Valutazione dell'impatto della farmacogenetica in ambito di Sanità Pubblica. Analisi del polimorfismo genetico dell'enzima CYP2D6 metabolizzante xenobiotici.

Pharmacogenetic testing provides an outstanding opportunity to improve prescribing safety and efficacy. In Public health policy pharmacogenetics is relevant for personalized therapy and to maximize therapeutic benefit minimizing adverse events. CYP2D6 is known to be a key enzyme responsible for the biotransformation of about 25-30% of extensively used drugs and genetic variations in genes coding for drug-metabolizing enzymes might lead to adverse drug reactions, toxicity or therapeutic failure of pharmacotherapy. Significant interethnic differences in CYP2D6 allele distribution are well established, but immigration is reshaping the genetic background due to interethnic admixture which introduces variations in individual ancestry resulting in distinct level of population structure. The present thesis deals with the genetic determination of the CYP2D6 alleles actually present in the Emilia-Romagna resident population providing insights into the admixture process. A random sample of 122 natives and 175 immigrants from Africa, Asia and South America where characterized considering the present scenario of migration and back migration events. The results are consistent with the known interethnic genetic variation, but introduction of ethnic specific variants by immigrants predicts a heterogeneous admixed population scenario requiring, for drugs prescription and pharmacogenetics studies, an interdisciplinary approach applied in a properly biogeographical and anthropological frame. To translate pharmacogenetics knowledge into clinical practice requires appropriated public health policies, possibly guiding clinicians to evaluate prospectively which patients have the greatest probability of expressing a variant genotype.

Studio e caratterizzazione del colore rosso dell'epicarpo nella pera Max Red Bartlett, mutante della cv William

Durante il secolo scorso sono state individuate alcune mutazioni per il colore della buccia della varietà William che invece di essere giallo arriva a maturazione con diverse tonalità di colore rosso. L’intensità e la tipologia del fenotipo dovuto a questa mutazione mostra una variabilità all’interno dei diversi cloni rossi di questa cultivar: Max Red Bartlett, Rosired e Sensation. Questa mutazione è ereditabile e usando come genitore uno dei sopra-citati mutanti per il rosso sono state prodotte altre cultivar caratterizzate da buccia rossa come Cascade. Max Red Bartlett presenta una intensa colorazione rossa nelle prime fasi di maturazione per poi striarsi perdendo di lucentezza e non ricoprendo totalmente la superficie del frutto. Max Red Bartlett ha inoltre il problema di regressione del colore. Questa mutazione infatti non è stabile e dopo qualche anno può regredire e presentare il fenotipo di William. Diverso è invece lo sviluppo per esempio di Rosired che durante le prime fasi di accrescimento del frutto è identica a Williams (di colore verde con la parte del frutto rivolta verso il sole leggermente rossastra) per poi virare e mantenere un vivo colore rosso su tutta la superficie del frutto. Questa tesi si è proposta di caratterizzare questa mutazione che coinvolge in qualche modo la via biosintetica per la sintesi del colore. In particolare si è cercato di investigare sui probabili geni della via degli antociani coinvolti e in quale modo vengono espressi durante la maturazione del frutto, inoltre si è cercato di trovare quali specifiche molecole venissero diversamente sintetizzate. Le cultivar utilizzate sono state William e Max Red Bartlett. Di quest’ultima era già disponibile una mappa molecolare, ottenuta sulla popolazione di’incrocio di Abate Fetel (gialla) x MRB (rossa) con AFLP e SSR, quest’ultimi hanno permesso di denominare i diversi linkage group grazie alla sintenia con le altre mappe di pero e di melo. I semenzali appartenenti a questa popolazione, oltre a dimostrare l’ereditarietà del carattere, erano per il 50% gialli e 50% rossi. Questo ha permesso il mappaggio di questo carattere/mutazione che si è posizionato nel linkage group 4. Una ricerca in banca dati eseguita in parallelo ha permesso di trovare sequenze di melo dei geni coinvolti nella via biosintetica degli antociani (CHS, CHI, F3H, DFR, ANS e UFGT), sulle quali è stato possibile disegnare primer degenerati che amplificassero su DNA genomico di pero. Le amplificazioni hanno dato frammenti di lunghezza diversa. Infatti nel caso di F3H e DFR l’altissima omologia tra melo e pero ha permesso l’amplificazione quasi totale del gene, negli altri casi invece è stato necessario utilizzare primer sempre più vicini in modo da facilitare l’amplificazione. I frammenti ottenuti sono stati clonati sequenziati per confermare la specificità degli amplificati. Non sono stati evidenziati polimorfismi di sequenza in nessuna delle sei sequenze tra William e Max Red Bartlett e nessun polimorfismo con Abate, per questo motivo non è stato possibile mapparli e vedere se qualcuno di questi geni era localizzato nella medesima posizione in cui era stato mappato il “colore/mutazione”. Sulle le sequenze ottenute è stato possibile disegnare altri primer, questa volta specifici, sia per analisi d’espressione. Inizialmente è stato sintetizzato il cDNA dei geni suddetti per retrotrascrizione da RNA estratto sia da bucce sia da foglie appena germogliate (le quali presentano solo in questa fase una colorazione rossastra in MRB ma non in William). Al fine di osservare come varia l’espressione dei geni della via biosintetica delle antocianine durante la fase di maturazione dei frutti, sono stati fatti 4 campionamenti, il primo a 45gg dalla piena fioritura, poi a 60, 90, 120 giorni. Foglie e bucce sono state prelevate in campo e poste immediatamente in azoto liquido. Dai risultati con Real Time è emerso che vi è una maggiore espressione nelle prime fasi di sviluppo in Max Red Bartlett per poi calare enormemente in giugno. Si potrebbe ipotizzare che ci sia una reazione di feed back da parte della piante considerando che in questa fase il frutto non si accresce. I livelli di espressione poi aumentano verso la fase finale della maturazione del frutto. In agosto, con l’ultimo campionamento vi è una espressione assai maggiore in Max Red Bartlett per quei geni posti a valle della via biosintetica per la sintesi delle antocianine. Questo risultato è confermato anche dal livello di espressione che si riscontra nelle foglie. In cui i geni F3H, LDOX e UFGT hanno un livello di espressione nettamente maggiore in Max Red Bartlett rispetto a William. Recentemente Takos et al (2006) hanno pubblicato uno studio su un gene regolatore della famiglia Myb e ciò ha permesso di ampliare i nostri studi anche su questo gene. L’altissima omologia di sequenza, anche a livello di introni, non ha permesso di individuare polimorfismi tra le varietà Abate Fetel e Max Red Bartlett, per nessun gene ad eccezione proprio del gene regolatore Myb. I risultati ottenuti in questa tesi dimostrano che in pero l’espressione relativa del gene Myb codificante per una proteina regolatrice mostra una netta sovra-espressione nel primo stadio di maturazione del frutto, in Max Red Bartlett 25 volte maggiore che in William. All’interno della sequenza del gene un polimorfismo prodotto da un microsatellite ha permesso il mappaggio del gene nel linkage group 9 in Max Red Bartlett e in Abate Fetel. Confrontando questo dato di mappa con quello del carattere morfologico rosso, mappato nel linkage group 4, si deduce che la mutazione non agisce direttamente sulla sequenza di questo gene regolatore, benché sia espresso maggiormente in Max Red Bartlett rispetto a William ma agisca in un altro modo ancora da scoprire. Infine per entrambe le varietà (William e Max Red Bartlett) sono state effettuate analisi fenotipiche in diversi step. Innanzi tutto si è proceduto con una analisi preliminare in HPLC per osservare se vi fossero differenze nella produzione di composti con assorbenza specifica delle antocianine e dei flavonoidi in generale. Si è potuto quindi osservare la presenza di due picchi in Max Red Bartlett ma non in William. La mancanza di standard che coincidessero con i picchi rilevati dallo spettro non ha permesso in questa fase di fare alcuna ipotesi riguardo alla loro natura. Partendo da questo risultato l’investigazione è proceduta attraverso analisi di spettrometria di massa associate ad una cromatografia liquida identificando con una certa precisione due composti: la cianidina-3-0-glucoside e la quercitina-3-o-glucoside. In particolare la cianidina sembra essere la molecola responsabile della colorazione della buccia nei frutti di pero. Successive analisi sono state fatte sempre con lo spettrometro di massa ma collegato ad un gas cromatografo per verificare se vi fossero delle differenze anche nella produzione di zuccheri e più in generale di molecole volatili. L’assenza di variazioni significative ha dimostrato che la mutazione coinvolge solo il colore della buccia e non le caratteristiche gustative e organolettiche di William che restano inalterate nel mutante.

La farmacogenetica della narcolessia: comorbidità psichiatriche e risvolti in sanità pubblica

La farmacogenetica fornisce un importante strumento utile alla prescrizione farmacologica, migliorando l’efficacia terapeutica ed evitando le reazioni avverse. Il citocromo P450 gioca un ruolo centrale nel metabolismo di molti farmaci utilizzati nella pratica clinica e il suo polimorfismo genetico spiega in gran parte le differenze interindividuali nella risposta ai farmaci. Con riferimento alla terapia della narcolessia, occorre premettere che la narcolessia con cataplessia è una ipersonnia del Sistema Nervoso Centrale caratterizzata da eccessiva sonnolenza diurna, cataplessia, paralisi del sonno, allucinazioni e sonno notturno disturbato. Il trattamento d’elezione per la narcolessia include stimolanti dopaminergici per la sonnolenza diurna e antidepressivi per la cataplessia, metabolizzati dal sistema P450. Peraltro, poiché studi recenti hanno attestato un’alta prevalenza di disturbi alimentari nei pazienti affetti da narcolessia con cataplessia, è stata ipotizzata una associazione tra il metabolismo ultrarapido del CYP2D6 e i disturbi alimentari. Lo scopo di questa ricerca è di caratterizzare il polimorfismo dei geni CYP2D6, CYP2C9, CYP2C19, CYP3A4, CYP3A5 e ABCB1 coinvolti nel metabolismo e nel trasporto dei farmaci in un campione di 108 pazienti affetti da narcolessia con cataplessia, e valutare il fenotipo metabolizzatore in un sottogruppo di pazienti che mostrano un profilo psicopatologico concordante con la presenza di disturbi alimentari. I risultati hanno mostrato che il fenotipo ultrarapido del CYP2D6 non correla in maniera statisticamente significativa con i disturbi alimentari, di conseguenza il profilo psicopatologico rilevato per questo sottogruppo di pazienti potrebbe essere parte integrante del fenotipo sintomatologico della malattia. I risultati della tipizzazione di tutti i geni analizzati mostrano un’alta frequenza di pazienti con metabolismo intermedio, elemento potenzialmente in grado di influire sulla risposta terapeutica soprattutto in caso di regime politerapico, come nel trattamento della narcolessia. In conclusione, sarebbe auspicabile l’esecuzione del test farmacogenetico in pazienti affetti da narcolessia con cataplessia.