Studio molecolare dei meccanismi dell'autoincompatibilit�� gametofitica in pero europeo (Pyrus communis)

Self-incompatibility (SI) systems have evolved in many flowering plants to prevent self-fertilization and thus promote outbreeding. Pear and apple, as many of the species belonging to the Rosaceae, exhibit RNase-mediated gametophytic self-incompatibility, a widespread system carried also by the Solanaceae and Plantaginaceae. Pear orchards must for this reason contain at least two different cultivars that pollenize each other; to guarantee an efficient cross-pollination, they should have overlapping flowering periods and must be genetically compatible. This compatibility is determined by the S-locus, containing at least two genes encoding for a female (pistil) and a male (pollen) determinant. The female determinant in the Rosaceae, Solanaceae and Plantaginaceae system is a stylar glycoprotein with ribonuclease activity (S-RNase), that acts as a specific cytotoxin in incompatible pollen tubes degrading cellular RNAs. Since its identification, the S-RNase gene has been intensively studied and the sequences of a large number of alleles are available in online databases. On the contrary, the male determinant has been only recently identified as a pollen-expressed protein containing a F-box motif, called S-Locus F-box (abbreviated SLF or SFB). Since F-box proteins are best known for their participation to the SCF (Skp1 - Cullin - F-box) E3 ubiquitine ligase enzymatic complex, that is involved in protein degradation through the 26S proteasome pathway, the male determinant is supposed to act mediating the ubiquitination of the S-RNases, targeting them for the degradation in compatible pollen tubes. Attempts to clone SLF/SFB genes in the Pyrinae produced no results until very recently; in apple, the use of genomic libraries allowed the detection of two F-box genes linked to each S haplotype, called SFBB (S-locus F-Box Brothers). In Japanese pear, three SFBB genes linked to each haplotype were cloned from pollen cDNA. The SFBB genes exhibit S haplotype-specific sequence divergence and pollen-specific expression; their multiplicity is a feature whose interpretation is unclear: it has been hypothesized that all of them participate in the S-specific interaction with the RNase, but it is also possible that only one of them is involved in this function. Moreover, even if the S locus male and female determinants are the only responsible for the specificity of the pollen-pistil recognition, many other factors are supposed to play a role in GSI; these are not linked to the S locus and act in a S-haplotype independent manner. They can have a function in regulating the expression of S determinants (group 1 factors), modulating their activity (group 2) or acting downstream, in the accomplishment of the reaction of acceptance or rejection of the pollen tube (group 3). This study was aimed to the elucidation of the molecular mechanism of GSI in European pear (Pyrus communis) as well as in the other Pyrinae; it was divided in two parts, the first focusing on the characterization of male determinants, and the second on factors external to the S locus. The research of S locus F-box genes was primarily aimed to the identification of such genes in European pear, for which sequence data are still not available; moreover, it allowed also to investigate about the S locus structure in the Pyrinae. The analysis was carried out on a pool of varieties of the three species Pyrus communis (European pear), Pyrus pyrifolia (Japanese pear), and Malus �� domestica (apple); varieties carrying S haplotypes whose RNases are highly similar were chosen, in order to check whether or not the same level of similarity is maintained also between the male determinants. A total of 82 sequences was obtained, 47 of which represent the first S-locus F-box genes sequenced from European pear. The sequence data strongly support the hypothesis that the S locus structure is conserved among the three species, and presumably among all the Pyrinae; at least five genes have homologs in the analysed S haplotypes, but the number of F-box genes surrounding the S-RNase could be even greater. The high level of sequence divergence and the similarity between alleles linked to highly conserved RNases, suggest a shared ancestral polymorphism also for the F-box genes. The F-box genes identified in European pear were mapped on a segregating population of 91 individuals from the cross 'Abb�� F��tel' �� 'Max Red Bartlett'. All the genes were placed on the linkage group 17, where the S locus has been placed both in pear and apple maps, and resulted strongly associated to the S-RNase gene. The linkage with the RNase was perfect for some of the F-box genes, while for others very rare single recombination events were identified. The second part of this study was focused on the research of other genes involved in the SI response in pear; it was aimed on one side to the identification of genes differentially expressed in compatible and incompatible crosses, and on the other to the cloning and characterization of the transglutaminase (TGase) gene, whose role may be crucial in pollen rejection. For the identification of differentially expressed genes, controlled pollinations were carried out in four combinations (self pollination, incompatible, half-compatible and fully compatible cross-pollination); expression profiles were compared through cDNA-AFLP. 28 fragments displaying an expression pattern related to compatibility or incompatibility were identified, cloned and sequenced; the sequence analysis allowed to assign a putative annotation to a part of them. The identified genes are involved in very different cellular processes or in defense mechanisms, suggesting a very complex change in gene expression following the pollen/pistil recognition. The pool of genes identified with this technique offers a good basis for further study toward a better understanding of how the SI response is carried out. Among the factors involved in SI response, moreover, an important role may be played by transglutaminase (TGase), an enzyme involved both in post-translational protein modification and in protein cross-linking. The TGase activity detected in pear styles was significantly higher when pollinated in incompatible combinations than in compatible ones, suggesting a role of this enzyme in the abnormal cytoskeletal reorganization observed during pollen rejection reaction. The aim of this part of the work was thus to identify and clone the pear TGase gene; the PCR amplification of fragments of this gene was achieved using primers realized on the alignment between the Arabidopsis TGase gene sequence and several apple EST fragments; the full-length coding sequence of the pear TGase gene was then cloned from cDNA, and provided a precious tool for further study of the in vitro and in vivo action of this enzyme.

La produzione drammatica dei fratelli Figueroa y C��rdoba, con edizione critica di "Mentir y mudarse a un tiempo"

Diego e Jos�� de Figueroa y C��rdoba furono due fratelli drammaturghi, attivi nella seconda met�� del XVII secolo, che praticarono assiduamente la scrittura in collaborazione. Nel tentativo di rivalutare questi autori ingiustamente dimenticati dalla critica odierna, il presente lavoro si propone di offrire uno studio introduttivo alle figure e al teatro dei due fratelli. Nella prima parte, si offre un profilo biografico dei fratelli Figueroa, riunendo le seppur scarse notizie che possediamo sulla loro vita, in modo da inquadrarne le personalit�� all���interno degli ambienti letterari dell���epoca. Ci si concentra, poi, sul corpus, proponendo una panoramica delle commedie scritte da Diego e Jos��, dando di ciascuna una breve sinossi e un rapido inquadramento all���interno dei generi tipici del teatro aureo, e segnalando gli eventuali problemi di attribuzione. Si accenna, infine, alla collaborazione dei fratelli nella scrittura di molte delle loro commedie, avanzando alcune ipotesi sulla tecnica compositiva. La seconda parte �� costituita da un repertorio bibliografico del teatro ���maggiore��� dei due fratelli, in cui si descrivono analiticamente tutti gli esemplari conosciuti delle comedias dei Figueroa. Ogni descrizione si completa con una lista delle biblioteche in cui l���esemplare �� conservato, lista compilata attraverso la consultazione di cataloghi, cartacei e on-line, delle principali biblioteche con fondi di teatro spagnolo del Siglo de Oro. Infine, la terza parte �� dedicata all���edizione critica di una delle commedie scritte in collaborazione da Diego e Jos��: Mentir y mudarse a un tiempo, condotta usando come testo base un manoscritto probabilmente autografo. L���edizione si completa di un apparato critico, con analisi dei testimoni, stemma codicum e registro delle varianti. Precede l���edizione uno studio generale introduttivo all���opera.

Luis Arana e i veterani di Euzkeldun Batzokija: la corrente ortodossa del nazionalismo basco

La tesi di Marco Perez intitolata ���Luis Arana e i veterani di Euzkeldun Batzokija: la corrente ortodossa del nazionalismo basco���, pu�� essere considerata come la biografia politica di uno dei personaggi pi�� importanti del nazionalismo basco. Il lavoro di ricerca si centra fondamentalmente sull'ispiratore del nazionalismo euskaldun (e cofondatore del Partido Nacionalista Vasco) e della corrente che ne accompagn�� e sostenne l'azione politica. Euzkeldun Batzokija fu il nome dato al primo circolo del PNV, fondato da Luis e Sabino Arana nel 1894. Successivamente, gli statuti del circolo e i suoi membri veterani furono presi come modello del nazionalismo primordiale (che si pretendeva definire sull'esempio dell'Ordine gesuita). Sul piano organizzativo la tesi si divide in sette capitoli che ricostruiscono il percorso politico di Luis Arana, dai primi documenti del 1879 fino alle ultime lettere inviate negli anni quaranta. Si tratta di un lungo periodo, che comprende momenti diversi della storia spagnola (dalle guerre carliste alla Guerra Civile spagnola) e del movimento aranista. In questo senso, sulla base di una generale e comparata riflessione sul nazionalismo, si analizza il movimento basco nei suoi rapporti con la modernit��. Una realazione costruita attraverso concetti ���diacronicamente��� legati a un passato mitico e leggendario e comunque subalterna ai rapporti di forza tra le correnti del PNV. La corrente ortodossa fece sempre riferimento al nazionalismo ���originario��� (definito dai fratelli Arana nei primi anni del movimento) che fu un'espressione regionale del nazionalcattolicesimo spagnolo. Fu proprio Luis Arana a ricordare la finalit�� religiosa ed etnica del nazionalismo basco, respingendo qualsiasi aggiornamento teorico e organizzativo del PNV, intesi come una grave violazione dell'ortodossia aranista.

Analisi di ���Copy Number Variants��� ed identificazione di nuovi geni candidati per l���Autismo e Ritardo Mentale

I disturbi dello spettro autistico (DSA) ed il ritardo mentale (RM) sono caratterizzati da un���eziologia genetica complessa ed eterogenea. Grazie ai recenti sviluppi nella ricerca genomica, �� stato possibile dimostrare il ruolo di numerose copy number variants (CNVs) nella patogenesi di questi disturbi, anche se nella maggior parte dei casi l���eziologia rimane ancora sconosciuta. Questo lavoro riguarda l���identificazione e la caratterizzazione dei CNVs in famiglie con DSA e RM. E��� stata studiata una microdelezione in 7q31 che coinvolge i geni IMMP2L e DOCK4, trasmessa dalla madre con dislessia a due figli con autismo ed una figlia con dislessia. Nella stessa famiglia segrega una seconda microdelezione in 2q14 che inattiva il gene CNTNAP5 ed �� trasmessa dal padre (con tratti autistici) ai due figli con autismo. Abbiamo quindi ipotizzato che i geni DOCK4 e CNTNAP5 potessero essere implicati, rispettivamente, nella suscettibilit�� a dislessia e DSA. Lo screening di numerosi individui affetti ha supportato la nostra ipotesi, con l���identificazione di una nuova microdelezione di DOCK4 che segrega con la dislessia, e 3 nuove varianti missenso in CNTNAP5 in individui con autismo. Dall���analisi genomica comparativa su array (aCGH) di individui con RM, �� stata identificata una delezione nella regione 7q31.32, che coinvolge il gene CADPS2, in due fratelli con RM e tratti autistici, probabilmente ereditata dalla madre. Lo screening di mutazione di questo gene in individui con autismo o RM, ha portato all���identificazione di 3 varianti non sinonime, assenti nei controlli, ed ereditate per via materna. Poich�� CADPS2 risiede in una regione genomica che contiene loci soggetti ad imprinting, abbiamo ipotizzato che il gene CADPS2 possa essere anch���esso caratterizzato da imprinting, con espressione monoallelica materna. Lo studio di espressione di CADPS2 in cellule del sangue ha avvalorato questa ipotesi, implicando perci�� CADPS2 come un nuovo gene di suscettibilit�� per il RM e DSA.

Caratterizzazione Citogenetico-Molecolare delle alterazioni cromosomiche 3q26 e 1p36 nelle Sindromi Mieloproliferative

L���overespressione dei geni EVI1(3q26) e PRDM16(1p36), �� descritta sia in presenza che in assenza di riarrangiamenti 3q26 e 1p36 in specifici sottogruppi citogenetici di LAM, ed �� associata ad una prognosi sfavorevole. Lo scopo principale del nostro studio �� stato identificare e caratterizzare tramite FISH e RQ-PCR, alterazioni di EVI1 e PRDM16 in pazienti con alterazioni cromosomiche 3q e 1p.Riarrangiamenti di EVI1 si associavano ad alterazioni cromosomiche 3q26, ma, in 6 casi (6/35;17,1%) erano presenti in assenza di coinvolgimenti, in citogenetica convenzionale, della regione 3q26, a causa di meccanismi complessi e/o alterazioni ���criptiche���. Inoltre, abbiamo identificato quattro nuovi riarrangiamenti di EVI1, tra cui due nuove traslocazioni simili presenti in due fratelli. Riarrangiamenti e/o amplificazioni di PRDM16 erano spesso associate ad alterazioni 1p36 (7/14;50%). L���analisi di EVI1 e PRDM16 �� stata estesa ad altri casi con alterazioni -7/7q-, con cariotipo normale, con alterazioni 3q per PRDM16 e con alterazioni 1p per EVI1. L���overespressione di EVI1 era presente solo nel gruppo -7/7q- (10/58;17.2%) ed in un caso si associava ad amplificazione genica, mentre PRDM16 era overespresso in casi di tutti i gruppi analizzati,sia con cariotipi complessi, dove si associava in alcuni casi ad amplificazione genica, sia con cariotipi normali o con singole alterazioni. Il nostro studio dimostra come la FISH permetta di identificare alterazioni dei geni EVI1 e PRDM16, anche in assenza di coinvolgimenti delle regioni 3q26 e 1p36. Riarrangiamenti complessi e/o una scarsa qualit�� dei preparati citogenetici sono le cause principali per la mancata identificazione di queste alterazioni. La RQ-PCR permette di identificare l���overespressione anche nei casi in cui non sia dovuta ad alterazioni citogenetiche. �� importante confermare con FISH e/o RQ-PCR il coinvolgimento di questi due geni, per individuare alla diagnosi pazienti con prognosi sfavorevole e che potranno beneficiare di terapie maggiormente aggressive e/o di trapianto allogenico di cellule staminali.