Characterization of the molecular mechanisms mediated by the insulin-like growth factor-2 mRNA-binding proteins and Ephrin receptor A2 (EPHA2) signaling in the malignancy of CIC-DUX4 sarcomas

Ewing sarcoma (EWS) and CIC-DUX4 sarcoma (CDS) are pediatric fusion gene-driven tumors of mesenchymal origin characterized by an extremely stable genome and limited clinical solutions. Post-transcriptional regulatory mechanisms are crucial for understanding the development of this class of tumors. RNA binding proteins (RBPs) play a crucial role in the aggressiveness of these tumors. Numerous RBP families are dysregulated in cancer, including IGF2BPs. Among these, IGF2BP3 is a negative prognostic factor in EWS because it promotes cell growth, chemoresistence, and induces the metastatic process. Based on preliminary RNA sequencing data from clinical samples of EWS vs CDS patients, three major axes that are more expressed in CDS have been identified, two of which are dissected in this PhD work. The first involves the transcription factor HMGA2, IGF2BP2-3, and IGF2; the other involves the ephrin receptor system, particularly EphA2. EphA2 is involved in numerous cellular functions during embryonic stages, and its increased expression in adult tissues is often associated with pathological conditions. In tumors, its role is controversial because it can be associated with both pro- and anti-tumoral mechanisms. In EWS, it has been shown to play a role in promoting cell migration and neoangiogenesis. Our study has confirmed that the HMGA2/IGF2BPs/IGF2 axis contributes to CDS malignancy, and Akt hyperactivation has a strong impact on migration. Using loss/gain of function models for EphA2, we confirmed that it is a substrate of Akt, and Akt hyperactivation in CDS triggers ligand-independent activation of EphA2 through phosphorylation of S897. Moreover, the combination of Trabectedin and NVP/BEZ235 partially inhibits Akt/mTOR activation, resulting in reduced tumor growth in vivo. Inhibition of EphA2 through ALWII 41_27 significantly reduces migration in vitro. The project aim is the identification of target molecules in CDS that can distinguish it from EWS and thus develop new targeted therapeutic strategies.

Funzionalizzazione della mandibola dopo ricostruzione con lembo libero rivascolarizzato di fibula "single strut". Al di là del deficit di verticalità.

Obiettivi: Valutare la modalità  più efficace per la riabilitazione funzionale del limbo libero di fibula "single strut", dopo ampie resezioni per patologia neoplastica maligna del cavo orale. Metodi: Da una casistica di 62 ricostruzioni microvascolari con limbo libero di fibula, 11 casi sono stati selezionati per essere riabilitati mediante protesi dentale a supporto implantare. 6 casi sono stati trattati senza ulteriori procedure chirurgiche ad eccezione dell'implantologia (gruppo 1), affrontando il deficit di verticalità  della fibula attraverso la protesi dentaria, mentre i restanti casi sono stati trattati con la distrazione osteogenetica (DO) della fibula prima della riabilitazione protesica (gruppo 2). Il deficit di verticalità  fibula/mandibola è stato misurato. I criteri di valutazione utilizzati includono la misurazione clinica e radiografica del livello osseo e dei tessuti molli peri-implantari, ed il livello di soddisfazione del paziente attraverso un questionario appositamente redatto. Risultati: Tutte le riabilitazioni protesiche sono costituite da protesi dentali avvitate su impianti. L'età  media è di 52 anni, il rapporto uomini/donne è di 6/5. Il numero medio di impianti inseriti nelle fibule è di 5. Il periodo massimo di follow-up dopo il carico masticatorio è stato di 30 mesi per il gruppo 1 e di 38.5 mesi (17-81) di media per il gruppo 2. Non abbiamo riportato complicazioni chirurgiche. Nessun impianto è stato rimosso dai pazienti del gruppo 1, la perdita media di osso peri-implantare registrata è stata di 1,5 mm. Nel gruppo 2 sono stati riportati un caso di tipping linguale del vettore di distrazione durante la fase di consolidazione e un caso di frattura della corticale basale in assenza di formazione di nuovo osso. L'incremento medio di osso in verticalità è stato di 13,6 mm (12-15). 4 impianti su 32 (12.5%) sono andati persi dopo il periodo di follow-up. Il riassorbimento medio peri-implantare, è stato di 2,5 mm. Conclusioni: Le soluzioni più utilizzate per superare il deficit di verticalità  del limbo libero di fibula consistono nell'allestimento del lembo libero di cresta iliaca, nel posizionare la fibula in posizione ideale da un punto di vista protesico a discapito del profilo osseo basale, l'utilizzo del lembo di fibula nella versione descritta come "double barrel", nella distrazione osteogenetica della fibula. La nostra esperienza concerne il lembo libero di fibula che nella patologia neoplastica maligna utilizziamo nella versione "single strut", per mantenere disponibili tutte le potenzialità  di lunghezza del peduncolo vascolare, senza necessità  di innesti di vena. Entrambe le soluzioni, la protesi dentale ortopedica e la distrazione osteogenetica seguita da protesi, entrambe avvitate su impianti, costituiscono soluzioni soddisfacenti per la riabilitazione funzionale della fibula al di là  del suo deficit di verticalità . La prima soluzione ha preso spunto dall'osservazione dei buoni risultati della protesi dentale su impianti corti, avendo un paragonabile rapporto corona/radice, la DO applicata alla fibula, sebbene sia risultata una metodica con un numero di complicazioni più elevato ed un maggior livello di riassorbimento di osso peri-implantare, costituisce in ogni caso una valida opzione riabilitativa, specialmente in caso di notevole discrepanza mandibulo/fibulare. Decisiva è la scelta del percorso terapeutico dopo una accurata valutazione di ogni singolo caso. Vengono illustrati i criteri di selezione provenienti dalla nostra esperienza.

The Integrated European Project "GEHA - GEnetics of Healthy Aging": recruitment, health status assessment and survival of the Italian 90+ sibpairs

The present study is part of the EU Integrated Project “GEHA – Genetics of Healthy Aging” (Franceschi C et al., Ann N Y Acad Sci. 1100: 21-45, 2007), whose aim is to identify genes involved in healthy aging and longevity, which allow individuals to survive to advanced age in good cognitive and physical function and in the absence of major age-related diseases. Aims The major aims of this thesis were the following: 1. to outline the recruitment procedure of 90+ Italian siblings performed by the recruiting units of the University of Bologna (UNIBO) and Rome (ISS). The procedures related to the following items necessary to perform the study were described and commented: identification of the eligible area for recruitment, demographic aspects related to the need of getting census lists of 90+siblings, mail and phone contact with 90+ subjects and their families, bioethics aspects of the whole procedure, standardization of the recruitment methodology and set-up of a detailed flow chart to be followed by the European recruitment centres (obtainment of the informed consent form, anonimization of data by using a special code, how to perform the interview, how to collect the blood, how to enter data in the GEHA Phenotypic Data Base hosted at Odense). 2. to provide an overview of the phenotypic characteristics of 90+ Italian siblings recruited by the recruiting units of the University of Bologna (UNIBO) and Rome (ISS). The following items were addressed: socio-demographic characteristics, health status, cognitive assessment, physical conditions (handgrip strength test, chair-stand test, physical ability including ADL, vision and hearing ability, movement ability and doing light housework), life-style information (smoking and drinking habits) and subjective well-being (attitude towards life). Moreover, haematological parameters collected in the 90+ sibpairs as optional parameters by the Bologna and Rome recruiting units were used for a more comprehensive evaluation of the results obtained using the above mentioned phenotypic characteristics reported in the GEHA questionnaire. 3. to assess 90+ Italian siblings as far as their health/functional status is concerned on the basis of three classification methods proposed in previous studies on centenarians, which are based on: • actual functional capabilities (ADL, SMMSE, visual and hearing abilities) (Gondo et al., J Gerontol. 61A (3): 305-310, 2006); • actual functional capabilities and morbidity (ADL, ability to walk, SMMSE, presence of cancer, ictus, renal failure, anaemia, and liver diseases) (Franceschi et al., Aging Clin Exp Res, 12:77-84, 2000); • retrospectively collected data about past history of morbidity and age of disease onset (hypertension, heart disease, diabetes, stroke, cancer, osteopororis, neurological diseases, chronic obstructive pulmonary disease and ocular diseases) (Evert et al., J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 58A (3): 232-237, 2003). Firstly these available models to define the health status of long-living subjects were applied to the sample and, since the classifications by Gondo and Franceschi are both based on the present functional status, they were compared in order to better recognize the healthy aging phenotype and to identify the best group of 90+ subjects out of the entire studied population. 4. to investigate the concordance of health and functional status among 90+ siblings in order to divide sibpairs in three categories: the best (both sibs are in good shape), the worst (both sibs are in bad shape) and an intermediate group (one sib is in good shape and the other is in bad shape). Moreover, the evaluation wanted to discover which variables are concordant among siblings; thus, concordant variables could be considered as familiar variables (determined by the environment or by genetics). 5. to perform a survival analysis by using mortality data at 1st January 2009 from the follow-up as the main outcome and selected functional and clinical parameters as explanatory variables. Methods A total of 765 90+ Italian subjects recruited by UNIBO (549 90+ siblings, belonging to 258 families) and ISS (216 90+ siblings, belonging to 106 families) recruiting units are included in the analysis. Each subject was interviewed according to a standardized questionnaire, comprising extensively utilized questions that have been validated in previous European studies on elderly subjects and covering demographic information, life style, living conditions, cognitive status (SMMSE), mood, health status and anthropometric measurements. Moreover, subjects were asked to perform some physical tests (Hand Grip Strength test and Chair Standing test) and a sample of about 24 mL of blood was collected and then processed according to a common protocol for the preparation and storage of DNA aliquots. Results From the analysis the main findings are the following: - a standardized protocol to assess cognitive status, physical performances and health status of European nonagenarian subjects was set up, in respect to ethical requirements, and it is available as a reference for other studies in this field; - GEHA families are enriched in long-living members and extreme survival, and represent an appropriate model for the identification of genes involved in healthy aging and longevity; - two simplified sets of criteria to classify 90+ sibling according to their health status were proposed, as operational tools for distinguishing healthy from non healthy subjects; - cognitive and functional parameters have a major role in categorizing 90+ siblings for the health status; - parameters such as education and good physical abilities (500 metres walking ability, going up and down the stairs ability, high scores at hand grip and chair stand tests) are associated with a good health status (defined as “cognitive unimpairment and absence of disability”); - male nonagenarians show a more homogeneous phenotype than females, and, though far fewer in number, tend to be healthier than females; - in males the good health status is not protective for survival, confirming the male-female health survival paradox; - survival after age 90 was dependent mainly on intact cognitive status and absence of functional disabilities; - haemoglobin and creatinine levels are both associated with longevity; - the most concordant items among 90+ siblings are related to the functional status, indicating that they contain a familiar component. It is still to be investigated at what level this familiar component is determined by genetics or by environment or by the interaction between genetics, environment and chance (and at what level). Conclusions In conclusion, we could state that this study, in accordance with the main objectives of the whole GEHA project, represents one of the first attempt to identify the biological and non biological determinants of successful/unsuccessful aging and longevity. Here, the analysis was performed on 90+ siblings recruited in Northern and Central Italy and it could be used as a reference for others studies in this field on Italian population. Moreover, it contributed to the definition of “successful” and “unsuccessful” aging and categorising a very large cohort of our most elderly subjects into “successful” and “unsuccessful” groups provided an unrivalled opportunity to detect some of the basic genetic/molecular mechanisms which underpin good health as opposed to chronic disability. Discoveries in the topic of the biological determinants of healthy aging represent a real possibility to identify new markers to be utilized for the identification of subgroups of old European citizens having a higher risk to develop age-related diseases and disabilities and to direct major preventive medicine strategies for the new epidemic of chronic disease in the 21st century.

Imaging di risonanza magnetica nucleare nello studio del tumore della prostata

Aim of the present study was to evaluate the accuracy of transrectal ultrasound biopsy (TRUS-biopsy) directed to regions with abnormal MRI and/or MRSI (magnetic resonance spectroscopic imaging ) for both the transition (TZ) and the peripheral (PZ) zones in patients who presented with persistent suspect for prostate cancer and with prior negative biopsy. We also evaluated relationship between MRSI results and histopathological findings of biopsy. 54 patients with the aforementioned characteristics underwent MRI/MRSI at least 6 months after prior negative biopsy; interval between MRI/3D-MRSI and the further TRUS-biopsy was less than 3 months. The prostate was divided in 12 regions both for imaging interpretation and biopsy. Moreover one to three cores more were taken from each region with abnormal MRI and/or 3D-MRSI. Twenty-two out of 54 patients presented cancer at MRI/MRSI-directed-TRUS-biopsy. On a patient basis the highest accuracy was obtained by assigning malignancy on a positive finding with MRSI and MRI even though it was not significantly greater than that obtained using MRI alone (area under the ROC curve, AUC: 0.723 vs. 0.676). On a region (n=648) basis the best accuracy was also obtained by considering positive both MRSI and MRI for PZ (0.768) and TZ (0.822). Twenty-eight per cent of cores with prostatitis were false positive findings on MRSI, whereas only 2.7% of benign prostatic hyperplasia was false positive. In conclusion the accuracy of MRI/MRSI-directed biopsies in localization of prostate cancer is good in patient and region analyses. The combination of both MRI and MRSI results makes TRUS-biopsy more accurate particularly in the TZ (0.822) for patients with prior negative biopsies. Histopathological analysis showed that the main limitation of MRSI is the percentage of false positive findings due to prostatitis.

Studio di marcatori immunoistochimici, analisi FISH e ruolo dei microRNA nelle neoplasie gliali di basso e di alto grado

Gliomas are the most common primary brain tumours. Despite advances in surgical techniques, postoperative supportive care, radiation and adjuvant systemic therapy, the life expectancy of patients with high grade glioma has remained essentially poor. Furthermore differential diagnosis among astrocytomas, oligodendrogliomas and oligoastrocytomas is very challenging and subject to inter-observer variability. The purpose of the research was: 1) to investigate a series of high grade and low grade gliomas at gene and protein (immunohistochemistry) levels to disclose possible genetic portraits of malignancy; 2) to verify the utility of Nogo-A, Olig-2 and synaptophysin in providing a correct histological diagnosis of oligodendroglioma and to investigate a possible complementary role in selecting the best areas suitable for detecting 1p/19q codeletion using FISH analysis; 3) to study the role of microRNA in high grade gliomas. In order to obtain these goals large series of brain tumors were studied with DNA microarrays, immunohistochemistry and RT-PCR The results demonstrated that: - Overexpression of IGFBP-2 and CDC20 is highly related to glioblastomas and their immunopositivity can be useful for the identification of glioblastoma in small biopsies. - Nogo-A is the most useful and specific marker in differentiating oigodendrogliomas from other gliomas. Furthermore, using a Nogo-A driven FISH analysis, it is possible to identify a larger number of 1p19q codeletions in gliomas. - microRNAs can be studied in paraffin embedded tissues better than in fresh tissues. A series of six microRNA, significatively deregulated in glioblastomas, may represent a genetic signature with prognostic and predictive value and could constitute candidates for novel anti-cancer therapeutics.

Identificazione di fattori trascrizionali associati al differenziamento neurale in cellule di sarcoma di Ewing: ruolo di NF-kB

Il sarcoma di Ewing (ES) è un tumore maligno pediatrico dell’apparato scheletrico; è associato a una traslocazione specifica codificante la proteina di fusione EWS-FLI1 e all’alta espressione di CD99, una glicoproteina di membrana fisiologicamente coinvolta in diversi processi biologici. EWS-FLI1 e CD99, sono riportati avere ruoli divergenti nella modulazione della malignità e del differenziamento di ES. CD99 inoltre è riportato modulare il pathway di MAPK, il quale interagendo con molteplici fattori di trascrizione partecipa a processi di proliferazione e differenziamento. In questo studio abbiamo investigato in due linee cellulari di ES silenziate per CD99 (TC-71shCD99 e IOR/CARshCD99) l’attività basale di diversi fattori trascrizionali quali: NF-kBp65, AP1, Elk-1, E2F e CREB. L’unico fattore trascrizionale statisticamente significativo è risultato essere NF-kBp65 e abbiamo valutato il suo ruolo nel differenziamento neurale di cellule di ES e la relazione con EWS-FLI1 e CD99. L’attività trascrizionale di NF-kB è stata valutata attraverso gene reporter assay in linee cellulari di ES a diversa espressione di CD99, EWS-FLI1 e NF-kB stesso. Il differenziamento neurale è stato valutato come espressione di βIII-Tubulin in immunofluorescenza. Il silenziamento di CD99 induce una down-modulazione dell’attività trascrizionale di NF-kB, mentre il knockdown di EWS-FLI1 ne induce un’aumento. Inoltre, il silenziamento di EWS-FLI1 non è in grado di contrastare la riduzione dell’attività di NF-kB osservata dopo silenziamento di CD99, suggerendo un ruolo dominante del CD99 nel signaling di NF-kB. Cellule deprivate di CD99 ma non di EWS-FLI1, mostrano un fenotipo differenziato in senso neurale, fenotipo che viene perso quando le cellule sono indotte a sovraesprimere NF-kB. Inoltre, in cellule CD99 positive, il silenziamento di NF-kB induce un leggero differenziamento neurale. In conclusione, questi dati hanno evidenziato il ruolo di NF-kB nel differenziamento di cellule di ES e che potrebbe essere un potenziale target nel ridurre la progressione di questo tumore.

A step forwards in immunomodulation and immunetolerance knowledge. HLA-G expression in co-cultures of peripheral blood mononuclear cells and stem cells after in vitro NGAL stimulation

NGAL (Neutrophil Gelatinase-associated Lipocalin ) is a protein of lipocalin superfamily. Recent literature focused on its biomarkers function in several pathological condition (acute and chronic kidney damage, autoimmune disease, malignancy). NGAL biological role is not well elucidated. Several are the demonstration of its bacteriostatic role. Recent papers have indeed highlight NGAL role in NFkB modulation. The aim of this study is to understand whether NGAL may exert a role in the activation (modulation) of T cell response through the regulation of HLA-G complex, a mediator of tolerance. From 8 healthy donors we obtained peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and we isolated by centrifugation on a Ficoll gradient. Cells were then treated with four concentrations of NGAL (40-320 ng/ml) with or without iron. We performed flow cytometry analysis and ELISA test. NGAL increased the HLA-G expression on CD4+ T cells, with an increasing corresponding to the dose. Iron effect is not of unique interpretation. NGAL adiction affects regulatory T cells increasing in vitro expansion of CD4+ CD25+ FoxP3+ cells. Neutralizing antibody against NGAL decreased HLA-G expression and reduced significantly CD4+ CD25+ FoxP3+ cells percentage. In conclusion, we provided in vitro evidence of NGAL involvement in cellular immunity. The potential role of NGAL as an immunomodulatory molecule has been evaluated: it has been shown that NGAL plays a pivotal role in the induction of immune tolerance up regulating HLA-G and T regulatory cells expression in healthy donors. As potential future scenario we highlight the in vivo role of NGAL in immunology and immunomodulation, and its possible relationship with immunosuppressive therapy efficacy, tolerance induction in transplant patients, and/or in other immunological disorders.

The impact of intraclonal heterogeneity on the outcomes of Multiple Myeloma patients treated with new drugs

Understanding the biology of Multiple Myeloma (MM) is of primary importance in the struggle to achieve a cure for this yet incurable neoplasm. A better knowledge of the mechanism underlying the development of MM can guide us in the development of new treatment strategies. Studies both on solid and haematological tumours have shown that cancer comprises a collection of related but subtly different clones, a feature that has been termed “intra-clonal heterogeneity”. This intra-clonal heterogeneity is likely, from a “Darwinian” natural selection perspective, to be the essential substrate for cancer evolution, disease progression and relapse. In this context the critical mechanism for tumour progression is competition between individual clones (and cancer stem cells) for the same microenvironmental “niche”, combined with the process of adaptation and natural selection. The Darwinian behavioural characteristics of cancer stem cells are applicable to MM. The knowledge that intra-clonal heterogeneity is an important feature of tumours’ biology has changed our way to addressing cancer, now considered as a composite mixture of clones and not as a linear evolving disease. In this variable therapeutic landscape it is important for clinicians and researchers to consider the impact that evolutionary biology and intra-clonal heterogeneity have on the treatment of myeloma and the emergence of treatment resistance. It is clear that if we want to effectively cure myeloma it is of primarily importance to understand disease biology and evolution. Only by doing so will we be able to effectively use all of the new tools we have at our disposal to cure myeloma and to use treatment in the most effective way possible. The aim of the present research project was to investigate at different levels the presence of intra-clonal heterogeneity in MM patients, and to evaluate the impact of treatment on clonal evolution and on patients’ outcomes.

Epigenetic signature in persons with Down Syndrome

Persons affected by Down Syndrome show a heterogeneous phenotype that includes developmental defects and cognitive and haematological disorders. Premature accelerated aging and the consequent development of age associated diseases like Alzheimer Disease (AD) seem to be the cause of higher mortality late in life of DS persons. Down Syndrome is caused by the complete or partial trisomy of chromosome 21, but it is not clear if the molecular alterations of the disease are triggered by the specific functions of a limited number of genes on chromosome 21 or by the disruption of genetic homeostasis due the presence of a trisomic chromosome. As epigenomic studies can help to shed light on this issue, here we used the Infinium HumanMethilation450 BeadChip to analyse blood DNA methylation patterns of 29 persons affected by Down syndrome (DSP), using their healthy siblings (DSS) and mothers (DSM) as controls. In this way we obtained a family-based model that allowed us to monitor possible confounding effects on DNA methylation patterns deriving from genetic and environmental factors. We showed that defects in DNA methylation map in genes involved in developmental, neurological and haematological pathways. These genes are enriched on chromosome 21 but localize also in the rest of the genome, suggesting that the trisomy of specific genes on chromosome 21 induces a cascade of events that engages many genes on other chromosomes and results in a global alteration of genomic function. We also analysed the methylation status of three target regions localized at the promoter (Ribo) and at the 5’ sequences of 18S and 28S regions of the rDNA, identifying differently methylated CpG sites. In conclusion, we identified an epigenetic signature of Down Syndrome in blood cells that sustains a link between developmental defects and disease phenotype, including segmental premature aging.

Identificazione dei meccanismi molecolari responsabili del ruolo oncosoppressivo della molecola CD99 nell'osteosarcoma

CD99, glicoproteina di membrana codificata dal gene MIC2, è coinvolta in numerosi processi cellulari, inclusi adesione, migrazione, apoptosi, differenziamento e regolazione del trafficking intracellulare di proteine, in condizioni fisiologiche e patologiche. Nell’osteosarcoma risulta scarsamente espressa ed ha ruolo oncosoppressivo. L’isoforma completa (CD99wt) e l’isoforma tronca (CD99sh), deleta di una porzione del dominio intracellulare, influenzano in modo opposto la malignità tumorale. In questo studio, comparando cellule di osteosarcoma caratterizzate da differenti capacità metastatiche e diversa espressione di CD99, abbiamo valutato la modulazione dei contatti cellula-cellula, la riorganizzazione del citoscheletro di actina e la modulazione delle vie di segnalazione a valle del CD99, al fine di identificare i meccanismi molecolari regolati da questa molecola e responsabili del comportamento migratorio e invasivo delle cellule di osteosarcoma. L'espressione forzata di CD99wt induce il reclutamento di N-caderina e β-catenina a livello delle giunzioni aderenti ed inibisce l'espressione di molecole cruciali nel processo di rimodellamento del citoscheletro di actina, come ACTR2, ARPC1A, Rho-associated, coiled–coil-containing protein kinase 2 (ROCK2), nonché di ezrina, membro della famiglia ezrin/radixin/moesin e chiaramente associata con la progressione tumorale e la metastatizzazione dell’OS. Gli studi funzionali identificano ROCK2 come mediatore fondamentale nella regolazione della migrazione e della diffusione metastatica dell’osteosarcoma. Mantenendo cSRC in una conformazione inattiva, CD99wt inibisce la segnalazione mediata da ROCK2 inducendo una diminuzione dell’ezrina a livello della membrana accompagnata dalla traslocazione in membrana di N-caderina e β-catenina, principali ponti molecolari per il citoscheletro di actina. La ri-espressione di CD99wt, generalmente presente negli osteoblasti, ma perso nelle cellule di osteosarcoma, attraverso l'inibizione dell'attività di cSrc e ROCK2, aumenta la forza di contatto e riattiva i segnali anti-migratori ostacolando l’azione pro-migratoria, altrimenti dominante, dell’ezrina nell’osteosarcoma. Abbiamo infine valutato la funzione di ROCK2 nel sarcoma di Ewing: nonostante il ruolo oncogenico esercitato da CD99, ROCK2 guida la migrazione cellulare anche in questa neoplasia.

Metodiche di preservazione del polmone isolato per lo studio ecografico: Studio sperimentale

Oggetto della tesi e' l'approfondimento su tecniche e metodiche di preservazione del polmone isolato per lo studio ecografico. E' discussa l'appropriatezza sull'uso degli ultrasuoni in corso di chirurgia mini invasiva polmonare, obiettivo di una ricerca sperimentale. Il razionale dello studio si fonda sull'indicazione all'exeresi chirurgica di noduli polmonari di diametro inferiore al centometro, ovvero di diametro superiore ma localizzati in aree centrali del polmone. Queste lesioni sono sempre piu' frequentente diagnosticate per mezzo di avanzate tecniche di imaging. L'atto chirurgico ha scopo terapeutico quando sia stata posta la diagnosi di neoplasia maligna, diagnostico-terapeutico quando non sia ancora ottenuta la tipizzazione istologica della lesione. La tecnica toracoscopica offre numerosi vantaggi rispetto alle tecniche chirurgiche tradizionali ma presenta il grave limite di non permettere la palpazione diretta del tessuto polmonare e la localizzazione della formazione tumorale quando essa non sia visibile macroscopicamente. Gli ultrasuoni sono stati utilizzati con successo per indirizzare la localizzazione del nodulo polmonare. Scopo dello studio sperimentale e' quello di confrontare tecniche diverse di preservazione del polmone isolato in un modello animale, comparando catatteristiche e prestazioni di sonde ecografiche differenti per tipologia. Del tutto recentemente, in ambito trapiantologico, sono state proposte tecniche di preservazione organica utili ai fini di uno studio anatomico sperimentale particolareggiato (EVLP) e moderna e' da considerarsi la concezione di mezzi tecnici specifici per la localizzazione di bersagli intrapolmonari. La tecnica clinica applicata allo studio del particolare ecografico, nel modello animale, ha reso comprensibile e meglio definito il ruolo delle sonde ecografiche nell'individuazione di forme tumorali suscettibili di exeresi definitiva.

Role of (R)-9-hydroxystearic acid in zebrafish development

9-hydroxystearic acid (9-HSA) belongs to a class of lipid peroxidation products identified in several human and murine cell lines. These products are greatly diminished in tumors compared to normal tissues and their amount is inversely correlated with the malignancy of the tumor. 9-HSA activity has been tested in cancer cell lines, where it showed to act as a histone deacetylase 1 (HDAC1) inhibitor. In particular, in a colon cancer cell line (HT29), its administration resulted in an inhibition of proliferation together with an induction of differentiation. In this thesis the effect of (R)-9-hydroxystearic acid has been tested in vivo on cell proliferation and differentiation processes, in the early stages of zebrafish development. The final aim of this work was to elucidate the role of (R)-9-HSA in the control of cell differentiation and proliferation during normal development, in order to better understand its molecular control of cancerogenesis. The molecule has been administered via injection in the yolk of zebrafish embryos. The analysis of the histone acetylation pattern showed a hyperacetilation of histone H4 after treatment with the molecule, as detectable in HDAC1 mutants. (R)-9-HSA was also demonstrated to interfere with the signaling pathways that regulate proliferation and differentiation in zebrafish retina and hindbrain. This resulted in a reduction of proliferation in the hindbrain at 24 hours post injection (hpi), and in a hyperproliferation at 48 and 72 hpi in the retina, with a concomitant inhibition of differentiation. Finally, (R)-9-HSA effects were evident on proliferation of stem cell located in the ciliary marginal zone (CMZ) of the retina. The presence of ROS and 4-hydroxynoneal in the CMZ of wild-type embryos supports the hypothesis that oxidative stress could regulate stem cells fate in zebrafish retina.

Tumori misti epatocolangiocellulari su cirrosi: Aspetti diagnostici e caratteristiche clinico-demografiche

Nel tumore combinato epatocolangiocellulare (CHC) le componenti epatocitarie e colangiocitarie sono entrambe presenti. Obiettivo: valutare gli aspetti diagnostici radiologici e caratteristiche clinico-demografiche del CHC su cirrosi. Raccolti pazienti con CHC su cirrosi afferenti a due centri del Nord Italia (Bologna, S. Orsola-Malpighi e Milano,IRCCS Ca’ Granda Maggiore Hospital) tra 2003-2013, con diagnosi istologica di CHC. FASE 1:confronto tra ecografia con mdc (CEUS), TC cmdc e RM cmdc nella diagnosi e caratterizzazione dei noduli di CHC. Casistica di 35 pazienti e 37 noduli (due recidive CHC incluse). Mediana delle dimensioni: 25 mm. Non si è identificato un pattern contrastografico patognomonico per CHC. Pattern di enhancement arterioso ad anello periferico, suggestivo per forma colangiocitaria, atipico per HCC, presente nel 26%,50%,29% dei noduli a CEUS,TC,RM. La CEUS avrebbe portato a una errata diagnosi di HCC tipico in un numero maggiore di casi (48%) vs TC(15%,p=0.005), e RM(18%,p=0.080).L’indicazione della malignità del nodulo (presenza di wash-out dopo enhancement arterioso), era fornita con maggiore accuratezza da parte della CEUS(78%), vs TC (24%,p<0.0001) e RM(29%,p=0.002). FASE 2:analisi degli aspetti clinico-laboratoristici e prognostici del CHC e confronto tramite match 1:2 con HCC su cirrosi (36 CHC,72 HCC). Nel CHC correlano positivamente con sopravvivenza le terapie “curative” (trapianto, resezione chirurgica, terapie ablative percutanee a radiofrequenza/ alcolizzazione), stadio precoce alla diagnosi, dimensioni e essere in sorveglianza per diagnosi precoce di HCC. Correlano indipendentemente con sopravvivenza stadio precoce di malattia (unifocale, ≤ 2 cm) e essere in programma di sorveglianza(multivariata). Sopravvivenze del CHC sovrapponibili al gruppo HCC a 1 anno, e lievemente inferiori a 3/5 anni (81%, 39%, 21% vs 83%, 59% e 40%,p=0.78,p=0.080 e p=0.14). Sopravvivenza mediana per CHC (2.36 anni) inferiore vs HCC (4.09 anni) pur senza significatività statistica.

Perdite aeree prolungate dopo resezione polmonare

Il tumore del polmone e una delle neoplasie più diagnosticate dal 1985 e rimane ancora oggi la causa più frequente di morte cancro-correlata nel mondo. Una resezione polmonare anatomica completa continua ad essere il cardine della terapia per il tumore non a piccole cellule. Perdite aeree prolungate (PAL) sono la più comune complicanza dopo una chirurgia polmonare e sono state riportate con un’incidenza compresa tra il 3-26%, simile sia nelle resezioni polmonari per via toracotomica sia in quelle per via toracoscopica. Fattori di rischio descritti sono scissure interlobari incomplete, patologie polmonari sottostanti (come enfisema, fibrosi, tubercolosi o neoplasie), aderenze pleuriche, pazienti anziani (>75 anni) e bassa capacita di diffusione. Lo sviluppo di strumentazione all’avanguardia e di nuove tecniche chirurgiche ha contribuito a ridurre l’incidenza di queste complicanze. Considerando l’alto impatto clinico e socio-economico di queste problematiche, e stata inoltre sviluppata una varietà di complementari naturali e materiali sintetici molti utili nella gestione delle perdite aeree.

Patologie tiroidee e surrenaliche del cane e del gatto: aspetti epidemiologici, clinici e clinico-patologici

L’ipertiroidismo felino rappresenta oggi la più comune endocrinopatia della specie. I capitoli 2 e 3 costituiscono una revisione della letteratura in merito agli aspetti clinici, diagnostici e terapeutici della patologia. Il capitolo 4 indaga il ruolo della dimetilarginina simmetrica (SDMA) come marker di funzionalità renale nei gatti ipertiroidei prima e dopo terapia medica. La patologia tiroidea più comune nel cane è l’ipotiroidismo. Nello studio riportato al capitolo 5 sono state indagate le performance diagnostiche di freeT3, freeT4, rT3, 3,3-T2 e 3,5-T2, misurati tramite LC-MS/MS, nel differenziare tra cani ipotiroidei, cani con patologie non-tiroidee e cani sani. La presenza di una possibile correlazione tra la gravità della condizione clinica dei pazienti ipotiroidei, le variabili emato-chimiche e le concentrazioni sieriche di cTSH è stata valutata nel capitolo 6. Il capitolo 7 valuta l’andamento dell’SDMA in cani ipotiroidei prima e dopo supplementazione ormonale. A differenza della Sindrome di Cushing dell’uomo, che è considerata una malattia rara, nel cane l’ipercortisolismo spontaneo (HC) è una delle endocrinopatie più comuni. Gli aspetti epidemiologici dell’HC e la ricerca di un metodo di monitoraggio alternativo al test di stimolazione con ACTH nei cani trattati con Trilostano sono stati approfonditi rispettivamente nei capitoli 8 e 9. A differenza dell'HC, l'ipoadrenocorticismo primario (PH) è una patologia rara nel cane. Lo scopo dello studio riportato nel capitolo 10 consiste nel descrivere le frazioni escretorie degli elettroliti urinari nei cani con PH e di indagare se esse possano rappresentare un utile supporto alla diagnosi e al trattamento del PH canino. Il riscontro accidentale di masse surrenaliche rappresenta una criticità diagnostica. Infatti, può essere difficile distinguere morfologicamente tra lesioni corticali e midollari e tra lesioni maligne e benigne. Nel capitolo 11 vengono descritti i rilievi immunoistochimici dell'incidentaloma surrenalico nel cane e viene valutato il ruolo del Ki-67 PI come indicatore di malignità.