Meccanismi replicativi e di regolazione dell'espressione genica di Parvovirus B19

Il Parvovirus B19, virus patogeno umano della famiglia Parvoviridae, mostra uno specifico tropismo per i precursori eritroidi e una limitata replicazione in alcune linee cellulari megacarioblastoidi. Allo scopo di sviluppare sistemi utili allo studio delle caratteristiche biologiche del virus, diversi laboratori si sono occupati della costruzione di cloni genomici di B19 dotati di competenza funzionale e capaci di generare virus infettante. Parte del presente lavoro ha riguardato l’analisi funzionale di diversi cloni genomici di B19 e ha permesso di caratterizzare le regioni terminali del virus e di identificare requisiti essenziali per la loro funzionalità. Nel contesto intracellulare, esistono differenti livelli di restrizione in relazione alla capacità della cellula di supportare la replicazione virale, non ancora del tutto caratterizzati. Inoltre si sono accumulate evidenze circa la capacità del B19 di instaurare persistenza in numerosi tessuti. Non sono ancora note le caratteristiche funzionali del genoma virale in questo stato, è possibile che il virus persista in forma silente e meccanismi epigenetici possano regolare tale silenziamento. In questo studio è stato analizzato lo stato di metilazione del genoma di B19 e il suo possibile effetto sul ciclo replicativo virale ed è stata investigata la possibile associazione del DNA virale agli istoni cellulari nel corso di infezione in vitro. I risultati ottenuti confermano la presenza di questi meccanismi epigenetici, potendo ipotizzare che giochino un importante ruolo nella regolazione della funzionalità virale e nell’interazione B19-cellula e siano un elemento critico per l’adattamento del virus nell’ambiente in cui si trova. Inoltre l’ipotesi che anche i microRNA possano assumere un importante significato nell’interazione B19-cellula è stata proposta da diversi lavori e nel presente studio è stata valutata la produzione di queste piccole molecole durante l'infezione in vitro, ricercando microRNA (cellulari e/o virali) con omologia di sequenza per il genoma di B19 e quindi specifici per il virus.

Costruzione di chimere molecolari dell'enzima Integrasi di HIV con attività idrolizzante delle LTR virali.

La Sindrome da Immunodeficienza Acquisita (AIDS o SIDA) causata da HIV-1 (Virus dell'Immunodeficienza umana) è caratterizzata dalla graduale compromissione del sistema immunitario del soggetto colpito. Le attuali terapie farmacologiche, purtroppo, non riescono a eliminare l'infezione a causa della comparsa di continui ceppi resistenti ai farmaci, e inoltre questi trattamenti non sono in grado di eliminare i reservoir virali latenti e permettere l'eradicazione definitiva del virus dall’organismo. E' in questo ambito che si colloca il progetto a cui ho lavorato principalmente in questi anni, cioè la creazione di una strategia per eradicare il provirus di HIV integrato nel genoma della cellula ospite. L'Integrasi di HIV-1 è un enzima che media l'integrazione del cDNA virale nel genoma della cellula ospite. La nostra idea è stata, quindi, quella di associare all'attività di legame dell'IN stessa, un'attività catalitica. A tal fine abbiamo creato una proteina chimerica costituita da un dominio DNA-binding, dato dall'Integrasi, e da un dominio con attività nucleasica fornito dall'enzima FokI. La chimera ottenuta è stata sottoposta a mutagenesi random mediante UV, ed è stata oggetto di selezione in vivo, al fine di ottenere una chimera capace di riconoscere, specificamente le LTR di HIV-1, e idrolizzare i siti di inserzione. Questo lavoro porterà a definire pertanto se l'IN di HIV può essere riprogrammata a catalizzare una nuova funzione mediante la sostituzione dell'attività del proprio dominio catalitico con quello di FokI.

HIV-1 infection: back and forth between virus and host.

The main obstacles to HIV-1 eradication are linked to the viral ability to evade immune system and establish a reservoir where virus is transcriptionally latent but able to replicate. IFN action and Restriction Factors (RFs) expression, dominant proteins that target multiple steps of the HIV-1 lifecycle, represent an early line of defence Because of their interplay with viral replication, we would like to study the relationship between RFs and the viral amount in latently infected cells.The first part of this project investigates the expression levels variations of a selected group of RFs (APOBEC3G, BST2, TRIM5α, MX2, SAMHD1, SERINC3/5, IFI16 and STING) in HIV-1 patients during the course of infection before and after ART administration by using Real Time qPCR. The second part of this study deals with the role of IFNα and IFNγ, and their role in the immune system disfunction that has been described during chronic inflammation associated to cancer, viral infection such as HIV-1, and autoimmune-disease. Immune Check Point proteins (ICPs) are a group of inhibitory receptors expressed on the cellular surface of immune cells and trigger immunosuppressive signaling pathways leading to T-cell exhaustion and the expression of immune checkpoint molecules (PD-1, PD-L1, TIGIT, LILRB2). The major aim of this project is to assess the clinical meaning of ICPs expression in HIV-1 chronically infected patients to better characterized their involvement in immune system disfunction.

New knowledge, diagnostic and control tools to limit the impact of viral nervous necrosis (VNN) in the Mediterranean aquaculture sector

The role of aquaculture in satisfying the global seafood demand is essential. The expansion of the aquaculture sector and the intensification of its activities have enhanced the circulation of infectious agents. Among these, the nervous necrosis virus (NNV) represents the most widespread in the Mediterranean basin. The NNV is responsible for a severe neuropathological condition named viral nervous necrosis (VNN), impacting hugely on fish farms due to the serious disease-associated losses. Therefore, it is fundamental to develop new strategies to limit the impact of VNN in this area, interconnecting several aspects of disease management, diagnosis and prevention. This PhD thesis project, focusing on aquatic animals’ health, deals with these topics. The first two chapters expand the knowledge on VNN epidemiology and distribution, showing the possibility of interspecies transmission, persistent infections and a potential carrier role for invertebrates. The third study expands the horizon of VNN diagnosis, by developing a quick and affordable multiplex RT-PCR able to detect and simultaneously discriminate between NNV variants, reducing considerably the time and costs of genotyping. The fourth study, with the development of a fluorescent in situ hybridization technique and its application to aquatic vertebrates and invertebrates’ tissues, contributes to expand the knowledge on NNV distribution at cellular level, localizing also the replication site of the virus. Finally, the last study dealing with an in vitro evaluation of the NNV susceptibility to a commercial biocide, stress the importance to implement proper disinfectant procedures in fish farms to prevent virus spread and disease outbreaks.