Aberrant c-MET activation impairs perinuclear actin cap organization with YAP1 cytosolic relocation

Growing evidence indicates that cell and nuclear deformability plays a crucial role in the determination of cancer cells tumorigenic and metastatic potential. The perinuclear actin cap, by wrapping the nucleus with a functional network of actomyosin cables, can modulate nuclear architecture and consequently cell/nuclear elasticity. The hepatocyte growth factor receptor (MET) stands out among other membrane receptors as crucial player of the actin filaments organization, but no data are available on a specific role for MET in the actin cap assembly and the overall nuclear architecture organization. In a cell system characterized by MET hyperactivation, we observed a strong rearrangement of the cellular actin caps, with a complete dismantling of apical stress fibers and a strikingly enhanced nuclear height. CRISPR/Cas9 silencing of MET completely reverted the aberrant phenotype, resulting in flattened cells with perfectly aligned perinuclear actomyosin bundles, as well as decreased MAPK and PI3K/AKT signaling, cell proliferation rate and aggressiveness. Interestingly, MET ablated cells acquired a remarkably directed and polarized migratory phenotype, contrarily to cells with MET sustained activation showing meandering random walk. A pathway enrichment analysis comparing MET-activated and MET-KO cells RNAseq data, unveiled the contribution of multiple pathways associated with cytoskeleton remodeling, regulation of cell shape and response to mechanical stimuli. In line, the co-transcriptional activator YAP1, playing a major role in cell mechanosensing and focal adhesions/actin stabilization, appeared the culprit of the genetic reassembling of KO cells. Indeed, MET silencing was shown to induce YAP1 nuclear shuttling and increased co-transcriptional activity. Finally, we were able to induce in a normal epithelial model a phenotype closer to MET activated cancer cells only by introducing a constitutive fusion protein of MET. Taken together, our results demonstrate a new mechanism of MET-mediated actin remodeling responsible for a tumor-initiating capacity and meandering random migration, which requires YAP1 inactivation.

p300/CBP tyrosine phosphorylation in response to dna damage activated by c-Abl tyrosine kinase

The nuclear signaling that is triggered in response to DNA damage entails the recruitment and assembly of repair proteins and the induction of genes involved in the activation of cell cycle checkpoint, apoptosis or senescence. The extensive changes in chromatin structure underlying these processes suggest that chromatin-modifying enzymes could be relevant targets of DNA damage-activated signaling. The acetyltransferases p300 and CBP participate in DNA damage-activated responses, including local histone hyperacetylation, cell cycle regulation, and co-activation of DNA damage activated proteins, such as p53, p73 and BRCA1. However, the link between DNA damage and p300/CBP activation has not been identified.We have detected p300 tyrosine phosphorylation in response to DNA damage. We show that the DNA damage-activated cAbl tyrosine kinase enters the nuclei of cells exposed to genotoxic agents and phosphorylates p300 on a tyrosine residue within the bromodomain that is conserved in p300, CBP and many other bromodomain-containing proteins. Antibodies against tyrosine phosphorylated p300/CBP show a DNA damage-inducible nuclear staining, suggesting that p300 tyrosine phosphorylation is an event linking DNA damage and chromatin modifications.

Regulation of SRC-3 localization and dynamics by phosphorylation during ERα-dependent transcriptional activation

Transcription is controlled by promoter-selective transcriptional factors (TFs), which bind to cis-regulatory enhancers elements, termed hormone response elements (HREs), in a specific subset of genes. Regulation by these factors involves either the recruitment of coactivators or corepressors and direct interaction with the basal transcriptional machinery (1). Hormone-activated nuclear receptors (NRs) are well characterized transcriptional factors (2) that bind to the promoters of their target genes and recruit primary and secondary coactivator proteins which possess many enzymatic activities required for gene expression (1,3,4). In the present study, using single-cell high-resolution fluorescent microscopy and high throughput microscopy (HTM) coupled to computational imaging analysis, we investigated transcriptional regulation controlled by the estrogen receptor alpha (ERalpha), in terms of large scale chromatin remodeling and interaction with the associated coactivator SRC-3 (Steroid Receptor Coactivator-3), a member of p160 family (28) primary coactivators. ERalpha is a steroid-dependent transcriptional factor (16) that belongs to the NRs superfamily (2,3) and, in response to the hormone 17-ß estradiol (E2), regulates transcription of distinct target genes involved in development, puberty, and homeostasis (8,16). ERalpha spends most of its lifetime in the nucleus and undergoes a rapid (within minutes) intranuclear redistribution following the addition of either agonist or antagonist (17,18,19). We designed a HeLa cell line (PRL-HeLa), engineered with a chromosomeintegrated reporter gene array (PRL-array) containing multicopy hormone response-binding elements for ERalpha that are derived from the physiological enhancer/promoter region of the prolactin gene. Following GFP-ER transfection of PRL-HeLa cells, we were able to observe in situ ligand dependent (i) recruitment to the array of the receptor and associated coregulators, (ii) chromatin remodeling, and (iii) direct transcriptional readout of the reporter gene. Addition of E2 causes a visible opening (decondensation) of the PRL-array, colocalization of RNA Polymerase II, and transcriptional readout of the reporter gene, detected by mRNA FISH. On the contrary, when cells were treated with an ERalpha antagonist (Tamoxifen or ICI), a dramatic condensation of the PRL-array was observed, displacement of RNA Polymerase II, and complete decreasing in the transcriptional FISH signal. All p160 family coactivators (28) colocalize with ERalpha at the PRL-array. Steroid Receptor Coactivator-3 (SRC-3/AIB1/ACTR/pCIP/RAC3/TRAM1) is a p160 family member and a known oncogenic protein (4,34). SRC-3 is regulated by a variety of posttranslational modifications, including methylation, phosphorylation, acetylation, ubiquitination and sumoylation (4,35). These events have been shown to be important for its interaction with other coactivator proteins and NRs and for its oncogenic potential (37,39). A number of extracellular signaling molecules, like steroid hormones, growth factors and cytokines, induce SRC-3 phosphorylation (40). These actions are mediated by a wide range of kinases, including extracellular-regulated kinase 1 and 2 (ERK1-2), c-Jun N-terminal kinase, p38 MAPK, and IkB kinases (IKKs) (41,42,43). Here, we report SRC-3 to be a nucleocytoplasmic shuttling protein, whose cellular localization is regulated by phosphorylation and interaction with ERalpha. Using a combination of high throughput and fluorescence microscopy, we show that both chemical inhibition (with U0126) and siRNA downregulation of the MAP/ERK1/2 kinase (MEK1/2) pathway induce a cytoplasmic shift in SRC-3 localization, whereas stimulation by EGF signaling enhances its nuclear localization by inducing phosphorylation at T24, S857, and S860, known partecipants in the regulation of SRC-3 activity (39). Accordingly, the cytoplasmic localization of a non-phosphorylatable SRC-3 mutant further supports these results. In the presence of ERalpha, U0126 also dramatically reduces: hormone-dependent colocalization of ERalpha and SRC-3 in the nucleus; formation of ER-SRC-3 coimmunoprecipitation complex in cell lysates; localization of SRC-3 at the ER-targeted prolactin promoter array (PRL-array) and transcriptional activity. Finally, we show that SRC-3 can also function as a cotransporter, facilitating the nuclear-cytoplasmic shuttling of estrogen receptor. While a wealth of studies have revealed the molecular functions of NRs and coregulators, there is a paucity of data on how these functions are spatiotemporally organized in the cellular context. Technically and conceptually, our findings have a new impact upon evaluating gene transcriptional control and mechanisms of action of gene regulators.

I sarcofagi tra III e IV secolo d. C.: problemi di iconologia

Cosa e’ stato fatto e il fine della ricerca in questi tre anni si è esaminato il materiale edito sui sarcofagi del periodo in esame, sui culti funerari, i problemi religiosi ed artistici. Per trovare confronti validi si sono resi necessari alcuni viaggi sia in Italia che all’estero. Lo scopo della ricerca è stato quello di “leggere” i messaggi insiti nelle figurazioni delle casse dei sarcofagi, per comprendere meglio la scelta dei committenti verso determinati temi e la ricezione di questi ultimi da parte del pubblico. La tomba, infatti, è l’ultima traccia che l’uomo lascia di sé ed è quindi importante cercare di determinare l’impatto psicologico del monumento funerario sul proprietario, che spesso lo acquistava quando ancora era in vita, e sui familiari in visita alla tomba durante la celebrazione dei riti per i defunti. Nell’ultimo anno, infine, si è provveduto a scrivere la tesi suddivindendo i capitoli e i pezzi in base all’argomento delle figurazioni (mitologici, di virtù, etc.). I capitoli introduttivi Nel primo capitolo di introduzione si è cercato di dare un affresco per sommi capi del periodo storico in esame da Caracalla a Teodosio e della Chiesa di III e IV secolo, mettendo in luce la profonda crisi che gravava sull’Impero e le varie correnti che frammentavano il cristianesimo. In particolare alcune dispute, come quella riguardante i lapsi, sarà alla base di ipotesi interpretative riguardanti la raffigurazione del rifiuto dei tre giovani Ebrei davanti a Nabuchodonosor. Nel capitolo seguente vengono esaminati i riti funerari e il ruolo dei sarcofagi in tali contesti, evidenziando le diverse situazioni emotive degli osservatori dei pezzi e, quindi, l’importanza dei temi trattati nelle casse. I capitolo Questo capitolo tratta dei sarcofagi mitologici. Dopo una breve introduzione, dove viene spiegata l’entrata in uso dei pezzi in questione, si passa alla discussione dei temi, suddivisi in paragrafi. La prima classe di materiali è qualla con la “caduta di Fetonte” la cui interpretazione sembra chiara: una tragedia familiare. Il compianto sul corpo di un ragazzo morto anzi tempo, al quale partecipa tutto il cosmo. L’afflizione dei familiari è immane e sembra priva di una possibile consolazione. L’unico richiamo a riprendere a vivere è solo quello del dovere (Mercurio che richiama Helios ai propri impegni). La seconda classe è data dalle scene di rapimento divino visto come consolazione e speranza in un aldilà felice, come quelle di Proserpina e Ila. Nella trasposizione della storia di Ila è interessante anche notare il fatto che le ninfe rapitrici del giovane – defunto abbiano le sembianze delle parenti già morte e di un fanciullo, probabilmente la madre, la nonna e un fratello deceduto anzi tempo. La terza classe presenta il tema del distacco e dell’esaltazione delle virtù del defunto nelle vesti dei cacciatori mitici Mealeagro, Ippolito e Adone tutti giovani, forti e coraggiosi. In questi sarcofagi ancor più che negli altri il motivo della giovinezza negata a causa della morte è fondamentale per sottolineare ancora di più la disperazione e il dolore dei genitori rimasti in vita. Nella seguente categoria le virtù del defunto sono ancora il tema dominante, ma in chiave diversa: in questo caso l’eroe è Ercole, intento ad affrontare le sue fatiche. L’interpretazione è la virtù del defunto che lo ha portato a vincere tutte le difficoltà incontrate durante la propria vita, come dimostrerebbe anche l’immagine del semidio rappresentato in età diverse da un’impresa all’altra. Vi è poi la categoria del sonno e della morte, con i miti di Endimione, Arianna e Rea Silvia, analizzato anche sotto un punto di vista psicologico di aiuto per il superamento del dolore per la perdita di un figlio, un marito, o, ancora, della sposa. Accanto ai sarcofagi con immagini di carattere narrativo, vi sono numerosi rilievi con personaggi mitici, che non raccontano una storia, ma si limitano a descrivere situazioni e stati d’animo di felicità. Tali figurazioni si possono dividere in due grandi gruppi: quelle con cortei marini e quelle con il tiaso dionisiaco, facendo dell’amore il tema specifico dei rilievi. Il fatto che quello del tiaso marino abbia avuto così tanta fortuna, forse, per la numerosa letteratura che metteva in relazione l’Aldilà con l’acqua: l’Isola dei Beati oltre l’Oceano, viaggi per mare verso il mondo dei morti. Certo in questo tipo di sarcofagi non vi sono esplicitate queste credenze, ma sembrano più che altro esaltare le gioie della vita. Forse il tutto può essere spiegato con la coesistenza, nei familiari del defunto, della memoria retrospettiva e della proiezione fiduciosa nel futuro. Sostanzialmente era un modo per evocare situazioni gioiose e di godimento sensibile, riferendole ai morti in chiave beneaugurale. Per quanto rigurda il tiaso di Bacco, la sua fortuna è stata dettata dal fatto che il suo culto è sempre stato molto attivo. Bacco era dio della festa, dell’estasi, del vino, era il grande liberatore, partecipe della crescita e della fioritura, il grande forestiero , che faceva saltare gli ordinamenti prestabiliti, i confini della città con la campagna e le convenzioni sociali. Era il dio della follia, al quale le menadi si abbandonavano nella danza rituale, che aggrediva le belve, amante della natura, ma che penetra nella città, sconvolgendola. Del suo seguito facevano parte esseri ibridi, a metà tra l’ordine e la bestialità e animali feroci ammansiti dal vino. I suoi nemici hanno avuto destini orribili di indicibile crudeltà, ma chi si è affidato anima e corpo a lui ha avuto gioia, voluttà, allegria e pienezza di vita. Pur essendo un valente combattente, ha caratteri languidi e a tratti femminei, con forme floride e capelli lunghi, ebbro e inebriante. Col passare del tempo la conquista indiana di alessandro si intrecciò al mito bacchico e, a lungo andare, tutti i caratteri oscuri e minacciosi della divinità scomparirono del tutto. Un esame sistematico dei temi iconografici riconducibili al mito di Bacco non è per nulla facile, in quanto l’oggetto principale delle raffigurazioni è per lo più il tiaso o come corteo festoso, o come gruppi di figure danzanti e musicanti, o, ancora, intento nella vendemmia. Ciò che interessava agli scultori era l’atmosfera gioiosa del tiaso, al punto che anche un episodio importante, come abbiamo visto, del ritrovamento di Arianna si pèerde completamente dentro al corteo, affollatissimo di personaggi. Questo perché, come si è detto anche al riguardo dei corte marini, per creare immagini il più possibile fitte e gravide di possibilità associative. Altro contesto iconografico dionisiaco è quello degli amori con Arianna. Sui sarcofagi l’amore della coppia divina è raffigurato come una forma di stupore e rapimento alla vista dell’altro, un amore fatto di sguardi, come quello del marito sulla tomba della consorte. Un altro tema , che esalta l’amore, è senza ombra di dubbio quello di Achille e Pentesilea, allegoria dell’amore coniugale. Altra classe è qualla con il mito di Enomao, che celebra il coraggio virile e l’attitudine alla vittoria del defunto e, se è presente la scena di matrimonio con Ippodamia, l’amore verso la sposa. Infine vi sono i sarcofagi delle Muse: esaltazione della cultura e della saggezza del morto. II capitolo Accanto ad i grandi ambiti mitologici dei due tiasi del capitolo precedente era la natura a lanciare un messaggio di vita prospera e pacifica. Gli aspetti iconografici diq uesto tema sono due: le stagioni e la vita in un ambiente bucolico. Nonostante la varietà iconografica del soggetto, l’idea di fondo rimane invariata: le stagioni portano ai morti i loro doni affinchè possano goderne tutto l’anno per l’eternità. Per quanto riguarda le immagini bucoliche sono ispirate alla vita dei pastori di ovini, ma ovviamente non a quella reale: i committenti di tali sarcofagi non avevano mai vissuto con i pastori, né pensavano di farlo i loro parenti. Le immagini realistiche di contadini, pastori, pescatori, tutte figure di infimo livello sociale, avevano assunto tratti idilliaci sotto l’influsso della poesia ellenistica. Tutte queste visioni di felicità mancano di riferimenti concreti sia temporali che geografici. Qui non vi sono protagonisti e situazioni dialogiche con l’osservatore esterno, attraverso la ritrattistica. I defunti se appaiono sono all’interno di un tondo al centro della cassa. Nei contesti bucolici, che andranno via, via, prendendo sempre più piede nel III secolo, come in quelli filosofici, spariscono del tutto le scene di lutto e di cordoglio. Le immagini dovevano essere un invito a godersi la vita, ma dovevano anche dire qualcosa del defunto. In una visione retrospettiva, forse, si potrebbero intendere come una dichiarazione che il morto, in vita, non si era fatto mancare nulla. Nel caso opposto, poteve invece essere un augurio ad un’esistenza felice nell’aldilà. III capitolo Qui vengono trattati i sarcofagi con l’esaltazione e l’autorappresentazione del defunto e delle sue virtù in contesti demitizzati. Tra i valori ricorrenti, esaltati nei sarcofagi vi è l’amore coniugale espresso dal tema della dextrarum iunctio, simbolo del matrimonio, la cultura, il potere, la saggezza, il coraggio, esplicitato dalle cacce ad animali feroci, il valore guerriero e la giustizia, dati soprattutto dalle scene di battaglia e di giudizio sui vinti. IV capitolo In questo capitolo si è provato a dare una nuova chiave di lettura ai sarcofagi imperiali di S. Elena e di Costantina. Nel primo caso si tratterebbe della vittoria eterna sul male, mentre nel secondo era un augurio di vita felice nell’aldilà in comunione con Dio e la resurrezione nel giorno del giudizio. V capitolo Il capitolo tratta le mediae voces, quei pezzi che non trovano una facile collocazione in ambito religioso poiché presentano temi neutri o ambivalenti, come quelli del buon pastore, di Prometeo, dell’orante. VI capitolo Qui trovano spazio i sarcofagi cristiani, dove sono scolpite varie scene tratte dalle Sacre Scritture. Anche in questo caso si andati al di là della semplice analisi stilistica per cercare di leggere il messaggio contenuto dalle sculture. Si sono scoperte preghiere, speranze e polemiche con le correnti cristiane considerate eretiche o “traditrici” della vera fede, contro la tradizionale interpretazione che voleva le figurazioni essenzialmente didascaliche. VII capitolo Qui vengono esposte le conclusioni da un punto di vista sociologico e psicologico.