Marcatura di molecole biologiche a funzione antigenica per lo studio e la caratterizzazione di protocolli di vaccinoterapia in oncologia medica

Dendritic Cells (DCs) derived from human blood monocytes that have been nurtured in GM-CSF and IL-4, followed by maturation in a monocyte-conditioned medium, are the most potent APCs known. These DCs have many features of primary DCs, including the expression of molecules that enhance antigen capture and selective receptors that guide DCs to and from several sites in the body, where they elicit the T cell mediated immune response. For these features, immature DCs (iDC) loaded with tumor antigen and matured (mDC) with a standard cytokine cocktail, are used for therapeutic vaccination in clinical trials of different cancers. However, the efficacy of DCs in the development of immunocompetence is critically influenced by the type (whole lysate, proteins, peptides, mRNA), the amount and the time of exposure of the tumor antigens used for loading in the presentation phase. The aim of the present study was to create instruments to acquire more information about DC antigen uptake and presentation mechanisms to improve the clinical efficacy of DCbased vaccine. In particular, two different tumor antigen were studied: the monoclonal immunoglobulin (IgG or IgA) produced in Myeloma Multiple, and the whole lysate obtained from melanoma tissues. These proteins were conjugated with fluorescent probe (FITC) to evaluate the kinetic of tumor antigen capturing process and its localization into DCs, by cytofluorimetric and fluorescence microscopy analysis, respectively. iDC pulsed with 100μg of IgG-FITC/106 cells were monitored from 2 to 22 hours after loading. By the cytofluorimetric analysis it was observed that the monoclonal antibody was completely captured after 2 hours from pulsing, and was decreased into mDC in 5 hours after maturation stimulus. To monitor the lysate uptake, iDC were pulsed with 80μg of tumor lysate/106 cells, then were monitored in the 2h to 22 hours interval time after loading. Then, to reveal difference between increasing lysate concentration, iDC were loaded with 20-40-80-100-200-400μg of tumor lysate/106 cells and monitored at 2-4-8-13h from pulsing. By the cytofluorimetric analysis, it was observed that, the 20-40-80-100μg uptake, after 8 hours loading was completed reaching a plateau phase. For 200 and 400μg the mean fluorescence of cells increased until 13h from pulsing. The lysate localization into iDC was evaluated with conventional and confocal fluorescence microscopy analysis. In the 2h to 8h time interval from loading an intensive and diffuse fluorescence was observed within the cytoplasmic compartment. Moreover, after 8h, the lysate fluorescence appeared to be organized in a restricted cloudy-shaded area with a typical polarized aspect. In addition, small fluorescent spots clearly appeared with an increment in the number and fluorescence intensity. The nature of these spot-like formations and cloudy area is now being investigated detecting the colocalization of the fluorescence lysate and specific markers for lysosomes, autophagosomes, endoplasmic reticulum and MHCII positive vesicles.

Studio sulla perfusione di fegato e milza in animali non convenzionali mediante ecografia e tomografia computerizzata (TC) con mezzo di contrasto

Il presente studio rappresenta la prima applicazione della tecnica CEUS in alcune delle più diffuse specie non convenzionali, nonché la prima nei rettili. In particolare è stata investigata la perfusione di fegato e milza in 10 conigli, 10 furetti e il fegato in 8 iguane. Per quanto riguarda i mammiferi, la tecnica è risultata di facile attuazione e i risultati ottenuti erano equiparabili a quelli documentati per i piccoli animali. Maggiore variabilità si è messa in evidenza a livello splenico in entrambe le specie e nel coniglio rispetto al furetto. Nelle iguane è stata necessaria una modifica del protocollo a seguito dei tempi più lunghi delle fasi di wash in e di wash out. Le curve ottenute erano caratterizzate da picchi più bassi e TTP più lunghi, con wash out incompleto anche dopo 10 minuti di indagine. Nelle iguane l’indagine del fegato è stata approfondita grazie all’esecuzione di TC dinamiche con MDC, studio pioneristico per quanto riguarda la medicina dei rettili. L’esecuzione è avvenuta senza problemi in anestesia generale. Diffusione del MDC e conseguenti variazione di HU a livello aortico e epatico sono state considerate contemporaneamente, con costruzione di curve HU-tempo piuttosto ripetibili, entrambe caratterizzate da un wash in rapido, un picco, particolarmente alto a livello aortico, e da una fase di wash out più lento, anche qui incompleto dopo i 600 secondi di indagine. Una certa variabilità è stata notata in tre individui, risultato attendibile conseguentemente alla forte dipendenza da fattori intriseci ed estrinseci del metabolismo e della funzionalità epatica dei rettili. L’intero protocollo è stato applicato in un furetto e due iguane patologiche, al fine di evidenziare le potenzialità cliniche delle tecniche. Sebbene il numero esiguo di casi non permetta di trarre conclusioni a questo riguardo, l’ultimo capitolo della tesi vuole essere uno spunto per studi futuri.

Tumori misti epatocolangiocellulari su cirrosi: Aspetti diagnostici e caratteristiche clinico-demografiche

Nel tumore combinato epatocolangiocellulare (CHC) le componenti epatocitarie e colangiocitarie sono entrambe presenti. Obiettivo: valutare gli aspetti diagnostici radiologici e caratteristiche clinico-demografiche del CHC su cirrosi. Raccolti pazienti con CHC su cirrosi afferenti a due centri del Nord Italia (Bologna, S. Orsola-Malpighi e Milano,IRCCS Ca’ Granda Maggiore Hospital) tra 2003-2013, con diagnosi istologica di CHC. FASE 1:confronto tra ecografia con mdc (CEUS), TC cmdc e RM cmdc nella diagnosi e caratterizzazione dei noduli di CHC. Casistica di 35 pazienti e 37 noduli (due recidive CHC incluse). Mediana delle dimensioni: 25 mm. Non si è identificato un pattern contrastografico patognomonico per CHC. Pattern di enhancement arterioso ad anello periferico, suggestivo per forma colangiocitaria, atipico per HCC, presente nel 26%,50%,29% dei noduli a CEUS,TC,RM. La CEUS avrebbe portato a una errata diagnosi di HCC tipico in un numero maggiore di casi (48%) vs TC(15%,p=0.005), e RM(18%,p=0.080).L’indicazione della malignità del nodulo (presenza di wash-out dopo enhancement arterioso), era fornita con maggiore accuratezza da parte della CEUS(78%), vs TC (24%,p<0.0001) e RM(29%,p=0.002). FASE 2:analisi degli aspetti clinico-laboratoristici e prognostici del CHC e confronto tramite match 1:2 con HCC su cirrosi (36 CHC,72 HCC). Nel CHC correlano positivamente con sopravvivenza le terapie “curative” (trapianto, resezione chirurgica, terapie ablative percutanee a radiofrequenza/ alcolizzazione), stadio precoce alla diagnosi, dimensioni e essere in sorveglianza per diagnosi precoce di HCC. Correlano indipendentemente con sopravvivenza stadio precoce di malattia (unifocale, ≤ 2 cm) e essere in programma di sorveglianza(multivariata). Sopravvivenze del CHC sovrapponibili al gruppo HCC a 1 anno, e lievemente inferiori a 3/5 anni (81%, 39%, 21% vs 83%, 59% e 40%,p=0.78,p=0.080 e p=0.14). Sopravvivenza mediana per CHC (2.36 anni) inferiore vs HCC (4.09 anni) pur senza significatività statistica.