Il dato genetico: tra diritti della persona e discriminazione genotipica

La dissertazione, partendo dall’analisi dei dati particolari, dei quali approfondisce il concetto e le norme previste per la disciplina del trattamento, arriva ad una completa ed approfondita analisi dei dati genetici, partendo dal loro inquadramento storico e giungendo sino ad evidenziare la simmetria intercorrente tra gli stessi e il tessuto umano (il campione biologico) che, sotto un profilo squisitamente giuridico, è stato sottoposto al medesimo regime di tutela previsto per il dato genetico. La finalità della definizione dei dati genetici è quella di individuare la loro regolamentazione nell’ambito dell’ordinamento interno nonché ad evidenziare la genesi di tale normazione e, soprattutto, la tecnica utilizzata dall’autorità preposta, che ha inteso recepire (anche se il termine, per taluni atti, è improprio) nell’ambito dell’ordinamento italiano una moltitudine di atti normativi di rango internazione e sovranazionale, succedutisi sin dagli anni immediatamente successivi la fine del secondo conflitto mondiale. Mentre la prima parte della dissertazione commenta la normativa in materia di dati particolari, la seconda parte costituisce un corpo unico finalizzato a rappresentare la doppia faccia dei dati genetici, costituita, da un lato, dalla pericolosità -per i diritti della persona- del loro trattamento e, dall’altro, dalla indispensabilità del trattamento stesso per la tutela della salute dell’uomo, come singolo e come soggetto collettivo. Il lavoro pertanto si inserisce in un contesto in cui la regolamentazione nazionale dei dati genetici pare prima di tutto finalizzata anche alla codificazione di alcune libertà fondamentali fino al 2006 di creazione squisitamente e quasi esclusivamente dottrinale, al più con qualche accenno giurisprudenziale (v. sul punto il diritto di non sapere o, anche se si ritiene che lo stesso sia di fatto stato regolamentato dal Codice in materia di protezione dei dati personali, il diritto all’autodeterminazione informativa) dei quali la tesi in commento individua la chiave regolatrice nell’ambito delle norme contenute nell’Autorizzazione del Garante. L’esame della normativa nazionale, costituita appunto dall’Autorizzazione emanata dal Garante ai sensi dell’art. 90 del Codice è pertanto svolto mediante un commento e, in alcuni punti, una critica costruttiva finalizzata ad evidenziare l’estrema difficoltà nella normazione di un trattamento che, da un lato, rischia di aggredire irrimediabilmente i diritti della persona e dall’altro è indispensabile per la tutela degli stessi.

Analisi genetico-molecolare dei linfomi a cellule T periferiche

Molecular profiling of Peripheral T-cell lymphomas not otherwise specified Peripheral T-cell lymphomas (PTCLs) are a heterogeneous group of tumors that the WHO classification basically subdivides into specified and not otherwise specified (NOS). In Western countries, they represent around 12% of all non-Hodgkin's lymphomas. In particular, PTCL/NOS is the commonest subtype, corresponding to about 60-70% of all T-cell lymphomas. However, it remains a complex entity showing great variety regarding either morphology, immunophenotype or clinical behavior. Specially, the molecular pathology of these tumors is still poorly known. In fact, many alteration were found, but no single genes were demonstrated to have a pathogenetic role. Recently, gene expression profiling (GEP) allowed the identification of PTCL/NOS-associated molecular signatures, leading to better understanding of their histogenesis, pathogenesis and prognostication. Interestingly, proliferation pathways are commonly altered in PTCLs, being highly proliferative cases characterized by poorer prognosis. In this study, we aimed to investigate the possible role in PTCL/NOS pathogenesis of selected molecules, known to be relevant for proliferation control. In particular, we analyzed the cell cycle regulators PTEN and CDKN1B/p27, the NF-kB pathway, and the tyrosin kinase PDGFR. First, we found that PTEN and p27 seem to be regulated in PTCL/NOS as in normal T-lymphocytes, as to what expression and cellular localization are concerned, and do not present structural abnormalities in the vast majority of PTCL/NOS. Secondly, NF-kB pathway appeared to be variably activated in PTCL/NOS. In particular, according to NF-kB gene expression levels, the tumors could be divided into two clusters (C1 and C2). Specially, C1 corresponded to cases presenting with a global down-regulation of the entire pathway, while C2 showed over-expression of genes involved in TNF signaling. Notably, by immunohistochemistry, we showed that either the canonical or the alternative NK-kB pathway were activated in around 40% of cases. Finally, we found PGDFRA to be consistently over-expressed (at mRNA and protein level) and activated in almost all PTCLs/NOS. Noteworthy, when investigating possible causes for PDGFRA deregulation, we had evidences that PDGFR over-expression is due to the absence of miR-152, which appeared to be responsible for PDGFRA silencing in normal T-cells. Furthermore, we could demonstrate that its aberrant activation is sustained by an autocrine loop. Importantly, this is the first case, to the best of our knowledge, of hematological tumor in which tyrosin kinase aberrant activity is determined by deregulated miRNA expression and autocrine loop activation. Taken together, our results provide novel insight in PTCL/NOS pathogenesis by opening new intriguing scenarios for innovative therapeutic interventions.

Studio genetico ed epidemiologico su Erysiphe necator agente eziologico dell'Oidio della vite

The objective was to analyse population structure and to determine genetic diversity of Erysiphe necator (syn. Uncinula necator) populations obtained from some vineyards located in the South-East Po valley (Italy). Powdery mildew is one of the most important fungal diseases of grapes (Vitis vinifera L.) throughout the world. The causal agent is the haploid, heterothallic ascomycete E. necator. It is an obligate biotrophic fungus and it can be found only on green organs of plants belonging to the family Vitaceae. For this pathogen, two sympatric populations (groups A and B) have been described in Europe and Australia. The two genetic groups differ at multiple genetic loci and previous studies reported a lack of interfertility among isolates of the two groups. There are now several well documented examples of plant pathogen species, such as Leptosphaeria maculans, Gaeumannomyces graminis var. tritici, Botrytis cinerea and Erysiphe syringae, which are indeed composed of genetically differentiated clades, that have led to the description of new groups or even new species. Several studies have suggested that genetic E. necator group A and B correlated with ecological features of the pathogen; some researchers proposed that group A isolates over-winter as resting mycelium within dormant buds, and in spring originate infected shoots, known as Flag shoots, while group B isolates would survive as ascospores in overwintering cleistothecia. However, the association between genetic groups and mode of over-wintering has been challenged by recent studies reporting that flag-shoot may be originated indifferently by group A or group B isolate. Previous studies observed a strong association between the levels of disease severity at the end of the growing season and the initial compositions of E. necator populations in commercial vineyards. The frequencies of E. necator genetic groups vary considerably among vineyards, and the two groups may coexist in the same vineyard. This finding suggests that we need more information on the genetics and epidemiology of E. necator for optimize the crop management In this study we monitored E. necator populations in different vineyards in Emilia – Romagna region (Italy), where the pathogen overwinters both as flagshoots and as cleistothecia. During the grape growing season, symptomatic leaves were sampled early in the growing season and both leaves and berries later during the epidemic growth of the disease. From each sample, single-conidial isolate was obtained. Each isolates was grown on V. vinifera leaf cv. Primitivo and after harvesting the mycelium, the DNA was purified and used as template for PCR amplification with SCAR primers (Sequences Characterised Amplified Region ), -tubulin, IGS sequences and Microsatellite markers (SSR). Amplified DNA from b-tubulin and IGS loci was digested with AciI and XhoI restriction enzymes, respectively, to show single-nucleotide polymorphisms specific for the two genetic groups. The results obtained indicated that SCAR primers are not useful to study the epidemiology. of E. necator conversely the b-tubulin IGS sequences and SSR. Summarize the results obtained with b-tubulin, IGS sequences, in treated vineyards we have found individuals of group B along all grape growing season, whereas in the untreated vineyard individuals of the two genetic groups A and B coexisted throughout the season, with no significant change of their frequency. DNA amplified from ascospores of single cleistothecia showed the presence of markers diagnostic for either groups A and B and were seldom observed also the coexistence of both groups within a claistothecium. These results indicate that individuals of the two groups mated in nature and were able to produced ascospores. With SSR we showed the possibility of recombination between A and B groups in field isolates. During winter, cleistothecia were collected repeatedly in the same vineyards sampling leaves fallen on ground, exfoliating bark from trunks, and from soil. From each substrate, was assess the percentage of cleistothecia containing viable ascospores. Our results confirmed that cleisthotecia contained viable ascospores, therefore they have the potential to be an additional and important source of primary inoculum in Emilia-Romagna vineyards.

Valutazione dell'impatto della farmacogenetica in ambito di Sanità Pubblica. Analisi del polimorfismo genetico dell'enzima CYP2D6 metabolizzante xenobiotici.

Pharmacogenetic testing provides an outstanding opportunity to improve prescribing safety and efficacy. In Public health policy pharmacogenetics is relevant for personalized therapy and to maximize therapeutic benefit minimizing adverse events. CYP2D6 is known to be a key enzyme responsible for the biotransformation of about 25-30% of extensively used drugs and genetic variations in genes coding for drug-metabolizing enzymes might lead to adverse drug reactions, toxicity or therapeutic failure of pharmacotherapy. Significant interethnic differences in CYP2D6 allele distribution are well established, but immigration is reshaping the genetic background due to interethnic admixture which introduces variations in individual ancestry resulting in distinct level of population structure. The present thesis deals with the genetic determination of the CYP2D6 alleles actually present in the Emilia-Romagna resident population providing insights into the admixture process. A random sample of 122 natives and 175 immigrants from Africa, Asia and South America where characterized considering the present scenario of migration and back migration events. The results are consistent with the known interethnic genetic variation, but introduction of ethnic specific variants by immigrants predicts a heterogeneous admixed population scenario requiring, for drugs prescription and pharmacogenetics studies, an interdisciplinary approach applied in a properly biogeographical and anthropological frame. To translate pharmacogenetics knowledge into clinical practice requires appropriated public health policies, possibly guiding clinicians to evaluate prospectively which patients have the greatest probability of expressing a variant genotype.

Molecular markers for the assessment of genetic variability in threatened plant species

La variabilità genetica è un importante strumento per lo studio e la conservazione della biodiversità in specie rare e minacciate di estinzione. Durante il mio dottorato mi sono quindi occupata di mettere a punto diverse metodologie molecolari al fine di valutare la diversità genetica in due specie rare della flora italiana che presentano problematiche diverse e specifiche. I marcatori arbitrari RAPD e i marcatori semi-arbitrari ISSR sono stati utilizzati per valutare la diversità genetica in Quercus crenata Lam. e per confermare l’ipotesi della sua origine ibridogena dalle due specie presunte parentali Quercus cerris L. e Quercus suber L., essendo Q. crenata presente in Italia settentrionale dove Q. suber è attualmente assente. I marcatori SSR o microsatelliti sono invece stati messi a punto su una specie a rischio di estinzione, endemica dell’Appennino Tosco-Emiliano, Primula apennina Widmer, applicando una metodologia specifica, basata sulla costruzione di una libreria genomica arricchita per l’isolamento di primer specifici. I marcatori RAPD e ISSR, utilizzati su un totale di 85 campioni, hanno mostrato alti livelli di diversità molecolare entro le specie studiate, eccetto per Q. suber le cui popolazioni rappresentano il margine orientale di distribuzione della specie, per questo più sottoposte ad impoverimento genetico. Oltre alla cluster analysis (UPGMA) e alla Analisi delle Componenti Principali effettuate per entrambi i marcatori, che confermano l’ipotesi dell’origine ibrida degli individui di Q. crenata diffusi in Italia Settentrionale, sono stati calcolati l’indice di ibridità basato sul maximum likelihood, che dimostra una introgressione asimmetrica di Q. crenata verso il parentale caratterizzato da superiorità demografica (Q. cerris) e il test di Mantel. Quest’ultimo ha permesso di confrontare i due marcatori RAPD e ISSR utilizzati ottenendo una bassa correlazione, a conferma del fatto che, amplificando tratti differenti del DNA nucleare, i dati non sono sovrapponibili, sebbene forniscano risultati analoghi. Per l’isolamento di loci microsatelliti ipervariabili ho utilizzato il protocolllo FIASCO (Fast isolation by AFLP of sequences containing repeats- Zane et al. 2002) che permette di costruire una libreria genomica arricchita partendo dal DNA estratto da P. apennina. Tale procedura ha previsto la digestione del DNA genomico per la produzione di una miscela di frammenti di DNA. Tramite ibridazione con opportune sonde sono stati isolati i frammenti contenenti i microsatelliti. Sequenziando i cloni ricombinanti, ho ottenuto sequenze contenenti repeats sulle cui regioni fiancheggianti sono stati costruiti 15 coppie di primer che potranno, in seguito, essere utilizzate per definire la quota di riproduzione clonale in P. apennina e per valutare la diversità genetica delle popolazioni che coprono l’areale di distribuzione della specie. Data la loro natura altamente variabile e la loro abbondanza nel DNA, gli SSR saranno, come i marcatori RAPD e gli ISSR, ugualmente validi per lo studio della variabilità genetica e per l’analisi di problematiche specifiche legate alle specie rare.

Analisi spaziale della longevità in Emilia-Romagna

Negli ultimi anni la longevità è divenuto un argomento di notevole interesse in diversi settori scientifici. Le ricerche volte ad indagare i meccanismi che regolano i fattori della longevità si sono moltiplicate nell’ultimo periodo interessando, in maniera diversa, alcune regioni del territorio italiano. Lo studio presentato nella tesi ha l’obiettivo di identificare eventuali aggregazioni territoriali caratterizzate da una significativa propensione alla longevità nella regione Emilia-Romagna mediante l’impiego di metodologie di clustering spaziale, alcune delle quali di recente implementazione. La popolazione in esame è costituita dagli individui residenti in Emilia- Romagna nel quinquennio 2000-2004 suddivisa in classi di età, sesso e comune. L’analisi è di tipo puramente spaziale, in cui l’unità geografica elementare è identificata dal comune, ed è stata condotta separatamente per i due sessi. L’identificazione delle aree regionali ad elevata longevità è avvenuta utilizzando quattro metodologie di clustering spaziale, basate sulla teoria della massima verosimiglianza, che si differenziano tra loro per la modalità di ricerca dei potenziali clusters. La differenza consiste nella capacità di identificare aggregazioni territoriali di forma regolare (spatial scan statistic, Kulldorff e Nagarwalla,1995; Kulldorff,1997, 1999) o dall’andamento geometrico “libero” (flexible scan statistic, Tango e Takahashi,2005; algoritmo genetico, Duczmal et al.,2007; greedy growth search, Yiannakoulias et al.,2007). Le caratteristiche di ciascuna metodologia consentono, in tal modo, di “catturare” le possibili conformazioni geografiche delle aggregazioni presenti sul territorio e la teoria statistica di base, comune ad esse, consente di effettuare agevolmente un confronto tra i risultati ottenuti. La persistenza di un’area caratterizzata da un’elevata propensione alla longevità consente, infatti, di ritenere il cluster identificato di notevole interesse per approfondimenti successivi. Il criterio utilizzato per la valutazione della persistenza di un cluster è stato derivato dalla teoria dei grafi, con particolare riferimento ai multigrafi. L’idea è confrontare, a parità di parametri di ricerca, i grafi associati alle aggregazioni spaziali identificate con le diverse metodologie attraverso una valutazione delle occorrenze dei collegamenti esistenti tra le coppie di vertici. Alcune valutazioni di carattere demografico ed un esame della letteratura esistente sugli studi di longevità, hanno indotto alla definizione di una classe (aperta) di età per rappresentare il fenomeno nella nostra ricerca: sono stati considerati gli individui con età superiore o uguale a 95 anni (indicata con 95+). La misura di sintesi utilizzata per descrivere il fenomeno è un indicatore specifico di longevità, mutuato dalla demografia, indicato con Centenarian Rate (CR) (Robine e Caselli, 2005). Esso è definito dal rapporto tra la popolazione 95+ e la popolazione residente, nello stesso comune, al censimento del 1961. L’idea alla base del CR è confrontare gli individui longevi di un istante temporale con quelli presenti, nella stessa area, circa 40 anni prima dell’osservazione, ipotizzando che l’effetto migratorio di una popolazione possa ritenersi trascurabile oltre i 60 anni di età. La propensione alla longevità coinvolge in maniera diversa le aree del territorio dell’Emilia-Romagna. Le province della regione caratterizzate da una maggiore longevità sono Bologna, Ravenna e parte di Forlì-Cesena mentre la provincia di Ferrara si distingue per un livello ridotto del fenomeno. La distinzione per sesso non appare netta: gli uomini con età 95+, numericamente inferiori alle donne, risiedono principalmente nei comuni delle province di Bologna e Ravenna, con qualche estensione nel territorio forlivese, analogamente a quanto accade per la popolazione femminile che mostra, tuttavia, una maggiore prevalenza nei territori di Bologna e Forlì-Cesena, includendo alcune aree del riminese. Le province occidentali della regione, invece, non risultano interessate significativamente da questo fenomeno. Le metodologie di cluster detection utilizzate nello studio hanno prodotto risultati pressoché simili seppur con criteri di ricerca differenti. La spatial scan statistic si conferma una metodologia efficace e veloce ma il vincolo geometrico regolare imposto al cluster condiziona il suo utilizzo, rivelando una scarsa adattabilità nell’identificazione di aggregazioni irregolari. La metodologia FSC ha evidenziato buone capacità di ricerca e velocità di esecuzione, completata da una descrizione chiara e dettagliata dei risultati e dalla possibilità di poter visualizzare graficamente i clusters finali, anche se con un livello minimo di dettaglio. Il limite principale della metodologia è la dimensione ridotta del cluster finale: l’eccessivo impegno computazionale richiesto dalla procedura induce a fissare il limite massimo al di sotto delle 30 aree, rendendola così utilizzabile solo nelle indagini in cui si ipotizza un’estensione limitata del fenomeno sul territorio. L’algoritmo genetico GA si rivela efficace nell’identificazione di clusters di qualsiasi forma ed estensione, seppur con una velocità di esecuzione inferiore rispetto alle procedure finora descritte. Senza un’adeguata selezione dei parametri di ricerca,la procedura può individuare clusters molto irregolari ed estesi, consigliando l’uso di penalizzazione non nulla in fase di ricerca. La scelta dei parametri di ricerca non è comunque agevole ed immediata e, spesso, è lasciata all’esperienza del ricercatore. Questo modo di procedere, in aggiunta alla mancanza di informazioni a priori sul fenomeno, aumenta il grado di soggettività introdotto nella selezione dei parametri influenzando i risultati finali. Infine, la metodologia GGS richiede un carico computazionale nettamente superiore rispetto a quello necessario per le altre metodologie utilizzate e l’introduzione di due parametri di controllo favorisce una maggiore arbitrarietà nella selezione dei valori di ricerca adeguati; inoltre, la recente implementazione della procedura e la mancanza di studi su dati reali inducono ad effettuare un numero maggiore di prove durante la fase di ricerca dei clusters.

Aspetti cognitivi dell'epilessia frontale notturna

Si tratta di uno studio osservazionale analitico di coorte prospettico volto a rilevare disfunzioni neuropsicologiche nei pazienti affetti da epilessia frontale notturna, attraverso una batteria di test che esplora i seguenti domini cognitivi: intelligenza generale, memoria, linguaggio, funzioni esecutive, attenzione, vigilanza, tempi di reazione, percezione della qualità della vita ed eventuale presenza di sintomi psichiatrici. Lo studio ha un follow up medio di 20 anni e riporta, per la prima volta in letteratura, l’evoluzione clinica dei soggetti che hanno avuto un esordio dell’epilessia in età evolutiva. Fino ad ora, l’epilessia frontale notturna è stata associata a disfunzioni cognitive nei soli casi di famiglie affette e nelle quali è stato possibile rilevare il difetto genetico. Questo studio ha rilevato la prevalenza di disturbi cognitivi e psichici in un campione di 24 soggetti affetti, mediante la somministrazione di una batteria di test specifica. I risultati sono stati analizzati con il programma statistico SPSS. Tutti i soggetti presentano abilità cognitive inferiori alla media in uno o più test ma il quoziente intellettivo risulta normale nei tre quarti del campione. Il ritardo mentale è più frequente e più grave nei soggetti idiopatici rispetto a quelli con alterazioni morfologiche frontali rilevate alla risonanza magnetica. Sono risultati più frequenti i disturbi della memoria, soprattutto quella a lungo termine e del linguaggio rispetto a quelli di tipo disesecutivo. Tutti i soggetti, che non hanno ottenuto un controllo delle crisi, manifestano una percezione della qualità della vita inferiore alla media. E’ stata valutata l’influenza delle variabili cliniche (età di esordio dell’epilessia, frequenza e semeiologia delle crisi, durata della malattia e terapia antiepilettica), le anomalie elettroencefalografiche e le anomalie rilevate alla risonanza magnetica. Le variabili che sono in rapporto con un maggiore numero di disfunzioni neuropsicologiche sono: l’elevata frequenza di crisi all’esordio, l’associazione con crisi in veglia, la presenza di crisi parziali secondariamente generalizzate e l’assunzione di una politerapia. I disturbi psichici prevalgono nei soggetti con anomalie elettroencefalografiche frontali sinistre. I dati neuropsicologici suggeriscono una disfunzione cognitiva prevalentemente fronto-temporale e, assieme ai dati clinici ed elettroencefalografici, sembrano confermare l’origine mesiale e orbitale frontale delle anomalie epilettiche nell’epilessia frontale notturna.

Profilo farmacogenetico di determinanti molecolari dell'attività di cisplatino e gemcitabina in pazienti affetti da tumore polmonare non a piccole cellule

Il carcinoma polmonare rappresenta un problema socio-sanitario di grande rilievo, essendo la prima causa di morte per neoplasia. Il carcinoma polmonare non a piccole cellule (non small cell lung cancer - NSCLC) rappresenta la variante istologica più frequente (80% dei casi di tumore polmonare). Al momento della diagnosi circa il 60-70% dei pazienti presenta una malattia in stadio avanzato o metastatico non essendo suscettibile di trattamento chirurgico. Per questi pazienti il trattamento chemioterapico determina un prolungamento della sopravvivenza e un miglioramento della qualità  della vita rispetto alla sola terapia di supporto, identificandosi come standard terapeutico. L'individuazione del migliore trattamento chemioterapico per questo subset di pazienti rappresenta pertanto una delle principali sfide della ricerca oncologica. I regimi polichemioterapici si possono dividere schematicamente in tre generazioni in relazione all'introduzione nel corso degli anni di nuovi agenti chemioterapici. Con l'avvento dei regimi di terza generazione, il trattamento del NSCLC avanzato sembra aver raggiunto un plateau, mancando infatti chiare dimostrazioni di superiorità  di un regime di ultima generazione rispetto ad un altro. Tra questi l'associazione cisplatino e gemcitabina rappresenta uno dei regimi standard più utilizzati in considerazione del suo favorevole rapporto costo-beneficio. Al fine di migliorare i risultati del trattamento chemioterapico in termini di attività  ed efficacia, una possibilità  consiste nell'individuazione di parametri predittivi che ci consentano di identificare il miglior trattamento per il singolo paziente. Tra i vari parametri predittivi valutabili, un crescente interesse è stato rivolto a quelli di carattere genetico, anche grazie all'avvento di nuove tecniche di biologia molecolare e al sequenziamento del genoma umano che ha dato nuovo impulso a studi di farmacogenetica e farmacogenomica. Sulla base di queste considerazioni, in questa tesi è stato effettuato uno studio mirato a valutare l'espressione di determinanti molecolari coinvolti nel meccanismo di azione di gemcitabina e cisplatino in pazienti affetti dai due tipi istologici principali di NSCLC, adenocarcinomi e carcinomi squamocellulari. Lo studio dei livelli di espressione genica è stata effettuata in tessuti di 69 pazienti affetti da NSCLC arruolati presso l'Istituto Europeo di Oncologia di Milano. In particolare, mediante Real Time PCR è stata valutata l'espressione genica di ERCC1, hENT1, dCK, 5'-NT, CDA, RRM1 e RRM2 in 85 campioni isolati con microdissezione da biopsie provenienti dai tessuti polmonari normali o tumorali o dalle metastasi linfonodali. Le analisi di questi tessuti hanno mostrato differenze significative per i pattern di espressione genica di diversi determinanti molecolari potenzialmente utile nel predire l'efficacia di gemcitabina/cisplatino e per personalizzare i trattamenti in pazienti affetti da cancro. In conclusione, l'evoluzione delle tecniche di biologia molecolare promossa dagli studi di farmacogenetica racchiude in sè notevoli potenzialità  per quanto concerne l'ideazione di nuovi protocolli terapeutici. Identificando le caratteristiche genotipiche e i livelli di espressione geniche di determinanti molecolari implicati nella risposta ai farmaci potremmo infatti predisporre delle mappe di chemiosensibilità-chemioresistenza per ciascun paziente, nell'ottica di approntare di volta in volta le più appropriate terapie antitumorali in base alle caratteristiche genetiche del paziente e della sua patologia neoplastica.

Il genere Rhododendron L.: diversità genetica e fenomeni di ibridazione.

La terra, nel corso della sua storia, ha subito molteplici cambiamenti con la comparsa e scomparsa di numerose specie animali e vegetali. Attualmente, l’estinzioni delle specie, la riduzione degli areali e il depauperamento degli ecosistemi è da ricollegare alle attività dell’uomo. Per tali motivi, in questi ultimi decenni si è iniziato a dare importanza alla conservazione della biodiversità, alla creazione di zone protette e a sviluppare interventi di reintroduzione e rafforzamento di specie rare e a rischio di estinzione. Questo lavoro di tesi si propone di analizzare la variabilità genetica delle popolazioni di Rhododendron ferrugineum L. lungo il suo areale, con particolare attenzione alle aree marginali dell’Appennino, dove la specie rappresenta un caso di pseudo rarità, al fine di valutare lo stato di salute della specie al limite del suo areale e valutare appropriati interventi di conservazione o reintroduzione. Per effettuare le analisi sono stati messi a punto dei marcatori molecolari discontinui, i microsatelliti, che, essendo dei marcatori co-dominati, permettono di valutare differenti parametri legati alla diversità genetica delle popolazioni inclusi i livelli di eterozigotà ed il flusso genico tra popolazioni limitrofe. I campionamenti sono stati effettuati nelle uniche 3 stazioni presenti sugli Appennini. Al fine di confrontare la struttura genetica di queste popolazioni sono state considerate anche popolazioni delle Alpi Marittime, delle Alpi centro-orientali e dei Pirenei. L’analisi della diversità genetica effettuata su questo pool di popolazioni analizzate con 7 marcatori microsatelliti, ha messo in evidenza che le popolazioni relitte dell’Appennino Tosco-Emiliano presentano un ridotto livello di eterozigosità che suggerisce quindi un elevato livello di inbreeding. Si ritiene che ciò sia dovuto alla loro dislocazione sul territorio, che le rende isolate sia tra di loro che dalle popolazioni delle vicine Alpi Marittime. La stima delle relazioni genetiche tra le popolazioni appenniniche e le vicine piante alpine evidenzia come non vi sia scambio genetico tra le popolazioni. Le analisi dei cluster suggeriscono che due delle popolazioni Appenniniche siano più simili alle popolazioni della Alpi Marittime, mentre la terza ha più affinità con le popolazioni delle Alpi centro-orientali. Le popolazioni dei Pirenei risultano essere geneticamente più simili alle popolazioni delle Alpi Marittime, in particolare alle tre popolazioni del versante francese. In questo lavoro abbiamo affrontato anche il problema delle specie ibride. Rhododendron x intermedium Tausch è un ibrido frutto dell’incrocio tra Rhododendron ferrugineum L. e Rhododendron hirsutum L., in grado di incrociarsi sia con altri ibridi, sia con i parentali (fenomeno dell’introgressione). L’origine di questo ibrido risiede nella simpatria delle due specie parentali, che tuttavia, presentano esigenze ecologiche differenti. Ad oggi la presenza di Rhododendron x intermedium è stata accertata in almeno tre stazioni sulle Alpi Italiane, ma la letteratura documenta la sua presenza anche in altre zone dell’Arco Alpino. L’obiettivo di questa ricerca è stato quello di verificare la reale natura ibrida di Rhododendron x intermedium in queste stazioni utilizzando un approccio integrato ossia sia attraverso un’analisi di tipo morfologico sia attraverso un analisi di tipo molecolare. In particolare l’approccio molecolare ha previsto prima un’analisi filogenetica attraverso l’utilizzo di marcatori molecolari filogenetici nucleari e plastidiali (ITS, At103, psbA-trnH e matK) e quindi un’analisi della struttura delle popolazioni della specie ibrida attraverso l’utilizzo di marcatori molecolari microsatelliti. Da un’analisi morfologica, risulta che gli esemplari ibridi possono essere molto differenti tra loro e ciò supporta la formazione di sciami ibridi. Al fine di verificare la natura di questa specie e la struttura delle popolazioni ibride e dei rispettivi parentali, sono state campionate differenti popolazioni in tutta l’area di interesse. I campioni ottenuti sono stati quindi analizzati geneticamente mediante marcatori molecolari del DNA. I risultati ottenuti hanno permesso innanzitutto di confermare l’origine ibrida degli individui di prima generazione della specie Rhododendron x intermedium e quindi di distinguere i parentali dagli ibridi ed evidenziare la struttura genetica delle popolazioni ibride.

Candidate genes affecting fat deposition, carcass composition and meat quality traits in pigs

Pig meat quality is determined by several parameters, such as lipid content, tenderness, water-holding capacity, pH, color and flavor, that affect consumers’ acceptance and technological properties of meat. Carcass quality parameters are important for the production of fresh and dry-cure high-quality products, in particular the fat deposition and the lean cut yield. The identification of genes and markers associated with meat and carcass quality traits is of prime interest, for the possibility of improving the traits by marker-assisted selection (MAS) schemes. Therefore, the aim of this thesis was to investigate seven candidate genes for meat and carcass quality traits in pigs. In particular, we focused on genes belonging to the family of the lipid droplet coat proteins perilipins (PLIN1 and PLIN2) and to the calpain/calpastatin system (CAST, CAPN1, CAPN3, CAPNS1) and on the gene encoding for PPARg-coactivator 1A (PPARGC1A). In general, the candidate genes investigation included the protein localization, the detection of polymorphisms, the association analysis with meat and carcass traits and the analysis of the expression level, in order to assess the involvement of the gene in pork quality. Some of the analyzed genes showed effects on various pork traits that are subject to selection in genetic improvement programs, suggesting a possible involvement of the genes in controlling the traits variability. In particular, significant association results have been obtained for PLIN2, CAST and PPARGC1A genes, that are worthwhile of further validation. The obtained results contribute to a better understanding of biological mechanisms important for pig production as well as for a possible use of pig as animal model for studies regarding obesity in humans.