitivit�� dei maschi sterilizzati nei confronti di quelli fertili. Per la verifica della variazione di fitness dovuta a imbreeding ed eterosi, prove di competizione in serra (7,5 x 5 x 2,80 m) sono state realizzate impiegando ceppi allevati in laboratorio, ceppi selvatici raccolti in campo e ceppi ibridi ottenuti incrociando diversi ceppi di laboratorio. RISULTATI 1. Prove di allevamento Sono state confrontate la dieta standard (DS = 2,5 mg/larva Friskies Adult �� + 0,5 mg/larva lievito di birra) e la nuova dieta integrata addizionata di Tetramin �� (DI = DS + 0,2 mg/larva Tetramin ��) per l���alimentazione delle larve in allevamento. Le prove condotte hanno evidenziato una buona risposta nelle percentuali di impupamento e di produttivit�� in termini di pupe per la nuova dieta senza per�� evidenziare miglioramenti significativi con la DS. Con la dieta integrata si ottiene un impupamento a 7 giorni del 66,6% delle larve allevate (65% con la DS) e il setacciamento a 1400 ��m delle pupe ottenute produce in media il 98,3% di maschi nel setacciato (98,5% con la DS). Con la dieta standard la percentuale di maschi ottenuti sulle larve iniziali �� pari a 27,2% (20-25% con la DS). Come riportato da Timmermann e Briegel (1999) la dieta delle larve va strutturata con l���obiettivo di garantire un ampio range di elementi nutritivi evitando cos�� il rischio di carenze o sub-carenze che possano influire negativamente sulla produttivit�� dell���allevamento e sulle condizioni di vigore dei maschi. Secondo Reisen (1980, 1982), l���influenza negativa dell���allevamento sulla competitivit�� dei maschi nella fase di accoppiamento potrebbe essere di maggiore peso rispetto all���influenza dell���irraggiamento dei maschi. Infine le prove di laboratorio condotte per la verifica dell���efficacia fagostimolante di ATP nel pasto di sangue offerto alle femmine dell���allevamento non hanno evidenziato differenze significative in nessuno dei parametri considerati tra il campione nutrito con ATP e il testimone. Nella realizzazione di allevamenti massali per la produzione di maschi da irraggiare, si ritiene quindi opportuno mantenere la nuova dieta testata che garantisce una spettro nutritivo pi�� ampio e completo alle larve in allevamento. L���aggiunta di ATP nel pasto di sangue delle femmine adulte non sar�� impiegato in quanto troppo costoso e significativamente poco produttivo nel garantire un aumento del numero di uova prodotte. 2. Prove di irraggiamento Oltre alla sopravvivenza e alla sterilit��, la scelta dello stadio di sviluppo pi�� conveniente da irraggiare in un programma SIT dipende dalla possibilit�� di maneggiare in sicurezza grandi quantit�� di insetti senza danneggiarli durante tutte le fasi che intercorrono tra l���allevamento massale, l���irraggiamento e il lancio in campo. La fase pupale risulta sicuramente pi�� vantaggiosa per il maggior numero di pupe irraggiabili per unit�� di volume e per il minimo danneggiamento arrecabile all'insetto che viene mantenuto in acqua durante tutte le procedure. La possibilit�� di lavorare con la minima dose radiante efficace, significa ridurre lo stress provocato inevitabilmente alle pupe maschio, che si manifesta nell���adulto con una ridotta longevit��, una diminuita capacit�� di accoppiamento o di ricerca del partner e attraverso possibili alterazioni comportamentali che possono rendere il maschio inattivo o inefficace una volta introdotto in campo. I risultati ottenuti sottoponendo pupe maschili a irraggiamento a differenti ore dall���impupamento evidenziano come la maturit�� del campione influisca sia sulla mortalit�� delle pupe che sull���efficacia sterilizzante dell���irraggiamento. Come riportato anche da Wijeyaratne (1977) le pupe pi�� vecchie mostrano una minore mortalit�� e una maggiore sensibilit�� alle radiazioni rispetto a quelle pi�� giovani. In particolare si �� osservato come pupe maschili di et�� superiore 24h fossero maggiormente sensibili all���irraggiamento riportando minore perdita di competitivit�� rispetto alle pupe irraggiate precocemente. La minore dose impiegata per il raggiungimento della sterilit�� con minimi effetti sulla longevit�� dei maschi trattati e con livelli di fecondit�� e fertilit�� indotti sulle femmine non differenti dal testimone, corrisponde a 40Gy (Cs 137 - 2,3 Gy/min). Analizzando la sopravvivenza dei maschi, si osserva una tendenza all'aumento della mortalit�� in funzione dell���aumento della dose fornita per tutte le et�� pupali di irraggiamento testate. Per trattamenti condotti su pupe di et�� > 30h la longevit�� dei maschi non risente dell���irraggiamento fino a dosi di 40Gy. La fecondit�� delle femmine accoppiatesi con maschi irraggiati con dosi superiori a 40Gy mostra una tendenza alla riduzione del numero di uova prodotte con l���aumentare della dose ricevuta dal maschio. L���irraggiamento delle pupe non determina variazioni significative nei tempi di sfarfallamento degli adulti per le diverse dosi radianti fornite e per le differenti et�� pupali testate in rapporto al testimone. L���irraggiamento influenza al contrario i tempi di rotazione dei genitali esterni dei maschi evidenziando un ritardo proporzionale alla dose ricevuta. Resta da definire sui maschi irraggiati l���effetto combinato dei due effetti sui tempi di sfarfallamento degli adulti anche se appare chiara l���assenza di variazioni significative per la dose di irraggiamento 40Gy scelta come radiazione utile per la sterilizzazione dei maschi da lanciare in campo. Per quanto riguarda l���analisi dei tempi di accoppiamento dei maschi irraggiati si osserva in generale una minore reattivit�� rispetto ai maschi fertili particolarmente marcata nei maschi irraggiati a dosi superiori i 40 Gy. Gli studi condotti sui tempi di accoppiamento delle femmine evidenziano una buona recettivit�� (>80%) all���accoppiamento solo per femmine di et�� superiore a 42 - 48 h femmine. Prima di tale periodo la femmina realizza accoppiamenti con normale appaiamento dei due sessi ma non riceve il trasferimento degli spermi. 3. Prove di competizione Prove preliminari di competizione in tunnel svolte nel 2006 su ceppi selvatici e di allevamento avevano mostrato risultati di competitivit�� dei maschi sterili (50 Gy) segnati da forte variabilit��. Nel 2007 dopo aver condotto analisi per la verifica dei tempi di sfarfallamento, di accoppiamento e di rotazione genitale nei maschi sterilizzati, e di recettivit�� nelle femmine, sono state realizzate nuove prove. In queste prove maschi adulti di Ae. albopictus irraggiati a 40Gy sono stati posizionati in campo, in ambiente naturale ombreggiato ed isolato, all���interno di serre (8x5x2,8 m) insieme a maschi adulti fertili e femmine vergini di Ae. albopictus con rapporto 1:1:1. Le prove preliminari 2006 erano condotte con le medesime condizioni sperimentali del 2007 ad eccezione dei tempi di inserimento delle femmine vergini passati da 1 giorno nel 2006, a 3 giorni nel 2007 dall���immissione dei maschi in tunnel. Sono state effettuate prove testando la competizione tra esemplari provenienti da ceppi di allevamento (cicli di allevamento in gabbia > 15), ceppi selvatici (da materiale raccolto in campo e con cicli di allevamento in gabbia < 5) e ceppi ibridi (ottenuti dall���incrocio di ceppi italiani di diversa provenienza geografica). I risultati ottenuti mostrano indici di competizioni medi accettabili senza evidenziare differenza fra i ceppi impiegati. L���allevamento massale quindi non deprime i ceppi allevati e gli ibridi realizzati non mostrano una vigoria superiore ne rispetto ai ceppi selvatici ne rispetto agli allevati in laboratorio.

Reverse genetic studies of Benyvirus - Polymyxa betae molecular interaction: Role of the RNA4-encoded protein in virus transmission

Beet necrotic yellow vein virus (BNYVV), the leading infectious agent that affects sugar beet, is included within viruses transmitted through the soil from plasmodiophorid as Polymyxa betae. BNYVV is the causal agent of Rhizomania, which induces abnormal rootlet proliferation and is widespread in the sugar beet growing areas in Europe, Asia and America; for review see (Peltier et al., 2008). In this latter continent, Beet soil-borne mosaic virus (BSBMV) has been identified (Lee et al., 2001) and belongs to the benyvirus genus together with BNYVV, both vectored by P. betae. BSBMV is widely distributed only in the United States and it has not been reported yet in others countries. It was first identified in Texas as a sugar beet virus morphologically similar but serologically distinct to BNYVV. Subsequent sequence analysis of BSBMV RNAs evidenced similar genomic organization to that of BNYVV but sufficient molecular differences to distinct BSBMV and BNYVV in two different species (Rush et al., 2003). Benyviruses field isolates usually consist of four RNA species but some BNYVV isolates contain a fifth RNA. RNAs -1 contains a single long ORF encoding polypeptide that shares amino acid homology with known viral RNA-dependent RNA polymerases (RdRp) and helicases. RNAs -2 contains six ORFs: capsid protein (CP), one readthrough protein, triple gene block proteins (TGB) that are required for cell-to-cell virus movement and the sixth 14 kDa ORF is a post-translation gene silencing suppressor. RNAs -3 is involved on disease symptoms and is essential for virus systemic movement. BSBMV RNA-3 can be trans-replicated, trans-encapsidated by the BNYVV helper strain (RNA-1 and -2) (Ratti et al., 2009). BNYVV RNA-4 encoded one 31 kDa protein and is essential for vector interactions and virus transmission by P. betae (Rahim et al., 2007). BNYVV RNA-5 encoded 26 kDa protein that improve virus infections and accumulation in the hosts. We are interest on BSBMV effect on Rhizomania studies using powerful tools as full-length infectious cDNA clones. B-type full-length infectious cDNA clones are available (Quillet et al., 1989) as well as A/P-type RNA-3, -4 and -5 from BNYVV (unpublished). A-type BNYVV full-length clones are also available, but RNA-1 cDNA clone still need to be modified. During the PhD program, we start production of BSBMV full-length cDNA clones and we investigate molecular interactions between plant and Benyviruses exploiting biological, epidemiological and molecular similarities/divergences between BSBMV and BNYVV. During my PhD researchrs we obtained full length infectious cDNA clones of BSBMV RNA-1 and -2 and we demonstrate that they transcripts are replicated and packaged in planta and able to substitute BNYVV RNA-1 or RNA-2 in a chimeric viral progeny (BSBMV RNA-1 + BNYVV RNA-2 or BNYVV RNA-1 + BSBMV RNA-2). During BSBMV full-length cDNA clones production, unexpected 1,730 nts long form of BSBMV RNA-4 has been detected from sugar beet roots grown on BSBMV infected soil. Sequence analysis of the new BSBMV RNA-4 form revealed high identity (~100%) with published version of BSBMV RNA-4 sequence (NC_003508) between nucleotides 1-608 and 1,138-1,730, however the new form shows 528 additionally nucleotides between positions 608-1,138 (FJ424610). Two putative ORFs has been identified, the first one (nucleotides 383 to 1,234), encode a protein with predicted mass of 32 kDa (p32) and the second one (nucleotides 885 to 1,244) express an expected product of 13 kDa (p13). As for BSBMV RNA-3 (Ratti et al., 2009), full-length BSBMV RNA-4 cDNA clone permitted to obtain infectious transcripts that BNYVV viral machinery (Stras12) is able to replicate and to encapsidate in planta. Moreover, we demonstrated that BSBMV RNA-4 can substitute BNYVV RNA-4 for an efficient transmission through the vector P. betae in Beta vulgaris plants, demonstrating a very high correlation between BNYVV and BSBMV. At the same time, using BNYVV helper strain, we studied BSBMV RNA-4���s protein expression in planta. We associated a local necrotic lesions phenotype to the p32 protein expression onto mechanically inoculated C. quinoa. Flag or GFP-tagged sequences of p32 and p13 have been expressed in viral context, using Rep3 replicons, based on BNYVV RNA-3. Western blot analyses of local lesions contents, using FLAG-specific antibody, revealed a high molecular weight protein, which suggest either a strong interaction of BSBMV RNA4���s protein with host protein(s) or post translational modifications. GFP-fusion sequences permitted the subcellular localization of BSBMV RNA4���s proteins. Moreover we demonstrated the absence of self-activation domains on p32 by yeast two hybrid system approaches. We also confirmed that p32 protein is essential for virus transmission by P. betae using BNYVV helper strain and BNYVV RNA-3 and we investigated its role by the use of different deleted forms of p32 protein. Serial mechanical inoculation of wild-type BSBMV on C. quinoa plants were performed every 7 days. Deleted form of BSBMV RNA-4 (1298 bp) appeared after 14 passages and its sequence analysis shows deletion of 433 nucleotides between positions 611 and 1044 of RNA-4 new form. We demonstrated that this deleted form can���t support transmission by P. betae using BNYVV helper strain and BNYVV RNA-3, moreover we confirmed our hypothesis that BSBMV RNA-4 described by Lee et al. (2001) is a deleted form. Interesting after 21 passages we identifed one chimeric form of BSBMV RNA-4 and BSBMV RNA-3 (1146 bp). Two putative ORFs has been identified on its sequence, the first one (nucleotides 383 to 562), encode a protein with predicted mass of 7 kDa (p7), corresponding to the N-terminal of p32 protein encoded by BSBMV RNA-4; the second one (nucleotides 562 to 789) express an expected product of 9 kDa (p9) corresponding to the C-terminal of p29 encoded by BSBMV RNA-3. Results obtained by our research in this topic opened new research lines that our laboratories will develop in a closely future. In particular BSBMV p32 and its mutated forms will be used to identify factors, as host or vector protein(s), involved in the virus transmission through P. betae. The new results could allow selection or production of sugar beet plants able to prevent virus transmission then able to reduce viral inoculum in the soil.

Ricerche di campo per lo sviluppo della tecnologia del maschio sterile nella lotta ad Aedes albopictus (Skuse)

Aedes albopictus (Skuse), comunemente detta Zanzara Tigre, ha invaso, negli ultimi anni, molti paesi, soprattutto in modo passivo attraverso il commercio di pneumatici usati. Questa specie �� particolarmente adatta all'applicazione della tecnica dell'insetto sterile (SIT), basata su allevamento massale, sterilizzazione e rilascio in campo di un gran numero di maschi della specie vettrice. I maschi sterili rilasciati devono essere in grado di volare, di disperdersi sul territorio, di sopravvivere, di essere sessualmente attivi abbastanza a lungo per coprire il tempo tra una fase di rilascio e la successiva, di individuare le femmine vergini selvatiche e competere con successo per l'accoppiamento con i maschi selvatici. La dispersione e la sopravvivenza dei maschi di Ae. albopictus allevati in laboratorio, sono state studiate mediante tecniche di marcatura, rilascio e ricattura. Le catture sono state eseguite da tecnici specializzati, in un raggio di 350 m dal sito di rilascio. Gli esperimenti condotti hanno dimostrato che i maschi sono in grado di disperdersi, dal sito di rilascio, per circa 200 m ma la loro longevit�� in campo �� fortemente dipendente dalle condizioni climatiche. In studi di semi-campo e di campo �� stato valutato uno speciale dispositivo progettato per essere incluso nella stazione di rilascio dei maschi in grado di fornire loro fonti energetiche per migliorarne le prestazioni. I risultati ottenuti sono stati positivi. Studi di competitivit�� sono stati condotti in tunnel costruiti in un ambiente naturale al fine di validare un protocollo per studi sulla competitivit�� dei maschi in questo modello sperimentale. Maschi irraggiati mediante l'applicazione di raggi gamma alla dose di 30 Gy sono stati messi in competizione con maschi fertili per l'accoppiamento con femmine vergini con diversi rapporti. I risultati ottenuti hanno dimostrato le buone prestazioni e l'affidabilit�� di questo modello sperimentale rimanendo per�� irrisolto il problema dell���elevata variabilit��.

Sviluppo di mezzi e sistemi di sorveglianza e monitoraggio dei ditteri culicidi di importanza sanitaria

Nel corso degli ultimi anni le problematiche legate al ruolo vettore delle zanzare stanno emergendo sia per quanto riguarda l���uomo che gli animali allevati e selvatici. Diversi arbovirus come West Nile, Chikungunya, Usutu e Dengue, possono facilmente spostarsi a livello planetario ed essere introdotti anche nei nostri territori dove possono dare avvio a episodi epidemici. Le tecniche di monitoraggio e sorveglianza dei Culicidi possono essere convenientemente utilizzate per il rilevamento precoce dell���attivit�� virale sul territorio e per la stima del rischio di epidemie al fine dell���adozione delle opportune azioni di Sanit�� Pubblica. Io scopo della ricerca del dottorato �� inserito nel contesto dei temi di sviluppo del Piano regionale sorveglianza delle malattie trasmesse da vettori in Emilia Romagna. La ricerca condotta �� inquadrata prevalentemente sotto l���aspetto entomologico applicativo di utilizzo di dispositivi (trappole) che possano catturare efficacemente possibili insetti vettori. In particolare questa ricerca �� stata mirata allo studio comparativo in campo di diversi tipi di trappole per la cattura di adulti di zanzara, cercando di interpretare i dati per capire un potenziale valore di efficacia/efficienza nel rilevamento della circolazione virale e come supporto alla pianificazione della rete di sorveglianza dal punto di vista operativo mediante dispositivi adeguati alle finalit�� d���indagine. Si �� cercato di trovare un dispositivo idoneo, approfondendone gli aspetti operativi/funzionali, ai fini di cattura del vettore principale del West Nile Virus, cio�� la zanzara comune, da affiancare all���unica tipologia di trappola usata in precedenza. Le prove saranno svolte sia in campo che presso il laboratorio di Entomologia Medica Veterinaria del Centro Agricoltura Ambiente ���G. Nicoli��� di Crevalcore, in collaborazione con il Dipartimento di Scienze e Tecnologie Agroambientali della Facolt�� di Agraria dell���Universit�� di Bologna.

Development of sexing systems functional to mass production of Aedes albopictus sterile males

Aedes albopictus is a vector able to transmit several arboviruses. Due to its high impact on human health, it is important to develop an efficient control strategy for this pest. Nowadays, control based on chemical insecticides is limited by the number of available active principles and the occurrence of resistance. A valuable alternative to the conventional control strategies is the sterile insect technique (SIT) which relies on releasing sterile males of the target insect. Mating between wild females and sterile males results in no viable offspring. A crucial aspect of SIT is the production of a large number of sterile males with a low presence of females that can bite and transmit viruses. The present thesis aimed to find, implement and study the most reliable mechanical sex sorter and protocol to implement male productivity and reduce female contamination. In addition, I evaluated different variables and sorting protocols to enable female recovery for breeding purposes. Furthermore, I studied the creation of a hyper-protandric strain potentially able to produce only males. I also assessed the integration of artificial intelligence with an optical unit to identify sexes at the adult stage. All these applications helped to realise a mass production model in Italy with a potential weekly production of 1 million males. Moreover, I studied and applied for aerial sterile male release in an urban environment. This technology could allow the release of males in a wide area, overcoming environmental and urban obstacles. However, the development and application of drone technologies in a metropolitan area close to airports, such as in Bologna area, must fit specific requirements. Lastly, at R��union Island, during a Short Term Scientific Mission France (AIM-COST Action), Indian Ocean, I studied the Boosted SIT application. Coating sterile males with Pyriproxyfen may help spread the insecticide into the larval breeding sites.