Impiego di cellule staminali in terapia veterinaria

Over the past few years, in veterinary medicine there has been an increased interest in understanding the biology of mesenchymal stem cells (MSCs). This interest comes from their potential clinical use especially in wound repair, tissue engineering and application in therapeutics fields, including regenerative surgery. MSCs can be isolated directly from bone marrow aspirates, adipose tissue, umbilical cord and various foetal tissues. In this study, mesenchymal stem cells were isolated from equine bone marrow, adipose tissue, cord blood, Wharton’s Jelly and, for the first time, amniotic fluid. All these cell lines underwent in vitro differentiation in chondrocytes, osteocytes and adipocytes. After molecular characterization, cells resulted positive for mesenchymal markers such as CD90, CD105, CD44 and negative for CD45, CD14, CD34 and CD73. Adipose tissue and bone marrow mesenchymal stem cells were successfully applied in the treatment of tendinitis in race horses. Furthermore, for the first time in the horse, skin wounds of septicemic foal, were treated applying amniotic stem cells. Finally, results never reported have been obtained in the present study, isolating mesenchymal stem cells from domestic cat foetal fluid and membranes. All cell lines underwent in vitro differentiation and expressed mesenchymal molecular markers.

Il Nilotinib nella terapia di prima linea della leucemia mieloide cronica

Background: Nilotinib is a potent and selective BCR-ABL inhibitor. The phase 3 ENESTnd trial demonstrated superior efficacy nilotinib vs imatinib, with higher and faster molecular responses. After 24 months, the rates of progression to accelerated-blastic phase (ABP) were 0.7% and 1.1% with nilotinib 300mg and 400mg BID, respectively, significantly lower compared to imatinib (4.2%). Nilotinib has been approved for the frontline treatment of Ph+ CML. With imatinib 400mg (IRIS trial), the rate of any event and of progression to ABP were higher during the first 3 years. Consequently, a confirmation of the durability of responses to nilotinib beyond 3 years is extremely important. Aims: To evaluate the response and the outcome of patients treated for 3 years with nilotinib 400mg BID as frontline therapy. Methods: A multicentre phase 2 trial was conducted by the GIMEMA CML WP (ClinicalTrials.gov.NCT00481052). Minimum 36-month follow-up data for all patients will be presented. Definitions: Major Molecular Response (MMR): BCR-ABL/ABL ratio <0,1%IS; Complete Molecular Response (CMR): undetectable transcript levels with ≥10,000 ABL transcripts; failures: according to the revised ELN recommendations; events: failures and treatment discontinuation for any reason. All the analysis has been made according to the intention-to-treat principle. Results: 73 patients enrolled: median age 51 years; 45% low, 41% intermediate and 14% high Sokal risk. The cumulative incidence of CCgR at 12 months was 100%. CCgR at each milestone: 78%, 96%, 96%, 95%, 92% at 3, 6, 12, 18 and 24 months, respectively. The overall estimated probability of MMR was 97%, while the rates of MMR at 3, 6, 12, 18 and 24 months were 52%, 66%, 85%, 81% and 82%, respectively. The overall estimated probability of CMR was 79%, while the rates of CMR at 12 and 24 months were 12% and 27%, respectively. No patient achieving a MMR progressed to AP. Only one patient progressed at 6 months to ABP and subsequently died (high Sokal risk, T315I mutation). Adverse events were mostly grade 1 or 2 and manageable with appropriate dose adaptations. During the first 12 months, the mean daily dose was 600-800mg in 74% of patients. The nilotinib last daily dose was as follows: 800mg in 46 (63%) patients, 600mg in 3 (4%) patients and 400mg in 18 (25%), 6 permanent discontinuations. Detail of discontinuation: 1 patient progressed to ABP; 3 patients had recurrent episodes of amylase and/or lipase increase (no pancreatitis); 1 patient had atrial fibrillation (unrelated to study drug) and 1 patient died after 32 months of mental deterioration and starvation (unrelated to study drug). Two patients are currently on imatinib second-line and 2 on dasatinib third-line. With a median follow-up of 39 months, the estimated probability of overall survival, progression-free survival and failure-free survival was 97%, the estimated probability of event-free survival was 91%. Conclusions: The rate of failures was very low during the first 3 years. Responses remain stable. The high rates of responses achieved during the first 12 months are being translated into optimal outcome for most of patients.

Immunohistochemical and Molecular Prognostic/Predictive Markers in Neoplastic Diseases

Traditional morphological examinations are not anymore sufficient for a complete evaluation of tumoral tissue and the use of neoplastic markers is of utmost importance. Neoplastic markers can be classified in: diagnostic, prognostic and predictive markers. Three markers were analyzed. 1) Insulin-like growth factor binding protein 2 (IGFBP2) was immunohistochemically examined in prostatic tissues: 40 radical prostatectomies from hormonally untreated patients with their preoperative biopsies, 10 radical prostatectomies from patients under complete androgen ablation before surgery and 10 simple prostatectomies from patients with bladder outlet obstruction. Results were compared with α-methylacyl-CoA racemase (AMACR). IGFBP2 was expressed in the cytoplasm of untreated adenocarcinomas and, to a lesser extent, in HG-PIN; the expression was markedly lower in patients after complete androgen ablation. AMACR was similarly expressed in both adenocarcinoma and HG-PIN, the level being similar in both lesions; the expression was slightly lower in patients after complete androgen ablation. IGFBP2 may be used a diagnostic marker of prostatic adenocarcinomas. 2) Heparan surface proteoglycan immunohistochemical expression was examined in 150 oral squamous cell carcinomas. Follow up information was available in 93 patients (range: 6-34 months, mean: 19±7). After surgery, chemotherapy was performed in 8 patients and radiotherapy in 61 patients. Multivariate and univariate overall survival analyses showed that high expression of syndecan-1 (SYN-1) was associated with a poor prognosis. In patients treated with radiotherapy, such association was higher. SYN-1 is a prognostic marker in oral squamous cell carcinomas; it may also represent a predictive factor for responsiveness to radiotherapy. 3) EGFR was studied in 33 pulmonary adenocarcinomas with traditional DNA sequencing methods and with two mutation-specific antibodies. Overall, the two antibodies had 61.1% sensitivity and 100% specificity in detecting EGFR mutations. EGFR mutation-specific antibodies may represent a predictive marker to identify patients candidate to tyrosine kinase inhibitors therapy.

La terapia demetilante con 5-azacitidina nelle sindromi mielodisplastiche: esperienza clinica del Nostro Istituto e correlazione con i dati biologici

Sulla base delle evidenze della letteratura (Fenaux, 2009; Lyons, JCO 2009), a partire da Settembre 2004 nel Nostro Istituto sono stati trattati 57 pazienti affetti da Sindrome Mielodisplastica (MDS) mediante terapia demetilante con 5-Azacitidina. Sono stati utilizzati differenti regimi terapeutici a seconda della classe di rischio IPSS: i pazienti a rischio basso/intermedio-1 hanno ricevuto Azacitidina 75 mg/mq/die sottocute per 5 giorni/mese (schema 5) per 8 cicli; i pazienti a rischio alto/intermedio-2 hanno ricevuto Azacitidina 50 mg/mq/die sottocute per 10 giorni/mese (schema 5+2+5) o Azacitidina 75 mg/mq/die per 7 giorni/mese (schema 7) fino a perdita della risposta. Su una casistica totale di 57 pazienti (15 a rischio basso/int-1; 41 rischio alto/int-2), l’87.7% (50 pazienti) sono risultati valutabili. Tra questi le risposte osservate sono state del 68% (34 pazienti), di cui il 14% (7 pazienti) ha ottenuto una Remissione Completa (CR) ed il 54% (27 pazienti) ha ottenuto un Hematologic Improvement (HI). La valutazione della risposta è stata eseguita secondo i criteri dell’International Working Group 2006 (IWG, Cheeson 2006). Le principali tossicità osservate sono state rappresentate da reazioni cutanee locali nel sito d’iniezione, tossicità gastrointestinale (stipsi e/o diarrea), mielotossicità, neutropenia febbrile, sepsi (3 pazienti). Tra i pazienti trattati abbiamo osservato la presenza di risposta ematologica prolungata (≥ 20 mesi) in 10 pazienti (20% dei pazienti valutabili). Inoltre, grazie alla collaborazione con il Dipartimento di Anatomia Umana dell’Università di Bologna (Prof. L. Cocco, Dott.ssa M.Y. Follo), tutti i pazienti trattati sono stati valutati per i livelli di espressione genica e metilazione del gene della fosfolipasi PI-PLC-beta1. I dati biologici così ottenuti sono stati correlati con quelli clinici, evidenziando la presenza di una correlazione tra i livelli di espressione genica e mutilazione della PI-PLC-beta1 e la risposta alla terapia demetilante con 5-Azacitidina.

Studio della patogenesi di HIV-1 nel compartimento osseo: effetti della terapia antiretrovirale convenzionale e nuovi approcci all'eradicazione

L’obiettivo della tesi è studiare il virus HIV-1 in relazione alle alterazioni sistemiche, riscontrate nel paziente HIV-infetto, in particolare alterazioni a carico del sistema scheletrico, indotte dal virus o dall’azione dei farmaci utilizzati nella terapia antiretrovirale (HAART). L’incidenza dell’osteoporosi nei pazienti HIV-positivi è drammaticamente elevata rispetto alla popolazione sana. Studi clinici hanno evidenziato come alcuni farmaci, ad esempio inibitori della proteasi virale, portino alla compromissione dell’omeostasi ossea, con aumento del rischio fratturativo. Il nostro studio prevede un follow-up di 12 mesi dall’inizio della HAART in una coorte di pazienti naïve, monitorando diversi markers ossei. I risultati ottenuti mostrano un incremento dei markers metabolici del turnover osseo, confermando l’impatto della HAART sull’omeostasi ossea. Successivamente abbiamo focalizzato la nostra attenzione sugli osteoblasti, il citotipo che regola la sintesi di nuova matrice ossea. Gli esperimenti condotti sulla linea HOBIT mettono in evidenza come il trattamento, in particolare con inibitori della proteasi, porti ad apoptosi nel caso in cui vi sia una concentrazione di farmaco maggiore di quella fisiologica. Tuttavia, anche concentrazioni fisiologiche di farmaci possono regolare negativamente alcuni marker ossei, come ALP e osteocalcina. Infine esiste la problematica dell’eradicazione di HIV-1 dai reservoirs virali. La HAART riesce a controllare i livelli viremici, ciononostante diversi studi propongono alcuni citotipi come potenziali reservoir di infezione, vanificando l’effetto della terapia. Abbiamo, perciò, sviluppato un nuovo approccio molecolare all’eradicazione: sfruttare l’enzima virale integrasi per riconoscere in modo selettivo le sequenze LTR virali per colpire il virus integrato. Fondendo integrasi e l’endonucleasi FokI, abbiamo generato diversi cloni. Questi sono stati transfettati stabilmente in cellule Jurkat, suscettibili all’infezione. Una volta infettate, abbiamo ottenuto una significativa riduzione dei markers di infezione. Successivamente la transfezione nella linea linfoblastica 8E5/LAV, che porta integrata nel genoma una copia di HIV, ha dato risultati molto incoraggianti, come la forte riduzione del DNA virale integrato.

Analisi fosfo-proteomica di campioni di tumore: il problema della stratificazione dei pazienti ed eterogeneità intra-tumorale nell'era della terapia personalizzata

Nella presente tesi indaghiamo la potenzialità di LCM e Reverse Phase Protein microarray negli studi clinici. Si analizza la possibilità di creare una bio banca con line cellular primarie, al fine di conseguire drug test di sensibilità prima di decidere il trattamento da somministrare ai singoli pazienti. Sono stati ottenuti profili proteomici da biopsie pre e post terapia. I risultati dimostrano che questa piattaforma mostra il meccanismo di resistenza acquisito durante la terapia biologica. Questo ci ha portato ad analizzare una possibile stratificazione per pazienti con mCRC . I dati hanno rivelato distinti pathway di attivazione tra metastasi resecabile e non resecabili. I risultati mostrano inoltre due potenziali bersagli farmacologici. Ma la valutazione dell'intero tumore tramite singole biopsie sembra essere un problema a causa dell’eterogeneità intratumorale a livello genomico. Abbiamo indagato questo problema a livello dell'architettura del segnale in campioni di mCRC e ccRCC . I risultati indicano una somiglianza complessiva nei profili proteomici all'interno dello stesso tumore. Considerando che una singola biopsia è rappresentativa di un intera lesione , abbiamo studiato la possibilità di creare linee di cellule primarie, per valutare il profilo molecolare di ogni paziente. Fino ad oggi non c'era un protocollo per creare linee cellulari immortalizzate senza alcuna variazione genetica . abbiamo cosiderato, però, l'approccio innovativo delle CRCs. Ad oggi , non è ancora chiaro se tali cellule mimino il profilo dei tessuti oppure I passaggi in vitro modifichino i loro pathways . Sulla base di un modello di topo , i nostri dati mostrano un profilo di proteomica simile tra le linee di cellule e tessuti di topo LCM. In conclusione, i nostri dati dimostrano l'utilità della piattaforma LCM / RPPA nella sperimentazione clinica e la possibilità di creare una bio - banca di linee cellulari primarie, per migliorare la decisione del trattamento.

Specificità, efficacia e risposte adattative mediate da mutazioni dell'oncosoppressore TP53 degli inibitori del Complesso I mitocondriale nella terapia oncologica personalizzata: dai meccanismi molecolari allo sviluppo di modelli preclinici avanzati

L'inibizione del complesso respiratorio I (CI) è una strategia antitumorale emergente, sebbene la specificità e l’efficacia di nuovi farmaci restino poco investigate. La generazione di modelli cellulari tumorali nulli per il CI rivela la specificità di EVP 4593 e BAY 872243 nell’indurre gli effetti antiproliferativi non associati all’apoptosi, selettivamente via CI, riducendo eventuali effetti collaterali. Studi preliminari in vivo evidenziano un rallentamento della crescita tumorale negli animali trattati con EVP 4593, il quale emerge come l’inibitore più potente. Per il suo ruolo nella riprogrammazione metabolica, e la sua elevata frequenza di mutazioni nelle neoplasie umane, sono stati investigati i potenziali meccanismi di adattamento alla terapia anti-CI sulla base dello stato mutazionale di TP53. L’auxotrofia da aspartato, un hallmark metabolico delle cellule tumorali con un danno al CI, causa un blocco della sintesi proteica mTORC1-dipendente nelle linee cellulari con una p53 mutata o nulla, inducendo un collasso metabolico. Viceversa, l'attivazione del sensore energetico AMPK promuove un recupero parziale della sintesi di aspartato in linee cellulari con la forma wild type di P53, che è in grado di sostenere una migliore anaplerosi attraverso SCO2, fattore di assemblaggio del complesso respiratorio IV. Al fine di traslare questi risultati in un modello preclinico, si è ottimizzato l’ottenimento di colture di tumori umani espiantati tramite il bioreattore U-CUP. Il modello scelto è stato quello di carcinoma sieroso ad alto grado dell’ovaio (HGSOC), a partire da tessuto congelato, per l’elevata frequenza di mutazioni driver in TP53. I tessuti congelati preservano l'eterogeneità delle componenti cellulari del tessuto di origine e sono caratterizzati da cellule in attiva proliferazione senza attivazione di apoptosi. Dati preliminari mostrano un trend di riduzione dell’area tumorale nei tessuti trattati con EVP 4593 e supportano l’utilizzo del modello preclinico nello studio di nuovi inibitori del CI sfruttando materiale primario di pazienti oncologici.