Virus oncogeni a dna in tumori umani: studio delle infezioni da papillomavirus e poliomavirus in neoplasie di diversa origine.

I virus tumorali inducono oncogenesi nel loro ospite naturale o in sistemi animali sperimentali, manipolando diverse vie cellulari. Ad oggi, sono stati identificati sette virus capaci di causare specifici tumori umani. Inoltre HPV, JCV ed SV40, sono stati associati con un grande numero di tumori umani in sedi corporee non convenzionali, ma, nonostante molti anni di ricerca, nessuna eziologia virale è stata ancora confermata. Lo scopo di questo studio è stato di valutare la presenza ed il significato sia di JCV ed SV40 in tumori ossei umani, e di HPV nel carcinoma della mammella (BC), galattoforectomie (GF), secrezioni mammarie patologiche (ND) e glioblastoma multiforme (GBM). Tecniche di biologia molecolare sono state impiegate per esaminare campioni di tessuto tumorale di 70 tumori ossei (20 osteosarcomi [OS], 20 tumori a cellule giganti [TCG], 30 condrosarcomi [CS]), 168 BCs , 30 GFs, 59 GBM e 30 campioni di ND. Il genoma di SV40 e JCV è stato trovato nel 70% dei CS + 20% degli OS, e nel 13% dei CS +10% dei TCG, rispettivamente. Il DNA di HPV è stato rilevato nel 30% dei pazienti con BC, nel 27% dei campioni GF e nel 13% dei NDs. HPV16 è stato il genotipo maggiormente osservato in tutti questi campioni, seguito da HPV18 e HPV35. Inoltre, il DNA di HPV è stato trovato nel 22% dei pazienti con GBM, in questo tumore HPV6 era il tipo più frequentemente rilevato, seguito da HPV16. L’ ISH ha mostrato che il DNA di HPV è situato all’interno di cellule tumorali mammarie e di GBM. I nostri risultati suggeriscono un possibile ruolo di JCV, SV40 e HPV in questi tumori, se non come induttori come promotori del processo neoplastico, tuttavia diversi criteri devono ancora essere soddisfatti prima di chiarirne il ruolo.

Valutazione dell’impiego dei test per la genotipizzazione di HPV e l’espressione degli oncogeni virali nel follow-up di donne conizzate per lesioni cervicali di alto grado nello screening del cervico-carcinoma della Regione Emilia-Romagna

Obiettivi: Valutare la prevalenza dei diversi genotipi di HPV in pazienti con diagnosi di CIN2/3 nella Regione Emilia-Romagna, la persistenza genotipo-specifica di HPV e l’espressione degli oncogeni virali E6/E7 nel follow-up post-trattamento come fattori di rischio di recidiva/persistenza o progressione di malattia; verificare l’applicabilità di nuovi test diagnostici biomolecolari nello screening del cervicocarcinoma. Metodi: Sono state incluse pazienti con citologia di screening anormale, sottoposte a trattamento escissionale (T0) per diagnosi di CIN2/3 su biopsia mirata. Al T0 e durante il follow-up a 6, 12, 18 e 24 mesi, oltre al Pap test e alla colposcopia, sono state effettuate la ricerca e la genotipizzazione dell'HPV DNA di 28 genotipi. In caso di positività al DNA dei 5 genotipi 16, 18, 31, 33 e/o 45, si è proceduto alla ricerca dell'HPV mRNA di E6/E7. Risultati preliminari: Il 95.8% delle 168 pazienti selezionate è risultato HPV DNA positivo al T0. Nel 60.9% dei casi le infezioni erano singole (prevalentemente da HPV 16 e 31), nel 39.1% erano multiple. L'HPV 16 è stato il genotipo maggiormente rilevato (57%). Il 94.3% (117/124) delle pazienti positive per i 5 genotipi di HPV DNA sono risultate mRNA positive. Abbiamo avuto un drop-out di 38/168 pazienti. A 18 mesi (95% delle pazienti) la persistenza dell'HPV DNA di qualsiasi genotipo era del 46%, quella dell'HPV DNA dei 5 genotipi era del 39%, con espressione di mRNA nel 21%. Abbiamo avuto recidiva di malattia (CIN2+) nel 10.8% (14/130) a 18 mesi. Il pap test era negativo in 4/14 casi, l'HPV DNA test era positivo in tutti i casi, l'mRNA test in 11/12 casi. Conclusioni: L'HR-HPV DNA test è più sensibile della citologia, l'mRNA test è più specifico nell'individuare una recidiva. I dati definitivi saranno disponibili al termine del follow-up programmato.

Profili di espressione genetica ed epigenetica ad impatto prognostico e predittivo nel carcinoma squamoso e nelle lesioni potenzialmente maligne del cavo orale

Il carcinoma squamoso orale (CSO) è spesso preceduto da lesioni definite potenzialmente maligne tra cui la leucoplachia e il lichen ma una diagnosi precoce avviene ancora oggi in meno della metà dei casi. Inoltre spesso un paziente trattato per CSO svilupperà secondi tumori. Scopo del lavoro di ricerca è stato: 1) Studiare, mediante metodica di next generation sequencing, lo stato di metilazione di un gruppo di geni a partire da prelievi brushing del cavo orale al fine di identificare CSO o lesioni ad alto rischio di trasformazione maligna. 2) Valurare la relazione esistente tra sovraespressione di p16INK4A e presenza di HPV in 35 pazienti affetti da lichen 3) Valutare la presenza di marker istopatologici predittivi di comparsa di seconde manifestazioni tumorali 4) valutare la relazione clonale tra tumore primitivo e metastasi linfonodale in 8 pazienti mediante 2 metodiche di clonalità differenti: l’analisi di mtDNA e delle mutazioni del gene TP53. I risultati hanno mostrato: 1) i geni ZAP70 e GP1BB hanno presentato un alterato stato di metilazione rispettivamente nel 100% e nel 90,9% di CSO e lesioni ad alto rischio, mentre non sono risultati metilati nei controlli sani; ipotizzando un ruolo come potenziali marcatori per la diagnosi precoce nel CSO. 2)Una sovraespressione di p16INK4A è risultata in 26/35 pazienti affetti da lichen ma HPV-DNA è stato identificato in soli 4 campioni. Nessuna relazione sembra essere tra sovraespressione di p16INK4A e virus HPV. 3)L’invasione perineurale è risultato un marker predittivo della comparsa di recidiva locale e metastasi linfonodale, mentre lo stato dei margini chirurgici si è rilevato un fattore predittivo per la comparsa di secondi tumori primitivi 4) Un totale accordo nei risultati c’è stato tra analisi di mtDNA e analisi di TP53 e le due metodiche hanno identificato la presenza di 4 metastasi linfonodali non clonalmente correlate al tumore primitivo.

Genomic characterization of the italian wolf (Canis lupus): the genes involved in black coat colour determination and application of microarray technique for snps detection.

This study provides a comprehensive genetic overview on the endangered Italian wolf population. In particular, it focuses on two research lines. On one hand, we focalised on melanism in wolf in order to isolate a mutation related with black coat colour in canids. With several reported black individuals (an exception at European level), the Italian wolf population constituted a challenging research field posing many unanswered questions. As found in North American wolf, we reported that melanism in the Italian population is caused by a different melanocortin pathway component, the K locus, in which a beta-defensin protein acts as an alternative ligand for the Mc1r. This research project was conducted in collaboration with Prof. Gregory Barsh, Department of Genetics and Paediatrics, Stanford University. On the other hand, we performed analysis on a high number of SNPs thanks to a customized Canine microarray useful to integrate or substitute the STR markers for genotyping individuals and detecting wolf-dog hybrids. Thanks to DNA microchip technology, we obtained an impressive amount of genetic data which provides a solid base for future functional genomic studies. This study was undertaken in collaboration with Prof. Robert K. Wayne, Department of Ecology and Evolutionary Biology, University of California, Los Angeles (UCLA).

Transcriptional functions of DNA Topoisomerases at a genome-wide scale and a single gene levels

The DNA topology is an important modifier of DNA functions. Torsional stress is generated when right handed DNA is either over- or underwound, producing structural deformations which drive or are driven by processes such as replication, transcription, recombination and repair. DNA topoisomerases are molecular machines that regulate the topological state of the DNA in the cell. These enzymes accomplish this task by either passing one strand of the DNA through a break in the opposing strand or by passing a region of the duplex from the same or a different molecule through a double-stranded cut generated in the DNA. Because of their ability to cut one or two strands of DNA they are also target for some of the most successful anticancer drugs used in standard combination therapies of human cancers. An effective anticancer drug is Camptothecin (CPT) that specifically targets DNA topoisomerase 1 (TOP 1). The research project of the present thesis has been focused on the role of human TOP 1 during transcription and on the transcriptional consequences associated with TOP 1 inhibition by CPT in human cell lines. Previous findings demonstrate that TOP 1 inhibition by CPT perturbs RNA polymerase (RNAP II) density at promoters and along transcribed genes suggesting an involvement of TOP 1 in RNAP II promoter proximal pausing site. Within the transcription cycle, promoter pausing is a fundamental step the importance of which has been well established as a means of coupling elongation to RNA maturation. By measuring nascent RNA transcripts bound to chromatin, we demonstrated that TOP 1 inhibition by CPT can enhance RNAP II escape from promoter proximal pausing site of the human Hypoxia Inducible Factor 1 (HIF-1) and c-MYC genes in a dose dependent manner. This effect is dependent from Cdk7/Cdk9 activities since it can be reversed by the kinases inhibitor DRB. Since CPT affects RNAP II by promoting the hyperphosphorylation of its Rpb1 subunit the findings suggest that TOP 1inhibition by CPT may increase the activity of Cdks which in turn phosphorylate the Rpb1 subunit of RNAP II enhancing its escape from pausing. Interestingly, the transcriptional consequences of CPT induced topological stress are wider than expected. CPT increased co-transcriptional splicing of exon1 and 2 and markedly affected alternative splicing at exon 11. Surprisingly despite its well-established transcription inhibitory activity, CPT can trigger the production of a novel long RNA (5’aHIF-1) antisense to the human HIF-1 mRNA and a known antisense RNA at the 3’ end of the gene, while decreasing mRNA levels. The effects require TOP 1 and are independent from CPT induced DNA damage. Thus, when the supercoiling imbalance promoted by CPT occurs at promoter, it may trigger deregulation of the RNAP II pausing, increased chromatin accessibility and activation/derepression of antisense transcripts in a Cdks dependent manner. A changed balance of antisense transcripts and mRNAs may regulate the activity of HIF-1 and contribute to the control of tumor progression After focusing our TOP 1 investigations at a single gene level, we have extended the study to the whole genome by developing the “Topo-Seq” approach which generates a map of genome-wide distribution of sites of TOP 1 activity sites in human cells. The preliminary data revealed that TOP 1 preferentially localizes at intragenic regions and in particular at 5’ and 3’ ends of genes. Surprisingly upon TOP 1 downregulation, which impairs protein expression by 80%, TOP 1 molecules are mostly localized around 3’ ends of genes, thus suggesting that its activity is essential at these regions and can be compensate at 5’ ends. The developed procedure is a pioneer tool for the detection of TOP 1 cleavage sites across the genome and can open the way to further investigations of the enzyme roles in different nuclear processes.

Human papillomavirus (HPV) and associated diseases: between applied diagnostic and basic research

Human Papillomavirus (HPV) is the cause of cervical cancers (among these, adenocarcinoma, AdCa) and is associated to a subgroup of oropharyngeal carcinomas (OPSCCs). Even if the risk for cancer development is linked to the infection by some viral genotypes, mainly HPV16 and 18, viral DNA alone seems not to be sufficient for diagnosis. Moreover, the role of the virus in OPSCCs has not been totally clarified yet. In the first part of the thesis, the performances concerning viral genotyping in clinical cervical samples of a new pyrosequencing-based test and a well-known hybridization-based assay have been compared. Similar results between the methods have been obtained. However, the former showed advantages in detecting intratype variants, higher specificity and a broader spectrum of detectable HPV types. The second part deals with the evaluation of virological markers (genotyping, viral oncoproteins expression, viral load, physical state and CpG methylation of HPV16 genome) in the diagnosis/prognosis of cervical AdCa and HPV-associated OPSCCs. HPV16 has been confirmed the most prevalent genotype in both the populations. Interestingly, the mean methylation frequency of viral DNA at the early promoter showed the tendency to be associated to invasion for cervical AdCa and to a worse prognosis for OPSCCs, suggesting a promising role as diagnostic/prognostic biomarker. The experiments of the third part were performed at the DKFZ in Heidelberg (Germany) and dealt with the analysis of the response to IFN-k transfection in HPV16-positive cervical cancer and head&neck carcinoma cell lines to evaluate its potential role as new treatment. After 24h, we observed increased IFN-b expression which lead to the up-regulation of genes involved in the antigens presentation pathway (MHC class I and immunoproteasome) and antiviral response as well, in particular in cervical cancer cell lines. This fact suggested also the presence of different HPV-mediated carcinogenic pathways between the two anatomical districts.

Electrochemical sensing strategies for the detection of interactions between biological macromolecules

Electrochemical biosensors provide an attractive means to analyze the content of a biological sample due to the direct conversion of a biological event to an electronic signal, enabling the development of cheap, small, portable and simple devices, that allow multiplex and real-time detection. At the same time nanobiotechnology is drastically revolutionizing the biosensors development and different transduction strategies exploit concepts developed in these field to simplify the analysis operations for operators and end users, offering higher specificity, higher sensitivity, higher operational stability, integrated sample treatments and shorter analysis time. The aim of this PhD work has been the application of nanobiotechnological strategies to electrochemical biosensors for the detection of biological macromolecules. Specifically, one project was focused on the application of a DNA nanotechnology called hybridization chain reaction (HCR), to amplify the hybridization signal in an electrochemical DNA biosensor. Another project on which the research activity was focused concerns the development of an electrochemical biosensor based on a biological model membrane anchored to a solid surface (tBLM), for the recognition of interactions between the lipid membrane and different types of target molecules.