Caratterizzazione mediante HPLC-MS di modifiche post-trasduzionali di proteine istoniche

Gli istoni sono proteine basiche che possono essere classificate in varie classi: H1, H2A, H2B, H3 e H4. Queste proteine formano l’ottamero proteico attorno al quale si avvolge il DNA per formare il nucleosoma che è l’unità fondamentale della cromatina. A livello delle code N-terminali, gli istoni possono essere soggetti a numerose modifiche posttraduzionali quali acetilazioni, metilazioni, fosforilazioni, ADP-ribosilazioni e ubiquitinazioni. Queste modifiche portano alla formazione di diversi siti di riconoscimento per diversi complessi enzimatici coinvolti in importanti processi come la riparazione e la replicazione del DNA e l’assemblaggio della cromatina. La più importante e la più studiata di queste modifiche è l’acetilazione che avviene a livello dei residui amminici della catena laterale dell’amminoacido lisina. I livelli corretti di acetilazione delle proteine istoniche sono mantenuti dall’attività combinata di due enzimi: istone acetil transferasi (HAT) e istone deacetilasi (HDAC). Gli enzimi appartenenti a questa famiglia possono essere suddivisi in varie classi a seconda delle loro diverse caratteristiche, quali la localizzazione cellulare, la dimensione, l’omologia strutturale e il meccanismo d’azione. Recentemente è stato osservato che livelli aberranti di HDAC sono coinvolti nella carcinogenesi; per questo motivo numerosi gruppi di ricerca sono interessati alla progettazione e alla sintesi di composti che siano in grado di inibire questa classe enzimatica. L’inibizione delle HDAC può infatti provocare arresto della crescita cellulare, apoptosi o morte cellulare. Per questo motivo la ricerca farmaceutica in campo antitumorale è mirata alla sintesi di inibitori selettivi verso le diverse classi di HDAC per sviluppare farmaci meno tossici e per cercare di comprendere con maggiore chiarezza il ruolo biologico di questi enzimi. Il potenziale antitumorale degli inibitori delle HDAC deriva infatti dalla loro capacità di interferire con diversi processi cellulari, generalmente non più controllati nelle cellule neoplastiche. Nella maggior parte dei casi l’attività antitumorale risiede nella capacità di attivare programmi di differenziamento, di inibire la progressione del ciclo cellulare e di indurre apoptosi. Inoltre sembra essere molto importante anche la capacità di attivare la risposta immunitaria e l’inibizione dell’angiogenesi. Gli inibitori delle HDAC possono essere a loro volta classificati in base alla struttura chimica, alla loro origine (naturale o sintetica), e alla loro capacità di inibire selettivamente le HDAC appartenenti a classi diverse. Non è ancora chiaro se la selettività di queste molecole verso una specifica classe di HDAC sia importante per ottenere un effetto antitumorale, ma sicuramente inibitori selettivi possono essere molto utili per investigare e chiarire il ruolo delle HDAC nei processi cellulari che portano all’insorgenza del tumore. Nel primo capitolo di questa tesi quindi è riportata un’introduzione sull’importanza delle proteine istoniche non solo da un punto di vista strutturale ma anche funzionale per il destino cellulare. Nel secondo capitolo è riportato lo stato dell’arte dell’analisi delle proteine istoniche che comprende sia i metodi tradizionali come il microsequenziamento e l’utilizzo di anticorpi, sia metodi più innovativi (RP-LC, HILIC, HPCE) ideati per poter essere accoppiati ad analisi mediante spettrometria di massa. Questa tecnica consente infatti di ottenere importanti e precise informazioni che possono aiutare sia a identificare gli istoni come proteine che a individuare i siti coinvolti nelle modifiche post-traduzionali. Nel capitolo 3 è riportata la prima parte del lavoro sperimentale di questa tesi volto alla caratterizzazione delle proteine istoniche mediante tecniche cromatografiche accoppiate alla spettrometria di massa. Nella prima fase del lavoro è stato messo a punto un nuovo metodo cromatografico HPLC che ha consentito di ottenere una buona separazione, alla linea di base, delle otto classi istoniche (H1-1, H1-2, H2A-1, H2A-2, H2B, H3-1, H3-2 e H4). La separazione HPLC delle proteine istoniche ha permesso di poter eseguire analisi accurate di spettrometria di massa mediante accoppiamento con un analizzatore a trappola ionica tramite la sorgente electrospray (ESI). E’ stato così possibile identificare e quantificare tutte le isoforme istoniche, che differiscono per il tipo e il numero di modifiche post-traduzionali alle quali sono soggette, previa estrazione da colture cellulari di HT29 (cancro del colon). Un’analisi così dettagliata delle isoforme non può essere ottenuta con i metodi immunologici e permette di eseguire un’indagine molto accurata delle modifiche delle proteine istoniche correlandole ai diversi stadi della progressione del ciclo e alla morte cellulare. Il metodo messo a punto è stato convalidato mediante analisi comparative che prevedono la stessa separazione cromatografica ma accoppiata a uno spettrometro di massa avente sorgente ESI e analizzatore Q-TOF, dotato di maggiore sensibilità e risoluzione. Successivamente, per identificare quali sono gli specifici amminoacidi coinvolti nelle diverse modifiche post-traduzionali, l’istone H4 è stato sottoposto a digestione enzimatica e successiva analisi mediante tecniche MALDI-TOF e LC-ESI-MSMS. Queste analisi hanno permesso di identificare le specifiche lisine acetilate della coda N-terminale e la sequenza temporale di acetilazione delle lisine stesse. Nel quarto capitolo sono invece riportati gli studi di inibizione, mirati a caratterizzare le modifiche a carico delle proteine istoniche indotte da inibitori delle HDAC, dotati di diverso profilo di potenza e selettività. Dapprima Il metodo messo a punto per l’analisi delle proteine istoniche è stato applicato all’analisi di istoni estratti da cellule HT29 trattate con due noti inibitori delle HDAC, valproato e butirrato, somministrati alle cellule a dosi diverse, che corrispondono alle dosi con cui sono stati testati in vivo, per convalidare il metodo per studi di inibizione di composti incogniti. Successivamente, lo studio è proseguito con lo scopo di evidenziare effetti legati alla diversa potenza e selettività degli inibitori. Le cellule sono state trattate con due inibitori più potenti, SAHA e MS275, alla stessa concentrazione. In entrambi i casi il metodo messo a punto ha permesso di evidenziare l’aumento dei livelli di acetilazione indotto dal trattamento con gli inibitori; ha inoltre messo in luce differenti livelli di acetilazione. Ad esempio il SAHA, potente inibitore di tutte le classi di HDAC, ha prodotto un’estesa iperacetilazione di tutte le proteine istoniche, mentre MS275 selettivo per la classe I di HDAC, ha prodotto modifiche molto più blande. E’ stato quindi deciso di applicare questo metodo per studiare la dose e la tempo-dipendenza dell’effetto di quattro diversi inibitori delle HDAC (SAHA, MS275, MC1855 e MC1568) sulle modifiche post-traduzionali di istoni estratti da cellule HT29. Questi inibitori differiscono oltre che per la struttura chimica anche per il profilo di selettività nei confronti delle HDAC appartenenti alle diverse classi. Sono stati condotti quindi studi di dose-dipendenza che hanno consentito di ottenere i valori di IC50 (concentrazione capace di ridurre della metà la quantità relativa dell’istone meno acetilato) caratteristici per ogni inibitore nei confronti di tutte le classi istoniche. E’ stata inoltre calcolata la percentuale massima di inibizione per ogni inibitore. Infine sono stati eseguiti studi di tempo-dipendenza. I risultati ottenuti da questi studi hanno permesso di correlare i livelli di acetilazione delle varie classi istoniche con la selettività d’azione e la struttura chimica degli inibitori somministrati alle cellule. In particolare, SAHA e MC1855, inibitori delle HDAC di classi I e II a struttura idrossamica, hanno causato l’iperacetilazione di tutte le proteine istoniche, mentre MC1568 (inibitore selettivo per HDAC di classe II) ha prodotto l’iperacetilazione solo di H4. Inoltre la potenza e la selettività degli inibitori nel provocare un aumento dei livelli di acetilazione a livello delle distinte classi istoniche è stata correlata al destino biologico della cellula, tramite studi di vitalità cellulare. E’ stato osservato che il SAHA e MC1855, inibitori potenti e non selettivi, somministrati alla coltura HT29 a dose 50 μM producono morte cellulare, mentre MS275 alla stessa dose produce accumulo citostatico in G1/G0. MC1568, invece, non produce effetti significatici sul ciclo cellulare. Questo studio ha perciò dimostrato che l’analisi tramite HPLC-ESI-MS delle proteine istoniche permette di caratterizzare finemente la potenza e la selettività di nuovi composti inibitori delle HDAC, prevedendone l’effetto sul ciclo cellulare. In maggiore dettaglio è risultato che l’iperacetilazione di H4 non è in grado di provocare modifiche significative sul ciclo cellulare. Questo metodo, insieme alle analisi MALDI-TOF e LC-ESI-MSMS che permettono di individuare l’ordine di acetilazione delle lisine della coda N-terminale, potrà fornire importanti informazioni sugli inibitori delle HDAC e potrà essere applicato per delineare la potenza, la selettività e il meccanismo di azione di nuovi potenziali inibitori di questa classe enzimatica in colture cellulari tumorali.

Studio Concettuale, Progettazione e Realizzazione di un Nuovo Rotatore Omerale per Protesi Mioelettriche di Arto Superiore

L’attività della tesi riguarda le protesi mioelettriche, gli arti protesici maggiormente diffusi, le quali sono descrivibili come arti robotici in cui i segmenti artificiali sono attuati da giunti elettromeccanici alimentati da batterie ricaricabili ed attivati mediante segnali elettromiografici (segnali elettrici generati dalla contrazione dei muscoli). Tali protesi di arto superiore attualmente disponibili in commercio potrebbero essere inadeguate per una riabilitazione soddisfacente di alcuni pazienti con una amputazione di alto livello che richiedono una elevata funzionalità nella vita quotidiana. In questo contesto si inserisce l’attività di ricerca del Centro Protesi INAIL di Budrio di Vigorso, Bologna, e dell’Università di Bologna i quali stanno sviluppando nuovi arti protesici con il progetto a lungo termine di rendere disponibili svariate soluzioni di protesi di arto superiore in grado di soddisfare la maggior parte delle richieste degli amputati. Lo scopo di questa tesi è l’introduzione di un nuovo rotatore omerale attivo da integrare alla protesi di arto superiore disponibile presso i nostri laboratori. Per ottenere questo risultato è stata utilizzata una procedura di progettazione già consolidata in attività precedenti per lo sviluppo di una protesi di spalla a due gradi di libertà. Differenti modelli cinematici sono stati studiati tramite analisi cinematiche per determinare l’incremento delle prestazioni a seguito dell’introduzione del nuovo rotatore omerale attivo. Sono state inoltre condotte analisi cinetostatiche per definire le specifiche tecniche di riferimento (in termini di carichi agenti sul rotatore omerale) e per guidare il dimensionamento della catena di trasmissione di potenza del nuovo dispositivo protesico. Ulteriori specifiche tecniche sono state considerate per garantire l’irreversibilità spontanea del moto sotto carichi esterni (quando i giunti attivi della protesi non sono alimentati), per salvaguardare l’incolumità del paziente in caso di caduta, per misurare la posizione angolare del rotatore omerale (in modo da implementare strategie di controllo in retroazione) e per limitare i consumi e la rumorosità del dispositivo. Uno studio di fattibilità ha permesso la selezione della architettura ottimale della catena di trasmissione di potenza per il nuovo rotatore omerale. I criteri di scelta sono stati principalmente la limitazione del peso e dell’ingombro del nuovo dispositivo protesico. Si è quindi proceduto con la progettazione di dettaglio alla quale è seguita la costruzione di un prototipo del nuovo rotatore omerale presso i nostri laboratori. La tesi tratta infine una attività preliminare di sperimentazione che ha permesso di fare considerazioni sulle prestazioni del prototipo ed osservazioni importanti per le successive attività di revisione ed ottimizzazione del progetto del rotatore omerale.

Sviluppo di tecniche per la progettazione delle reti di monitoraggio della qualita' dell'aria

L’obiettivo del lavoro consiste nell’implementare una metodologia operativa volta alla progettazione di reti di monitoraggio e di campagne di misura della qualità dell’aria con l’utilizzo del laboratorio mobile, ottimizzando le posizioni dei dispositivi di campionamento rispetto a differenti obiettivi e criteri di scelta. La revisione e l’analisi degli approcci e delle indicazioni fornite dalla normativa di riferimento e dai diversi autori di lavori scientifici ha permesso di proporre un approccio metodologico costituito da due fasi operative principali, che è stato applicato ad un caso studio rappresentato dal territorio della provincia di Ravenna. La metodologia implementata prevede l’integrazione di numerosi strumenti di supporto alla valutazione dello stato di qualità dell’aria e degli effetti che gli inquinanti atmosferici possono generare su specifici recettori sensibili (popolazione residente, vegetazione, beni materiali). In particolare, la metodologia integra approcci di disaggregazione degli inventari delle emissioni attraverso l’utilizzo di variabili proxy, strumenti modellistici per la simulazione della dispersione degli inquinanti in atmosfera ed algoritmi di allocazione degli strumenti di monitoraggio attraverso la massimizzazione (o minimizzazione) di specifiche funzioni obiettivo. La procedura di allocazione sviluppata è stata automatizzata attraverso lo sviluppo di un software che, mediante un’interfaccia grafica di interrogazione, consente di identificare delle aree ottimali per realizzare le diverse campagne di monitoraggio

Indagini forensi in tema di scambio di file pedopornografici mediante software di file sharing a mezzo peer-to-peer

La prova informatica richiede l’adozione di precauzioni come in un qualsiasi altro accertamento scientifico. Si fornisce una panoramica sugli aspetti metodologici e applicativi dell’informatica forense alla luce del recente standard ISO/IEC 27037:2012 in tema di trattamento del reperto informatico nelle fasi di identificazione, raccolta, acquisizione e conservazione del dato digitale. Tali metodologie si attengono scrupolosamente alle esigenze di integrità e autenticità richieste dalle norme in materia di informatica forense, in particolare della Legge 48/2008 di ratifica della Convenzione di Budapest sul Cybercrime. In merito al reato di pedopornografia si offre una rassegna della normativa comunitaria e nazionale, ponendo l’enfasi sugli aspetti rilevanti ai fini dell’analisi forense. Rilevato che il file sharing su reti peer-to-peer è il canale sul quale maggiormente si concentra lo scambio di materiale illecito, si fornisce una panoramica dei protocolli e dei sistemi maggiormente diffusi, ponendo enfasi sulla rete eDonkey e il software eMule che trovano ampia diffusione tra gli utenti italiani. Si accenna alle problematiche che si incontrano nelle attività di indagine e di repressione del fenomeno, di competenza delle forze di polizia, per poi concentrarsi e fornire il contributo rilevante in tema di analisi forensi di sistemi informatici sequestrati a soggetti indagati (o imputati) di reato di pedopornografia: la progettazione e l’implementazione di eMuleForensic consente di svolgere in maniera estremamente precisa e rapida le operazioni di analisi degli eventi che si verificano utilizzando il software di file sharing eMule; il software è disponibile sia in rete all’url http://www.emuleforensic.com, sia come tool all’interno della distribuzione forense DEFT. Infine si fornisce una proposta di protocollo operativo per l’analisi forense di sistemi informatici coinvolti in indagini forensi di pedopornografia.

Sviluppo di metodologie innovative di supporto decisionale alla progettazione basate su indicatori di prestazione

Il progetto di ricerca è finalizzato allo sviluppo di una metodologia innovativa di supporto decisionale nel processo di selezione tra alternative progettuali, basata su indicatori di prestazione. In particolare il lavoro si è focalizzato sulla definizione d’indicatori atti a supportare la decisione negli interventi di sbottigliamento di un impianto di processo. Sono stati sviluppati due indicatori, “bottleneck indicators”, che permettono di valutare la reale necessità dello sbottigliamento, individuando le cause che impediscono la produzione e lo sfruttamento delle apparecchiature. Questi sono stati validati attraverso l’applicazione all’analisi di un intervento su un impianto esistente e verificando che lo sfruttamento delle apparecchiature fosse correttamente individuato. Definita la necessità dell’intervento di sbottigliamento, è stato affrontato il problema della selezione tra alternative di processo possibili per realizzarlo. È stato applicato alla scelta un metodo basato su indicatori di sostenibilità che consente di confrontare le alternative considerando non solo il ritorno economico degli investimenti ma anche gli impatti su ambiente e sicurezza, e che è stato ulteriormente sviluppato in questa tesi. Sono stati definiti due indicatori, “area hazard indicators”, relativi alle emissioni fuggitive, per integrare questi aspetti nell’analisi della sostenibilità delle alternative. Per migliorare l’accuratezza nella quantificazione degli impatti è stato sviluppato un nuovo modello previsionale atto alla stima delle emissioni fuggitive di un impianto, basato unicamente sui dati disponibili in fase progettuale, che tiene conto delle tipologie di sorgenti emettitrici, dei loro meccanismi di perdita e della manutenzione. Validato mediante il confronto con dati sperimentali di un impianto produttivo, si è dimostrato che tale metodo è indispensabile per un corretto confronto delle alternative poiché i modelli esistenti sovrastimano eccessivamente le emissioni reali. Infine applicando gli indicatori ad un impianto esistente si è dimostrato che sono fondamentali per semplificare il processo decisionale, fornendo chiare e precise indicazioni impiegando un numero limitato di informazioni per ricavarle.