Survey on the spirilar flora of Lagomorphs

Members of the genera Campylobacter and Helicobacter have been in the spotlight in recent decades because of their status as animals and/or humans pathogens, both confirmed and emerging, and because of their association with food-borne and zoonotic diseases. First observations of spiral shaped bacteria or Campylobacter-like organisms (CLO) date back to the end of the 19th century, however the lack of adequate isolation methods hampered further research. With the introduction of methods such as selective media and a filtration procedure during the 1970s led to a renewed interest in Campylobacter, especially as this enabled elucidation of their role in human hosts. On the other hand the classification and identification of these bacteria was troublesome, mainly because of the biochemical inertness and fastidious growth requirements. In 1991, the taxonomy of Campylobacter and related organisms was thoroughly revised, since this revision several new Campylobacter and Helicobacter species have been described. Moreover, thanks to the introduction of a polyphasic taxonomic practice, the classification of these novel species is well-founded. Indeed, a polyphasic approach was here followed for characterizing eight isolates obtained from rabbits epidemiologically not correlated and as a result a new Campylobacter species was proposed: Campylobacter cuniculorum (Chapter 1). Furthermore, there is a paucity of data regarding the occurrence of spiral shaped enteric flora in leporids. In order to define the prevalence both of this new species and other CLO in leporids (chapter 2), a total of 85 whole intestinal tracts of rabbits reared in 32 farms and 29 capture hares, epidemiologically not correlated, were collected just after evisceration at the slaughterhouse or during necroscopy. Examination and isolation methods were varied in order to increase the sensibility level of detection, and 100% of rabbit farms resulted positive for C. cuniculorum in high concentrations. Moreover, in 3.53% of the total rabbits examined, a Helicobacter species was detected. Nevertheless, all hares resulted negative both for Campylobacter or Helicobacter species. High prevalence of C. cuniculorum were found in rabbits, and in order to understand if this new species could play a pathological role, a study on some virulence determinants of C. cuniculorum was conducted (Chapter 3). Although this new species were able to adhere and invade, exert cytolethal distending toxin-like effects although at a low titre, a cdtB was not detected. There was no clear relationship between source of isolation or disease manifestation and possession of statistically significantly levels of particular virulence-associated factors although, cell adhesion and invasion occurred. Furthermore, antibiotic susceptibility was studied (chapter 4) in Campylobacter and in Escherichia coli strains, isolated from rabbits. It was possible to find acquired resistance of C. cuniculorum to enrofloxacin, ciprofloxacin and erytromycin. C. coli isolate was susceptible to all antimicrobial tested and moreover it is considered as a wild-type strain. Moreover, E. coli was found at low caecal concentration in rabbits and 30 phenotypes of antibiotic resistance were founded as well as the high rate of resistances to at least one antibiotic (98.1%). The majority of resistances were found from strains belonging to intensive farming system. In conclusion, in the course of the present study a new species isolated from rabbits was described, C. cuniculorum, and its high prevalence was established. Nevertheless, in hare samples no Campylobacter and Helicobacter species were detected. Some virulence determinants were further analyzed, however further studied are needed to understand the potential pathogenicity of this new species. On the other hand, antimicrobial susceptibility was monitored both in C. cuniculorum and indicator bacteria and acquired resistance was observed towards some antibiotics, indicating a possible role of rabbitries in the diffusion of antibiotic resistance. Further studies are necessary to describe and evaluate the eventual zoonotic role of Campylobacter cuniculorum.

Il coniglio come modello sperimentale per lo studio degli effetti neurologici indotti da Cobalto

Sono stati studiati gli effetti tossici dell’esposizione cronica a cobalto e cromo. In passato, questa tossicità, che colpiva lavoratori esposti per ragioni occupazionali, è stata un problema molto sentito. Tuttavia, recenti pubblicazioni hanno descritto una specifica tossicità mediata da elevati livelli di cobalto e cromo, anche in pazienti portatori di protesi metalliche, quali gli impianti d’anca. Anche se sintomi clinici tra cui, cecità, sordità e neuropatia periferica, suggeriscono uno specifico neurotropismo, ancora poco è conosciuto delle basi neuropatologiche di questo processo ed oltretutto non ne è ancora stata apportata un’evidenza sperimentale. In questo progetto di ricerca, quindi, si è voluto approfondire il meccanismo patogenetico da cui scaturiscono tali sintomi neurologici, utilizzando come modello sperimentale il coniglio. Conigli New Zealand White sono stati trattati con dosi endovenose ripetute di cobalto e cromo, inoculati singolarmente od in associazione tra loro. Nessuna evidente alterazione clinica o patologica è stata associata alla somministrazione di solo cromo, nonostante gli elevati livelli in sangue e tessuti, mentre i trattati con cobalto-cromo o solo cobalto hanno mostrato segni clinici gravanti sul sistema vestibolo-cocleare; il cobalto, quindi, è stato identificato come il maggiore elemento scatenante neurotossicità. Inoltre all’esame istopatologico gli animali hanno mostrato severa deplezione delle cellule gangliari retiniche e cocleari, assieme a danno al nervo ottico e perdita di cellule sensitive capellute dell’orecchio. È risultato infine evidente che la gravità delle alterazioni è stata correlata al dosaggio ed al tempo di esposizione; dati questi che confermano, quindi, le precedenti osservazioni fatte su pazienti umani esposti a rilascio abnorme di cobalto e cromo da usura di protesi d’anca. È stato ipotizzato che il cobalto agisca sui mitocondri provocando l’incremento di produzione di specie reattive dell’ossigeno e il rilascio di fattori proapoptotici, causando sulle cellule neuronali un danno proporzionale al loro fabbisogno energetico e grado di mielinizzazione.

Trattamento delle lesioni osteocondrali di grado I e II mediante infiltrazione intra-articolare di fattori di crescita autologhi (plasma rich in platelets)

The use of Platelet-rich plasma (PRP), a platelet concentrate made of autogenous blood, is becoming use in the treatment of some orthopaedic diseases. The aim of this study is to assess the effect of PRP on articular cartilage defects in a rabbit model (10 subjects). Twenty osteochondral defects created in the femoropatellar groove, were in ten cases left untreated and in ten cases treated with autogenous PRP. PRP was obtained using a double centrifugation of the rabbit’s blood harvested before the operation. 30 days after the lesion was made in both knee, the left one in each rabbit was treated by a PRP injection, followed by other two injection at 45 and 60 days. Tissue specimens were assessed by macroscopic examination and histological evaluation, that showed a better healing of the lesions in the knee treated with PRP injections.

Valutazione sperimentale della rigenerazione cartilaginea articolare dopo stimolazione biofisica con campi elettromagnetici pulsati in associazione a trattamenti chirurgici

Diverse tecniche di ingegneria tessutale sono state sviluppate per promuovere la riparazione delle lesioni della cartilagine articolare. Nonostante i buoni risultati clinici a breve termine, il tessuto rigenerato fallisce nel tempo poiché non possiede le caratteristiche meccaniche e funzionali della cartilagine articolare nativa. La stimolazione con campi elettromagnetici pulsati (CEMP) rappresenta un approccio terapeutico innovativo. I CEMP aumentano l’attività anabolica dei condrociti con conseguente incremento della sintesi della matrice, e limitano l’effetto catabolico delle citochine pro-infiammatorie riducendo la degradazione della cartilagine nel microambiente articolare. I CEMP agiscono mediante l’up-regolazione dei recettori adenosinici A2A potenziando il loro affetto anti-infiammatorio. Lo scopo di questo studio è stato quello di valutare l’effetto della stimolazione con CEMP sulla guarigione di difetti osteocondrali in un modello sperimentale nel coniglio. Un difetto osteocondrale del diametro di 4mm è stato eseguito nel condilo femorale mediale di entrambe le ginocchia di 20 conigli. A destra la lesione è stata lasciata a guarigione spontanea mentre a sinistra e stata trattata mediante inserimento di scaffold collagenico o trapianto di cellule mesenchimali midollari sul medesimo scaffold precedentemente prelevate dalla cresta iliaca. In base al trattamento eseguito 10 animali sono stati stimolati con CEMP 4 ore/die per 40 giorni mentre altri 10 hanno ricevuto stimolatori placebo. Dopo il sacrificio a 40 giorni, sono state eseguite analisi istologiche mediante un punteggio di O’Driscoll modificato. Confrontando le lesioni lasciate a guarigione spontanea, la stimolazione con CEMP ha migliorato significativamente il punteggio (p=0.021). Lo stesso risultato si è osservato nel confronto tra lesioni trattate mediante trapianto di cellule mesenchimali midollari (p=0.032). Nessuna differenza è stata osservata tra animali stimolati e placebo quando la lesione è stata trattata con il solo scaffold (p=0.413). La stimolazione con CEMP è risultata efficace nel promuovere la guarigione di difetti osteocartilaginei in associazione a tecniche chirurgiche di ingegneria tessutale.

Studio sulla perfusione di fegato e milza in animali non convenzionali mediante ecografia e tomografia computerizzata (TC) con mezzo di contrasto

Il presente studio rappresenta la prima applicazione della tecnica CEUS in alcune delle più diffuse specie non convenzionali, nonché la prima nei rettili. In particolare è stata investigata la perfusione di fegato e milza in 10 conigli, 10 furetti e il fegato in 8 iguane. Per quanto riguarda i mammiferi, la tecnica è risultata di facile attuazione e i risultati ottenuti erano equiparabili a quelli documentati per i piccoli animali. Maggiore variabilità si è messa in evidenza a livello splenico in entrambe le specie e nel coniglio rispetto al furetto. Nelle iguane è stata necessaria una modifica del protocollo a seguito dei tempi più lunghi delle fasi di wash in e di wash out. Le curve ottenute erano caratterizzate da picchi più bassi e TTP più lunghi, con wash out incompleto anche dopo 10 minuti di indagine. Nelle iguane l’indagine del fegato è stata approfondita grazie all’esecuzione di TC dinamiche con MDC, studio pioneristico per quanto riguarda la medicina dei rettili. L’esecuzione è avvenuta senza problemi in anestesia generale. Diffusione del MDC e conseguenti variazione di HU a livello aortico e epatico sono state considerate contemporaneamente, con costruzione di curve HU-tempo piuttosto ripetibili, entrambe caratterizzate da un wash in rapido, un picco, particolarmente alto a livello aortico, e da una fase di wash out più lento, anche qui incompleto dopo i 600 secondi di indagine. Una certa variabilità è stata notata in tre individui, risultato attendibile conseguentemente alla forte dipendenza da fattori intriseci ed estrinseci del metabolismo e della funzionalità epatica dei rettili. L’intero protocollo è stato applicato in un furetto e due iguane patologiche, al fine di evidenziare le potenzialità cliniche delle tecniche. Sebbene il numero esiguo di casi non permetta di trarre conclusioni a questo riguardo, l’ultimo capitolo della tesi vuole essere uno spunto per studi futuri.