Biochemistry in healthy and neoplastic human tissues: metabolic alteration revealed by HR-MAS nuclear magnetic resonance spectroscopy

This thesis is focused on the metabolomic study of human cancer tissues by ex vivo High Resolution-Magic Angle Spinning (HR-MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. This new technique allows for the acquisition of spectra directly on intact tissues (biopsy or surgery), and it has become very important for integrated metabonomics studies. The objective is to identify metabolites that can be used as markers for the discrimination of the different types of cancer, for the grading, and for the assessment of the evolution of the tumour. Furthermore, an attempt to recognize metabolites, that although involved in the metabolism of tumoral tissues in low concentration, can be important modulators of neoplastic proliferation, was performed. In addition, NMR data was integrated with statistical techniques in order to obtain semi-quantitative information about the metabolite markers. In the case of gliomas, the NMR study was correlated with gene expression of neoplastic tissues. Chapter 1 begins with a general description of a new “omics” study, the metabolomics. The study of metabolism can contribute significantly to biomedical research and, ultimately, to clinical medical practice. This rapidly developing discipline involves the study of the metabolome: the total repertoire of small molecules present in cells, tissues, organs, and biological fluids. Metabolomic approaches are becoming increasingly popular in disease diagnosis and will play an important role on improving our understanding of cancer mechanism. Chapter 2 addresses in more detail the basis of NMR Spectroscopy, presenting the new HR-MAS NMR tool, that is gaining importance in the examination of tumour tissues, and in the assessment of tumour grade. Some advanced chemometric methods were used in an attempt to enhance the interpretation and quantitative information of the HR-MAS NMR data are and presented in chapter 3. Chemometric methods seem to have a high potential in the study of human diseases, as it permits the extraction of new and relevant information from spectroscopic data, allowing a better interpretation of the results. Chapter 4 reports results obtained from HR-MAS NMR analyses performed on different brain tumours: medulloblastoma, meningioms and gliomas. The medulloblastoma study is a case report of primitive neuroectodermal tumor (PNET) localised in the cerebellar region by Magnetic Resonance Imaging (MRI) in a 3-year-old child. In vivo single voxel 1H MRS shows high specificity in detecting the main metabolic alterations in the primitive cerebellar lesion; which consist of very high amounts of the choline-containing compounds and of very low levels of creatine derivatives and N-acetylaspartate. Ex vivo HR-MAS NMR, performed at 9.4 Tesla on the neoplastic specimen collected during surgery, allows the unambiguous identification of several metabolites giving a more in-depth evaluation of the metabolic pattern of the lesion. The ex vivo HR-MAS NMR spectra show higher detail than that obtained in vivo. In addition, the spectroscopic data appear to correlate with some morphological features of the medulloblastoma. The present study shows that ex vivo HR-MAS 1H NMR is able to strongly improve the clinical possibility of in vivo MRS and can be used in conjunction with in vivo spectroscopy for clinical purposes. Three histological subtypes of meningiomas (meningothelial, fibrous and oncocytic) were analysed both by in vivo and ex vivo MRS experiments. The ex vivo HR-MAS investigations are very helpful for the assignment of the in vivo resonances of human meningiomas and for the validation of the quantification procedure of in vivo MR spectra. By using one- and two dimensional experiments, several metabolites in different histological subtypes of meningiomas, were identified. The spectroscopic data confirmed the presence of the typical metabolites of these benign neoplasms and, at the same time, that meningomas with different morphological characteristics have different metabolic profiles, particularly regarding macromolecules and lipids. The profile of total choline metabolites (tCho) and the expression of the Kennedy pathway genes in biopsies of human gliomas were also investigated using HR-MAS NMR, and microfluidic genomic cards. 1H HR-MAS spectra, allowed the resolution and relative quantification by LCModel of the resonances from choline (Cho), phosphorylcholine (PC) and glycerolphorylcholine (GPC), the three main components of the combined tCho peak observed in gliomas by in vivo 1H MRS spectroscopy. All glioma biopsies depicted an increase in tCho as calculated from the addition of Cho, PC and GPC HR-MAS resonances. However, the increase was constantly derived from augmented GPC in low grade NMR gliomas or increased PC content in the high grade gliomas, respectively. This circumstance allowed the unambiguous discrimination of high and low grade gliomas by 1H HR-MAS, which could not be achieved by calculating the tCho/Cr ratio commonly used by in vivo 1H MR spectroscopy. The expression of the genes involved in choline metabolism was investigated in the same biopsies. The present findings offer a convenient procedure to classify accurately glioma grade using 1H HR-MAS, providing in addition the genetic background for the alterations of choline metabolism observed in high and low gliomas grade. Chapter 5 reports the study on human gastrointestinal tract (stomach and colon) neoplasms. The human healthy gastric mucosa, and the characteristics of the biochemical profile of human gastric adenocarcinoma in comparison with that of healthy gastric mucosa were analyzed using ex vivo HR-MAS NMR. Healthy human mucosa is mainly characterized by the presence of small metabolites (more than 50 identified) and macromolecules. The adenocarcinoma spectra were dominated by the presence of signals due to triglycerides, that are usually very low in healthy gastric mucosa. The use of spin-echo experiments enable us to detect some metabolites in the unhealthy tissues and to determine their variation with respect to the healthy ones. Then, the ex vivo HR-MAS NMR analysis was applied to human gastric tissue, to obtain information on the molecular steps involved in the gastric carcinogenesis. A microscopic investigation was also carried out in order to identify and locate the lipids in the cellular and extra-cellular environments. Correlation of the morphological changes detected by transmission (TEM) and scanning (SEM) electron microscopy, with the metabolic profile of gastric mucosa in healthy, gastric atrophy autoimmune diseases (AAG), Helicobacter pylori-related gastritis and adenocarcinoma subjects, were obtained. These ultrastructural studies of AAG and gastric adenocarcinoma revealed lipid intra- and extra-cellularly accumulation associated with a severe prenecrotic hypoxia and mitochondrial degeneration. A deep insight into the metabolic profile of human healthy and neoplastic colon tissues was gained using ex vivo HR-MAS NMR spectroscopy in combination with multivariate methods: Principal Component Analysis (PCA) and Partial Least Squares Discriminant Analysis (PLS-DA). The NMR spectra of healthy tissues highlight different metabolic profiles with respect to those of neoplastic and microscopically normal colon specimens (these last obtained at least 15 cm far from the adenocarcinoma). Furthermore, metabolic variations are detected not only for neoplastic tissues with different histological diagnosis, but also for those classified identical by histological analysis. These findings suggest that the same subclass of colon carcinoma is characterized, at a certain degree, by metabolic heterogeneity. The statistical multivariate approach applied to the NMR data is crucial in order to find metabolic markers of the neoplastic state of colon tissues, and to correctly classify the samples. Significant different levels of choline containing compounds, taurine and myoinositol, were observed. Chapter 6 deals with the metabolic profile of normal and tumoral renal human tissues obtained by ex vivo HR-MAS NMR. The spectra of human normal cortex and medulla show the presence of differently distributed osmolytes as markers of physiological renal condition. The marked decrease or disappearance of these metabolites and the high lipid content (triglycerides and cholesteryl esters) is typical of clear cell renal carcinoma (RCC), while papillary RCC is characterized by the absence of lipids and very high amounts of taurine. This research is a contribution to the biochemical classification of renal neoplastic pathologies, especially for RCCs, which can be evaluated by in vivo MRS for clinical purposes. Moreover, these data help to gain a better knowledge of the molecular processes envolved in the onset of renal carcinogenesis.

An alternative B cell development program

Two major types of B cells, the antibody-producing cells of the immune system, are classically distinguished in the spleen: marginal zone (MZ) and follicular (FO). In addition, FO B cells are subdivided into FO I and FO II cells, based on the amount of surface IgM. MZ B cells, which surround the splenic follicles, rapidly produce IgM in response to blood-borne pathogens without T cell help, while T cell-dependent production of high affinity, isotype-switched antibodies is ascribed to FO I cells. The significance of FO II cells and the mechanism underlying B cell fate choices are unclear. We showed that FO II cells express more Sca1 than FO I cells and originate from a distinct B cell development program, marked by high expression of Sca1. MZ B cells can derive from the “canonical” Sca1lo pathways, as well as from the Sca1hi program, although the Sca1hi program shows a stronger MZ bias than the Sca1lo program, and extensive phenotypic plasticity exists between MZ and FO II, but not between MZ and FO I cells. The Sca1hi program is induced by hematopoietic stress and generates B cells with an Igλ-enriched repertoire. In aged mice, the canonical B cell development pathway is impaired, while the Sca1hi program is increased. Furthermore, we showed that a population of unknown function, defined as Lin-c-kit+Sca1+ (LSK-), contains early lymphoid precursors, with primarily B cell potential in vivo. Our data suggest that LSK- cells may represent a distinct precursor for the Sca1hi program in the bone marrow.

ATG based combination therapy - a novel clinically relevant approach to promote regulation and induce long-term allograft survival

Regulatory T cells (Treg) actively regulate alloimmune responses and promote transplantation tolerance. Polyclonal anti-thymocyte globulin (ATG), a widely used induction therapy in clinical organ transplantation, depletes peripheral T cells. However, resistance to tolerance induction is seen with certain T cell depleting strategies and is attributed to alterations in the balance of naïve, memory and regulatory T cells. Here we report a novel reagent, murine ATG (mATG), depletes T cells but preferentially spares CD25+ natural Tregs which limit skewing of T cell repertoire toward T-effector-memory (Tem) phenotype among the recovering T cells. T-cell depletion with mATG combined with CTLA4Ig and Sirolimus synergize to prolong graft survival by tipping the Treg/Tem balance further in favor of Tregs by preserving Tregs, facilitating generation of new Tregs by a conversion mechanism and limiting Tem expansion in response to alloantigen and homeostatic proliferation. These results provide the rationale for translating such novel combination therapies to promote tolerance in primate and human organ transplantation.

Celti e Reti tra V e I sec. a.C. Oggetti tipo LaTène all'interno della cerchia culturale Fritzens-Sanzeno (arco alpino centro-orientale)

The study of the objects LaTène type found in middle-eastern alpine region (Trentino Alto Adige-Südtirol, Engadina, North Tirol, Voralberg and Villach basin) is aimed to a better comprehension of the complex net of relationships established among the Celts, settled both in the central Europe territories and, since the IV century b.C., in the Po Plain, and the local populations. The ancient authors, who called the inhabitants of this area Raeti, propose for this territory the usual pattern according to which, the population of a region was formed consequently to a migration or was caused by the hunting of pre-existing peoples. The archaeologists, in the last thirty years, recognized a cultural facies typical of the middle-eastern alpine territory during the second Iron Age, and defined that as Fritzens-Sanzeno culture (from the sites of Fritzens, Inn valley, and Sanzeno, Non Valley). The so-called Fritzens-Sanzeno culture spread out without breaks from the material culture of the final Bronze Age and the first Iron Age. This local substratum, characterized by a ceramic repertoire strongly standardized, by peculiar architectural solutions and by a particular typology of rural sacred places (Brandopferplätze), accepted, above all during the second Iron Age, the strong influences coming from the Etruscan world and from the Celtic one (evident in the presence of objects of ornament, of glass artefacts, of elements of the weaponry and of coins). The objects LaTène type become, with different degrees of reliability, important markers of the relationships existing between the Celts and the Raeti, although the ways of interaction (cultural influence, people's movements, commercial exchanges, gifts among élites etc.) is not still clear. The revision of published data and the study of unpublished materials allows to define a rich and articulated picture both to chronological level and to territorial one.

Macchine esperienziali: Narrativa, cognizione e atto di lettura

La mia tesi si riallaccia al dibattito teorico-letterario contemporaneo sulla possibilità di un approccio cognitivo alla narrativa e alla letteratura in particolare. Essa si propone di esplorare il rapporto tra narrazione ed esperienza, ridefinendo il concetto di “esperienzialità” della narrativa introdotto da Monika Fludernik nel suo Towards a “Natural” Narratology (1996). A differenza di Fludernik, che ha identificato l’esperienzialità con la rappresentazione dell’esperienza dei personaggi, la mia trattazione assegna un ruolo di primo piano al lettore, cercando di rispondere alla domanda: perché leggere una storia è – o si costituisce come – un’esperienza? L’intuizione dietro tutto ciò è che le teorizzazioni dell’esperienza e della coscienza nella filosofia della mente degli ultimi venti anni possano gettare luce sull’interazione tra lettori e testi narrativi. Il mio punto di riferimento principale è la scienza cognitiva “di seconda generazione”, secondo cui l’esperienza è un relazionarsi attivo e corporeo al mondo. La prima parte del mio studio è dedicata all’intreccio tra la narrativa e quello che chiamo lo “sfondo esperienziale” di ogni lettore, un repertorio di esperienze già note ai lettori attraverso ripetute interazioni con il mondo fisico e socio-culturale. Mi soffermo inoltre sul modo in cui relazionarsi a un testo narrativo può causare cambiamenti e slittamenti in questo sfondo esperienziale, incidendo sulla visione del mondo del lettore. Mi rivolgo poi al coinvolgimento corporeo del lettore, mostrando che la narrativa può attingere allo sfondo esperienziale dei suoi fruitori anche sul piano dell’esperienza di base: le simulazioni corporee della percezione contribuiscono alla nostra comprensione delle storie, incidendo sia sulla ricostruzione dello spazio dell’ambientazione sia sulla relazione intersoggettiva tra lettori e personaggi. Infine, mi occupo del rapporto tra l’esperienza della lettura e la pratica critico-letteraria dell’interpretazione, sostenendo che – lungi dal costituire due modalità opposte di fruizione dei testi – esse sono intimamente connesse.

Il repertorio italiano del Ms Gr. Rés. Vm7 676 della Biblioteca Nazionale di Parigi

La tesi esamina il codice musicale Gr. Rés Vm7 676 della Biblioteca Nazionale di Parigi, che rappresenta una fonte di grande interesse per lo studio della musica vocale italiana tra Quattro e Cinquecento. Compilato nel 1502, il codice è stato oggetto di analisi da parte di vari studiosi, che ne hanno preso in esame singoli brani o intere sezioni, allo scopo di attestare procedimenti compositivi particolari (Torrefranca) o caratteri stilistici locali, in particolare relativi alla frottola mantovana e ferrarese (Prizer). Un’accurata ricognizione sul repertorio è stata effettuata da Nanie Bridgman in un saggio degli anni Cinquanta del secolo scorso, ma non è mai stato realizzato uno studio organico sul manoscritto. Pertanto la ricerca si è proposta di riconsiderare l’intero repertorio italiano tramandato dal codice, per proporre un plausibile inquadramento stilistico nella cultura della poesia per musica coeva. La trascrizione dei testi e delle musiche, supportata dal confronto con le fonti manoscritte e a stampa, letterarie e musicali, ha consentito di formulare alcune ipotesi in merito alla circolazione del repertorio tramandato e all’ambiente di produzione del documento. L’inconsueta varietà di forme musicali riscontrate nel codice consente inoltre di assumere questo manoscritto come una delle principali fonti della tradizione musicale che precede immediatamente la ‘sistemazione’ del repertorio frottolistico effettuata da Ottaviano Petrucci, a partire dal 1504, con la pubblicazione dei suoi undici libri di frottole (1501-1514).

Dalle feste di nozze alle orchestre di stato: Maria Lătărețu e l'invenzione della muzică populară

Le musiche “popolaresche” urbane, in genere trascurate nella letteratura etnomusicologica, sono state quasi completamente ignorate nel caso della Romania. Il presente studio si propone di colmare almeno in parte questa lacuna, indagando questo fenomeno musicale nella Bucarest degli anni Trenta e Quaranta del Novecento. Le musiche esaminate sono tuttavia inserite entro una cornice storica più ampia, che data a partire dalla fine del XVIII secolo, e messe in relazione con alcune produzioni di origine rurale che con queste hanno uno stretto rapporto. Il caso di Maria Lătărețu (1911-1972) si è rivelato particolarmente fecondo in questo senso, dal momento che la cantante apparteneva ad entrambi i versanti musicali, rurale e urbano, e nepadroneggiava con disinvoltura i rispettivi repertori. Dopo il suo trasferimento nella capitale, negli anni Trenta, è diventata una delle figure di maggior spicco di quel fenomeno noto come muzică populară (creazione musicale eminentemente urbana e borghese con radici però nel mondo delle musiche rurali). L’analisi del repertorio (o, per meglio dire, dei due repertori) della Lătărețu, anche nel confronto con repertori limitrofi, ha permesso di comprendere più da vicino alcuni dei meccanismi musicali alla base di questa creazione. Un genere musicale che non nasce dal nulla nel dopo-guerra, ma piuttosto continua una tradizione di musica urbana, caratterizzata in senso locale, ma influenzata dal modello della canzone europea occidentale, che data almeno dagli inizi del Novecento. Attraverso procedimenti in parte già collaudati da compositori colti che sin dal XIX secolo, in Romania come altrove, si erano cimentati con la creazione di melodie in stile popolare o nell’armonizzazione di musiche di provenienza contadina, le melodie rurali nel bagaglio della cantante venivano trasformate in qualcosa di inedito. Una trasformazione che, come viene dimostrato efficacemente nell’ultimo capitolo, non investe solo il livello superficiale, ma coinvolge in modo profondo la sintassi musicale.

Dal repertorio al database: il progetto Monete al femminile. L'iconografia monetale dell'Augusta nella prima età imperiale

Il presente lavoro si pone l'obiettivo di fornire una rilettura filologica delle fonti numismatiche sui membri femminili della domus imperiale romana da Livia a Matidia Maggiore, supportata da una schedatura informatizzata del documento monetale. La compilazione è stata condotta tramite lo spoglio dei repertori di maggiore consultazione (RIC, BMCRE, BNCMER, HCC) e ha posto l'attenzione sia sugli elementi iconografici che su quelli epigrafici che vanno a comporre l'aspetto estrinseco della moneta. La scelta di tali elementi nelle emissioni imperiali è l'espressione di un vero e proprio linguaggio dotato di una logica comunicativa ben precisa e finalizzata a garantire la comprensibilità del messaggio. La sua decodifica consente di individuare possibili linee di definizione del ruolo pubblico e politico delle Auguste nel quadro dell'ideologia imperiale. A veicolare questo significato contribuiscono ugualmente gli elementi iconografici, con valore connotativo rispetto al soggetto raffigurato, e quelli epigrafici, con valore esplicativo ai fini della comprensione del dato visivo. La moneta rappresenta dunque un documento complesso, che necessita di una specifica metodologia di indagine volta a interpretarne tutti gli elementi.

Intercultural Performance and Dialogue. From Richard Schechner Performance Studies Onwards

Attraverso un excursus storico, teorico e metodologico, questa tesi di dottorato analizza la nascita, gli sviluppi e l’attuale dimensione costitutivo-identitaria dei Performance Studies, un ambito di ricerca accademica che, nato negli Stati Uniti alla fine degli anni Settanta, ha sempre palesato una natura restia nei confronti di qualunque tentativo definitorio. Se i Performance Studies concepiscono la performance sia come oggetto d’analisi sia come lente metodologica, e se, come evidenziato da Richard Schechner, praticamente tutto può essere “elevato a performance” e quindi indagato secondo le categorie analitiche di questa disciplina, ecco allora che, con uno slittamento transitivo e “meta-metodologico”, questa ricerca dottorale ha scelto come proprio oggetto di studio i Performance Studies stessi, osservandoli “as performance” e avvalendosi degli strumenti metodologici suggeriti dal suo stesso oggetto d’analisi. Questo lavoro indaga come l’oggetto di studio dei Performance Studies sia, seguendo la teoria schechneriana, il “behaved behavior”, e dunque come di conseguenza, il repertorio, prima ancora che l’archivio, possa essere considerato il fedele custode delle “pratiche incorporate”. Soffermandosi su esempi di “reenactment” performativo come quelli messi in atto da Marina Abramović e Clifford Owens, così come sui tentativi condotti dalla sezione dell’Intangible Cultural Heritage dell’UNESCO, suggerisce validi esempi di “archiviazione” della performance. L’elaborato prende poi in esame casi che esemplificano la proficua identificazione tra “studiare performance” e “fare performance”, sottolinea il ruolo cruciale e imprenscindibile determinato dal lavoro di ricerca sul campo inteso come “osservazione partecipante”, ed evidenzia il costante coinvolgimento sociale e politico assunto dai Performance Studies. Questa dissertazione affronta e supporta l’efficacia dei Performance Studies nel proporsi come uno strumento innovativo in grado di analizzare un mondo sempre più performativo nelle sue dinamiche. La loro natura tanto interdisciplinare quanto interculturale sembra farne una lente adeguata attraverso cui promuovere livelli diversi di performance dialogica tra culture localmente distinte ma globalmente assimilabili.

Ragnar Östberg. Genius loci e memorie urbane. Stockholms Stadshuset-Nämndhuset e villa Geber

La ricerca si propone di analizzare una di quelle stagioni architettoniche controverse e lontane dalle internazionali strade maestre del nascente Neues Bauen: il romanticismo-nazionale svedese riletto attraverso l’esperienza del suo massimo esponente, Ragnar Östberg (1866-1945). L’obiettivo della tesi non è solamente quello di una revisione della critica storiografica, facendo così luce su una di quelle personalità considerate marginali, quanto quello di ricavare dalla lettura comparata di due tra i suoi progetti, fino ad ora mai indagati, quegli elementi che fanno dell’architettura un “fatto urbano” in cui la collettività può riconoscersi e parallelamente un fatto di rappresentazione della stessa. L’arcipelago di Stoccolma e quel processo di “renovatio urbis” a cui fu sottoposta proprio agli albori del XX secolo furono gli scenari in cui presero vita i due progetti: il complesso formato dallo Stockholms Stadshuset e la vicina parte mai realizzata del Nämndhuset, e villa Geber. Condensano due dimensioni che la città immersa nel paesaggio contiene: la natura urbana dell’edificio municipale e quella domestica della villa urbana isolata. La ricerca intesse un itinerario di disvelamento attraverso una matrice duale di lettura: “genius loci” e memorie urbane. I capitoli cercano di dimostrare come i due casi-studio siano espressione di quella pendolarità di ricerca tra lo spirito del luogo e le rimembranze delle forme urbane della tradizione. Questa analisi ci conduce in un viaggio alla ricerca dell’atlante delle “memorie urbane”, raccolte nei viaggi e nella formazione, comprendendo così il mondo analogico di riferimenti culturali con altre architetture europee della tradizione. I due progetti sorgono in opposte aree di espansione di Stoccolma e, pur nella loro diversità di scala, sono chiara espressione di appropriatezza al luogo e di strutture formali analoghe. Stockholm Stadshuset-Nämndhuset e villa Geber esprimono il metodo di Östberg, dove i riferimenti raccolti dall’imagination passive sono tramutati ed assemblati grazie alla imagination active.