Diagnostica anatomopatologica nelle malattie infettive del suino: co-localizzazione agenti patogeni e lesioni, limiti ed utilità

Il processo di intensificazione dell’allevamento suinicolo ha comportato conseguenze importanti dal punto di vista sanitario. Nei moderni sistemi di produzione la salute è compromessa a causa di malattie multifattoriali e l'identificazione degli agenti casuali di malattia non può basarsi esclusivamente sul risultato di un unico test diagnostico. La maggior parte dei patogeni è ubiquitaria, quindi l'identificazione di un agente infettivo suggerisce solo una possibile diagnosi. La patologia gioca un ruolo chiave nel determinare la causalità nella diagnosi delle malattie infettive. L'istopatologia consente di correlare la presenza dell'agente infettivo con le lesioni microscopiche caratteristiche: in base alla disponibilità di anticorpi o sonde per rilevare rispettivamente la presenza di antigeni o del genoma di virus o batteri nelle sezioni istologiche, l'istopatologia è utile per determinare il nesso causale con la malattia. L'introduzione di questa tesi è incentrata sulla discussione del ruolo della patologia nelle malattie infettive del suino, seguita dalla descrizione del corretto campionamento per l'esame istopatologico nella diagnosi delle malattie respiratorie, enteriche e riproduttive. La sezione sperimentale riporta i risultati delle indagini diagnostiche in patologia suina condotte per definire il ruolo di PCV2 e PRRSV nel complesso delle malattie respiratorie del suino (PRDC)(capitolo 2) e per definire un percorso diagnostico per l'enteropatia proliferativa suina causata da Lawsonia intracellularis ai fini dell'implementazione dell'accuratezza diagnostica (capitolo 3). Il capitolo 4 descrive l'uso dell'istopatologia come componente metodologica essenziale per valutare l'efficacia protettiva dei vaccini negli studi di challenge vaccinazione-infezione. Il capitolo descrive i risultati ottenuti in due successive sperimentazioni per valutare l'efficacia di due vaccini sperimentali per PCV2, il primo formulato con ceppo PCV2b inattivato somministrato a differenti dosi di antigene; il secondo formulato con antigene "Cap" ricombinante non assemblato in particelle simil-virali (VLP).

Profilo farmacogenetico di determinanti molecolari dell'attività di cisplatino e gemcitabina in pazienti affetti da tumore polmonare non a piccole cellule

Il carcinoma polmonare rappresenta un problema socio-sanitario di grande rilievo, essendo la prima causa di morte per neoplasia. Il carcinoma polmonare non a piccole cellule (non small cell lung cancer - NSCLC) rappresenta la variante istologica più frequente (80% dei casi di tumore polmonare). Al momento della diagnosi circa il 60-70% dei pazienti presenta una malattia in stadio avanzato o metastatico non essendo suscettibile di trattamento chirurgico. Per questi pazienti il trattamento chemioterapico determina un prolungamento della sopravvivenza e un miglioramento della qualità  della vita rispetto alla sola terapia di supporto, identificandosi come standard terapeutico. L'individuazione del migliore trattamento chemioterapico per questo subset di pazienti rappresenta pertanto una delle principali sfide della ricerca oncologica. I regimi polichemioterapici si possono dividere schematicamente in tre generazioni in relazione all'introduzione nel corso degli anni di nuovi agenti chemioterapici. Con l'avvento dei regimi di terza generazione, il trattamento del NSCLC avanzato sembra aver raggiunto un plateau, mancando infatti chiare dimostrazioni di superiorità  di un regime di ultima generazione rispetto ad un altro. Tra questi l'associazione cisplatino e gemcitabina rappresenta uno dei regimi standard più utilizzati in considerazione del suo favorevole rapporto costo-beneficio. Al fine di migliorare i risultati del trattamento chemioterapico in termini di attività  ed efficacia, una possibilità  consiste nell'individuazione di parametri predittivi che ci consentano di identificare il miglior trattamento per il singolo paziente. Tra i vari parametri predittivi valutabili, un crescente interesse è stato rivolto a quelli di carattere genetico, anche grazie all'avvento di nuove tecniche di biologia molecolare e al sequenziamento del genoma umano che ha dato nuovo impulso a studi di farmacogenetica e farmacogenomica. Sulla base di queste considerazioni, in questa tesi è stato effettuato uno studio mirato a valutare l'espressione di determinanti molecolari coinvolti nel meccanismo di azione di gemcitabina e cisplatino in pazienti affetti dai due tipi istologici principali di NSCLC, adenocarcinomi e carcinomi squamocellulari. Lo studio dei livelli di espressione genica è stata effettuata in tessuti di 69 pazienti affetti da NSCLC arruolati presso l'Istituto Europeo di Oncologia di Milano. In particolare, mediante Real Time PCR è stata valutata l'espressione genica di ERCC1, hENT1, dCK, 5'-NT, CDA, RRM1 e RRM2 in 85 campioni isolati con microdissezione da biopsie provenienti dai tessuti polmonari normali o tumorali o dalle metastasi linfonodali. Le analisi di questi tessuti hanno mostrato differenze significative per i pattern di espressione genica di diversi determinanti molecolari potenzialmente utile nel predire l'efficacia di gemcitabina/cisplatino e per personalizzare i trattamenti in pazienti affetti da cancro. In conclusione, l'evoluzione delle tecniche di biologia molecolare promossa dagli studi di farmacogenetica racchiude in sè notevoli potenzialità  per quanto concerne l'ideazione di nuovi protocolli terapeutici. Identificando le caratteristiche genotipiche e i livelli di espressione geniche di determinanti molecolari implicati nella risposta ai farmaci potremmo infatti predisporre delle mappe di chemiosensibilità-chemioresistenza per ciascun paziente, nell'ottica di approntare di volta in volta le più appropriate terapie antitumorali in base alle caratteristiche genetiche del paziente e della sua patologia neoplastica.

Marker molecolari relativi all'infezione da Papillomavirus umani: significato diagnostico e prognostico in lesioni virus-correlate

Introduzione: Il cervico-carcinoma è la seconda neoplasia maligna per incidenza e mortalità nelle donne in tutto il mondo dopo il cancro al seno. L’infezione persistente da Papillomavirus Umani (HPV) è causa necessaria dell’insorgenza del cervico-carcinoma e delle sue lesioni pre-cancerose. L’infezione da HPV si associa anche ad altri carcinomi del distretto ano-genitale (a livello anale, vulvare, vaginale e del pene) e a circa il 25% dei carcinomi squamosi dell’orofaringe. I circa 40 genotipi di HPV che infettano la mucosa genitale vengono suddivisi in alto rischio (HR-HPV) e basso rischio (LR-HPV) oncogeno a seconda della alta e bassa associazione con la neoplasia cervicale. I 13 genotipi a più alto rischio oncogeno sono 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 e 68. Di questi, otto (16, 18, 31, 33, 35, 45, 52 e 58) sono associati alla maggior parte dei carcinomi cervicali (circa 89%) e i genotipi 16 e 18 da soli sono riscontrati nel 70% circa delle neoplasie. L’insorgenza e progressione delle lesioni preneoplastiche cervicali è, però, associata non solo alla presenza di HPV ad alto rischio, ma, soprattutto, alla persistenza virale (> 18 mesi), alla capacità di integrazione degli HPV ad alto rischio e alla conseguente sovraespressione delle oncoproteine E6/E7. Inoltre, l’integrazione è spesso favorita da un’alta carica virale soprattutto per quanto riguarda alcuni genotipi (HPV16 e 18). L’infezione da HPV non interessa solo la cervice uterina ma tutto il distretto ano-genitale e quello testa-collo. L’HPV, in particolare il genotipo 16, è implicato, infatti, nell’insorgenza delle lesioni preneoplastiche della vulva (VIN) classificate come VIN classiche e nei carcinomi ad esse associati. L’incidenza del carcinoma vulvare in Europa è di 1.5/100.000 di cui circa il 45% è dovuto a HR-HPV (80% ad HPV16). Nonostante l’associazione tra HPV16 e carcinoma vulvare sia alta, ancora poco si conosce sul ruolo della carica virale e dell’integrazione in tali lesioni. Le lesioni che possono presentarsi nella regione testa-collo possono essere sia di natura benigna che maligna. I genotipi più frequentemente riscontrati in associazione a lesioni benigne (papillomi) sono HPV 6 e 11, quelli associati a forme tumorali (HNSCC) sono il genotipo 18 ma soprattutto il 16. Molti aspetti del coinvolgimento di HPV in queste patologie non sono ancora perfettamente conosciuti e spesso studi su tale argomento hanno mostrato risultati contraddittori, soprattutto perché vengono utilizzate metodiche con gradi diversi di sensibilità e specificità. Recenti dati di letteratura hanno tuttavia messo in evidenza che i pazienti affetti da HNSCC positivi ad HPV hanno una elevata risposta al trattamento chemioradioterapico rispetto ai pazienti HPV-negativi con un notevole impatto sul controllo locale e sulla sopravvivenza ma soprattutto sulla qualità di vita di tali pazienti, evitando di sottoporli a chirurgia sicuramente demolitiva. Scopo del lavoro: Sulla base di queste premesse, scopo di questo lavoro è stato quello di valutare l’importanza di marker quali la presenza/persistenza di HPV, la carica virale, la valutazione dello stato fisico del genoma virale e l’espressione degli mRNA oncogeni nella gestione di pazienti con lesioni preneoplastiche e neoplastiche di diverso grado, associate a papillomavirus mucosi. Per la valutazione dei markers virologici di progressione neoplastica abbiamo sviluppato dei saggi di real time PCR qualitativi e quantitativi studiati in modo da poter fornire, contemporaneamente e a seconda delle esigenze, risposte specifiche non solo sulla presenza e persistenza dei diversi genotipi di HPV, ma anche sul rischio di insorgenza, progressione e recidiva delle lesioni mediante lo studio di markers virologici quali carica virale, integrazione ed espressione degli mRNA. Abbiamo pertanto indirizzato la nostra attenzione verso tre popolazioni specifiche di pazienti: - donne con lesioni vulvari preneoplastiche (VIN) e neoplastiche, allo scopo di comprendere i complessi meccanismi patogenetici di tali patologie non sempre associate ad infezione da HPV; - pazienti con lesioni maligne a livello della regione testa-collo allo scopo di fornire informazioni utili all’elaborazione di un percorso terapeutico mirato (radiochemioterapico o chirurgico) a seconda o meno della presenza di infezione virale; - donne con lesioni cervicali di alto grado, trattate chirurgicamente per la rimozione delle lesioni e seguite nel follow-up, per stabilire l’importanza di tali marker nella valutazione della persistenza virale al fine di prevenire recidive di malattia.

Sul comportamento dinamico di macchine fresatrici in alcune condizioni critiche di lavorazione

Questa tesi affronta lo studio di una tipologia di vibrazione autoeccitata, nota come chatter, che si manifesta nei processi di lavorazione ad asportazione di truciolo ed in particolare nelle lavorazioni di fresatura. La tesi discute inoltre lo sviluppo di una tecnica di monitoraggio e diagnostica del chatter basato sul rilievo di vibrazioni. Il fenomeno del chatter è caratterizzato da violente oscillazioni tra utensile e pezzo in lavorazione ed elevate emissioni acustiche. Il chatter, se non controllato, causa uno scadimento qualitativo della finitura superficiale e delle tolleranze dimensionali del lavorato, una riduzione della vita degli utensili e dei componenti della macchina. Questa vibrazione affligge negativamente la produttività e la qualità del processo di lavorazione e pregiudica l’interazione uomo-macchina-ambiente. Per una data combinazione di macchina, utensile e pezzo lavorato, i fattori che controllano la velocità di asportazione del materiale sono gli stessi che controllano l’insorgenza del chatter: la velocità di rotazione del mandrino, la profondità assiale di passata e la velocità di avanzamento dell’utensile. Per studiare il fenomeno di chatter, con l’obbiettivo di individuare possibili soluzioni per limitarne o controllarne l’insorgenza, vengono proposti in questa tesi alcuni modelli del processo di fresatura. Tali modelli comprendono il modello viscoelastico della macchina fresatrice e il modello delle azioni di taglio. Per le azioni di taglio è stato utilizzato un modello presente in letteratura, mentre per la macchina fresatrice sono stati utilizzato modelli a parametri concentrati e modelli modali analitico-sperimentali. Questi ultimi sono stati ottenuti accoppiando un modello modale sperimentale del telaio, completo di mandrino, della macchina fresatrice con un modello analitico, basato sulla teoria delle travi, dell’utensile. Le equazioni del moto, associate al processo di fresatura, risultano essere equazioni differenziali con ritardo a coefficienti periodici o PDDE (Periodic Delay Diefferential Equations). È stata implementata una procedura numerica per mappare, nello spazio dei parametri di taglio, la stabilità e le caratteristiche spettrali (frequenze caratteristiche della vibrazione di chatter) delle equazioni del moto associate ai modelli del processo di fresatura proposti. Per testare i modelli e le procedure numeriche proposte, una macchina fresatrice CNC 4 assi, di proprietà del Dipartimento di Ingegneria delle Costruzioni Meccaniche Nucleari e Metallurgiche (DIEM) dell’Università di Bologna, è stata strumentata con accelerometri, con una tavola dinamometrica per la misura delle forze di taglio e con un adeguato sistema di acquisizione. Eseguendo varie prove di lavorazione sono stati identificati i coefficienti di pressione di taglio contenuti nel modello delle forze di taglio. Sono stati condotti, a macchina ferma, rilievi di FRFs (Funzioni Risposta in Frequenza) per identificare, tramite tecniche di analisi modale sperimentale, i modelli del solo telaio e della macchina fresatrice completa di utensile. I segnali acquisiti durante le numerose prove di lavorazione eseguite, al variare dei parametri di taglio, sono stati analizzati per valutare la stabilità di ciascun punto di lavoro e le caratteristiche spettrali della vibrazione associata. Questi risultati sono stati confrontati con quelli ottenuti applicando la procedura numerica proposta ai diversi modelli di macchina fresatrice implementati. Sono state individuate le criticità della procedura di modellazione delle macchine fresatrici a parametri concentrati, proposta in letteratura, che portano a previsioni erronee sulla stabilità delle lavorazioni. È stato mostrato come tali criticità vengano solo in parte superate con l’utilizzo dei modelli modali analitico-sperimentali proposti. Sulla base dei risultati ottenuti, è stato proposto un sistema automatico, basato su misure accelerometriche, per diagnosticare, in tempo reale, l’insorgenza del chatter durante una lavorazione. È stato realizzato un prototipo di tale sistema di diagnostica il cui funzionamento è stato provato mediante prove di lavorazione eseguite su due diverse macchine fresatrici CNC.

Studio della Peste dei Piccoli Ruminanti nei territori saharawi

La Peste dei Piccoli Ruminanti (PPR) è una patologia virale ed acuta che colpisce i piccoli ruminanti, diffusa in Africa Sub-Sahariana, in Medio Oriente ed in Asia Meridionale. Questo lavoro si propone di effettuare il primo studio epidemiologico sulla PPR nella Repubblica Araba Saharawi Democratica (RASD), che comprende i Campi Profughi Saharawi, in territorio algerino, ed i “Territori Liberati” del Sahara Occidentale, valutando la potenziale presenza, prevalenza e distribuzione del virus della PPR in questi territori. Lo studio si è basato su una metodica di campionamento “a cluster” secondo la tecnica “a due stadi”. Sono stati individuati 23 siti di campionamento dai quali sono stati raccolti un totale di 976 campioni di siero prelevati da pecore, capre e cammelli. I campioni sono stati prelevati in Marzo ed Aprile 2008. I risultati dei test Competitive-Elisa hanno evidenziato una sieroprevalenza nel 28,26% degli animali testati, benché durante la raccolta dei campioni nessun animale abbia presentato sintomi clinici riferibili alla PPR. Tra Gennaio e Maggio 2010, in seguito ad episodi di aumentata mortalità nella popolazione ovi-caprina presente nei Campi Profughi, le autorità veterinarie locali sospettarono un outbreak di PPR. Tra Maggio ed Ottobre 2010 è stato sviluppato un outbreak investigation nei Campi Profughi Saharawi con lo scopo di confermare la circolazione del PPRV. I risultati di laboratorio hanno confermato la presenza del virus nel 33,33% dei campioni. Il sequenziamento del genoma virale ha rivelato che il virus apparteneva al Lignaggio 4 e le analisi filogenetiche hanno indicato una stretta relazione (99.3%) con il PPRV isolato durante l'epidemia di PPR in Marocco del 2008.

Human papillomavirus (HPV) and associated diseases: between applied diagnostic and basic research

Human Papillomavirus (HPV) is the cause of cervical cancers (among these, adenocarcinoma, AdCa) and is associated to a subgroup of oropharyngeal carcinomas (OPSCCs). Even if the risk for cancer development is linked to the infection by some viral genotypes, mainly HPV16 and 18, viral DNA alone seems not to be sufficient for diagnosis. Moreover, the role of the virus in OPSCCs has not been totally clarified yet. In the first part of the thesis, the performances concerning viral genotyping in clinical cervical samples of a new pyrosequencing-based test and a well-known hybridization-based assay have been compared. Similar results between the methods have been obtained. However, the former showed advantages in detecting intratype variants, higher specificity and a broader spectrum of detectable HPV types. The second part deals with the evaluation of virological markers (genotyping, viral oncoproteins expression, viral load, physical state and CpG methylation of HPV16 genome) in the diagnosis/prognosis of cervical AdCa and HPV-associated OPSCCs. HPV16 has been confirmed the most prevalent genotype in both the populations. Interestingly, the mean methylation frequency of viral DNA at the early promoter showed the tendency to be associated to invasion for cervical AdCa and to a worse prognosis for OPSCCs, suggesting a promising role as diagnostic/prognostic biomarker. The experiments of the third part were performed at the DKFZ in Heidelberg (Germany) and dealt with the analysis of the response to IFN-k transfection in HPV16-positive cervical cancer and head&neck carcinoma cell lines to evaluate its potential role as new treatment. After 24h, we observed increased IFN-b expression which lead to the up-regulation of genes involved in the antigens presentation pathway (MHC class I and immunoproteasome) and antiviral response as well, in particular in cervical cancer cell lines. This fact suggested also the presence of different HPV-mediated carcinogenic pathways between the two anatomical districts.

Meccanismi replicativi e di regolazione dell'espressione genica di Parvovirus B19

Il Parvovirus B19, virus patogeno umano della famiglia Parvoviridae, mostra uno specifico tropismo per i precursori eritroidi e una limitata replicazione in alcune linee cellulari megacarioblastoidi. Allo scopo di sviluppare sistemi utili allo studio delle caratteristiche biologiche del virus, diversi laboratori si sono occupati della costruzione di cloni genomici di B19 dotati di competenza funzionale e capaci di generare virus infettante. Parte del presente lavoro ha riguardato l’analisi funzionale di diversi cloni genomici di B19 e ha permesso di caratterizzare le regioni terminali del virus e di identificare requisiti essenziali per la loro funzionalità. Nel contesto intracellulare, esistono differenti livelli di restrizione in relazione alla capacità della cellula di supportare la replicazione virale, non ancora del tutto caratterizzati. Inoltre si sono accumulate evidenze circa la capacità del B19 di instaurare persistenza in numerosi tessuti. Non sono ancora note le caratteristiche funzionali del genoma virale in questo stato, è possibile che il virus persista in forma silente e meccanismi epigenetici possano regolare tale silenziamento. In questo studio è stato analizzato lo stato di metilazione del genoma di B19 e il suo possibile effetto sul ciclo replicativo virale ed è stata investigata la possibile associazione del DNA virale agli istoni cellulari nel corso di infezione in vitro. I risultati ottenuti confermano la presenza di questi meccanismi epigenetici, potendo ipotizzare che giochino un importante ruolo nella regolazione della funzionalità virale e nell’interazione B19-cellula e siano un elemento critico per l’adattamento del virus nell’ambiente in cui si trova. Inoltre l’ipotesi che anche i microRNA possano assumere un importante significato nell’interazione B19-cellula è stata proposta da diversi lavori e nel presente studio è stata valutata la produzione di queste piccole molecole durante l'infezione in vitro, ricercando microRNA (cellulari e/o virali) con omologia di sequenza per il genoma di B19 e quindi specifici per il virus.

Functional and Genetic characterization of new genomic islands from an E. coli strain associated with neonatal meningitis.

Enterobacteriaceae genomes evolve through mutations, rearrangements and horizontal gene transfer (HGT). The latter evolutionary pathway works through the acquisition DNA (GEI) modules of foreign origin that enhances fitness of the host to a given environment. The genome of E. coli IHE3034, a strain isolated from a case of neonatal meningitis, has recently been sequenced and its subsequent sequence analysis has predicted 18 possible GEIs, of which: 8 have not been previously described, 5 fully meet the pathogenic island definition and at least 10 that seem to be of prophagic origin. In order to study the GEI distribution of our reference strain, we screened for the presence 18 GEIs a panel of 132 strains, representative of E. coli diversity. Also, using an inverse nested PCR approach we identified 9 GEI that can form an extrachromosomal circular intermediate (CI) and their respective attachment sites (att). Further, we set up a qPCR approach that allowed us to determine the excision rates of 5 genomic islands in different growth conditions. Four islands, specific for strains appertaining to the sequence type complex 95 (STC95), have been deleted in order to assess their function in a Dictyostelium discoideum grazing assays. Overall, the distribution data presented here indicate that 16 IHE3034 GEIs are more associated to the STC95 strains. Also the functional and genetic characterization has uncovered that GEI 13, 17 and 19 are involved in the resistance to phagocitation by Dictyostelium d thus suggesting a possible role in the adaptation of the pathogen during certain stages of infection.

Molecular and functional characterization of the chemotactic genes in the PCBs-degrader Pseudomonas pseudoalcaligenes KF707

Although bacteria represent the simplest form of life on Earth, they have a great impact on all living beings. For example the degrader bacterium Pseudomonas pseudoalcaligenes KF707 is used in bioremediation procedures for the recovery of polluted sites. Indeed, KF707 strain is know for its ability to degrade biphenyl and polychlorinated biphenyls - to which is chemotactically attracted - and to tolerate the oxydative stress due to toxic metal oxyanions such as tellurite and selenite. Moreover, in bioremediation processes, target compounds can be easily accessible to KF707 through biofilm formation. All these considerations suggest that KF707 is such a unique microorganism and this Thesis work has been focused on determining the molecular nature of some of the peculiar physiological traits of this strain. The genome project provided a large set of informations: putative genes involved in the degradation of aromatic and toxic compounds and associated to stress response were identified. Notably, multiple chemotactic operons and cheA genes were also found. Deleted mutants in the cheA genes were constructed and their role in motility, chemotaxis and biofilm formation were assessed and compared to those previously attributed to a cheA1 gene in a KF707 mutant constructed by a mini-Tn5 transposon insertion and which was impaired in motility and biofilm development. The results of this present Thesis work, taken together, were interpreted to suggest that in Pseudomonas pseudoalcaligenes KF707 strain, multiple factors are involved in these networks and they might play different roles depending on the environmental conditions. The ability of KF707 strain to produce signal molecules possibly involved in cell-to-cell communication, was also investigated: lack of a lux-like QS system - which is conversely widely present in Gram negative bacteria – keeps open the question about the actual molecular nature of KF707 quorum sensing mechanism.

Studio di caratteri correlati a stress idrico in una collezione di cultivar di frumento duro (Triticum durum Desf.)

L’agricoltura si trova ad affrontare una diminuzione della disponibilità d’acqua ed una crescente domanda della produzione di cereali per scopi alimentari. Sono perciò necessarie strategie di coltivazione innovative per migliorare la produttività e nuovi genotipi migliorati nell'efficienza dell’uso delle risorse in condizioni di siccità. Questi rappresentano gli obietti principali del progetto “DROPS” (Drought tolerant yielding Plants) all’interno del quale ha avuto luogo il mio progetto di Dottorato. La mia attività di ricerca è stata svolta come segue: 1. Caratterizzazione molecolare di un panel di188 accessioni di frumento duro con marcatori SSR e DaRT; 2. Esperimenti in serra su 100 accessioni del panel per valutare la Water-Use Efficiency (WUE) in sei repliche secondo un Alpha Lattice design; 3. Prove sul campo, effettuate secondo un Alpha Lattice design, in due stagioni di crescita: a. 2010/11, valutazione di 100 accessioni presso l’Azienda sperimentale dell'Università di Cadriano (BO); b. 2011/12, valutazione del panel completo in 3 ambienti, con due diversi regimi irrigui In entrambi gli anni, abbiamo valutato caratteri agronomici correlati con il ciclo di sviluppo, la resa di granella e sue componenti, nonché diversi fattori ambientali e del suolo. Per quanto riguarda WUE, abbiamo trovato differenze altamente significative tra accessioni; inoltre, cinque accessioni hanno mostrato elevati valori di WUE e cinque accessioni valori molto bassi di WUE in tutte e sei le repliche. Gli esperimenti di campo nelle stagioni 2011 e 2012 hanno evidenziato differenze altamente significative tra le accessioni del panel per la maggior parte dei caratteri analizzati, confermando inoltre che il panel di fiorisce entro una settimana. L'esperimento del secondo anno ci ha permesso osservare un significativa interazione Genotipo X Ambiente. Questi risultati saranno integrati con ulteriori analisi QTL, per identificare regioni cromosomiche coinvolte nel controllo genetico dei caratteri di interesse e verificare la stabilità dei QTL in diversi ambienti.

Sorveglianza dell’infezione da virus dell’epatite E (HEV) in Italia: from farm to table

L'epatite E è una malattia umana con caratteristiche di epatite acuta, causata da un ssRNA virus (HEV). Nel 1997, HEV è stato identificato per la prima volta nei suini (SwHEV). In seguito, diverse evidenze, tra cui la vicinanza genetica tra ceppi umani e suini, suggerirono la trasmissione zoonotica del virus. Nella presente tesi, l’identificazione di SwHEV è stata condotta mediante ricerca di porzioni di genoma virale attraverso RT-PCR. Dal 2011 al 2013, sono stati analizzati 343 campioni fecali (da 19 allevamenti) e 70 bili (da 2 macelli) prelevati da altrettanti suini, in diverse Regioni italiane. E’ stato inoltre condotto uno studio retrospettivo su 78 feci (da 3 allevamenti) raccolte nel 2000. Il virus è stato identificato nel 24,5% e 19,2% delle feci raccolte rispettivamente nel 2011-2013 e nel 2000. Nessuna bile è risultata positiva. Mediante sequenziamento del genoma intero di uno dei virus identificati, è stata condotta l’analisi filogenetica per valutarne il grado di correlazione con alti ceppi suini e umani. La presenza di HEV è stata valutata lungo la filiera di produzione suina, dal macello al punto vendita. Trentaquattro campioni di feci, fegato e muscolo sono stati raccolti in un macello da altrettanti suini sani (età:6-7 mesi). Quattordici feci e 2 fegati, sono risultati positivi per HEV. Sono state prelevate 129 salsicce sia allo stabilimento di trasformazione sia alla vendita, ma nessuna è risultata positiva. La presenza di HEV è stata valutata anche nelle salsicce di fegato, fresche e secche, acquistate presso una macelleria. Il genoma virale è stato rilevato nel 22,2% delle salsicce fresche e nel 4,3 % di quelle secche ma la vitalità del virus non è stata dimostrata. In conclusione, lo studio condotto ha confermato l’ampia circolazione di HEV nei suini e la possibile contaminazione dei prodotti carnei derivati, confermando la necessità di una continua sorveglianza.

Studio sul ruolo dei fattori genetici coinvolti nella Valvola Aortica Bicuspide e/o nell'Aneurisma dell'Aorta Toracica

La Valvola Aortica Bicuspide (BAV) rappresenta la più comune anomalia cardiaca congenita, con un’incidenza dello 0,5%-2% nella popolazione generale. Si caratterizza per la presenza di due cuspidi valvolari anziché tre e comprende diverse forme. La BAV è frequentemente associata agli aneurismi dell’aorta toracica (TAA). La dilatazione dell’aorta espone al rischio di sviluppare le complicanze aortiche acute. Materiali e metodi Sono stati reclutati 20 probandi consecutivi sottoposti a chirurgia della valvola aortica e dell'aorta ascendente presso l'Unità di Chirurgia Cardiaca di Policlinico S.Orsola-Malpighi di TAA associata a BAV. Sono stati esclusi individui con una condizione sindromica predisponente l’aneurisma aortico. Ciascun familiare maggiorenne di primo grado è stato arruolato nello studio. L’analisi di mutazioni dell’intero gene ACTA2 è stata eseguita con la tecnica del “bidirectional direct sequencing”. Nelle forme familiari, l’intera porzione codificante del genoma è stata eseguita usando l’exome sequencing. Risultati Dopo il sequenziamento di tutti i 20 esoni e giunzioni di splicing di ACTA2 nei 20 probandi, non è stata individuata alcuna mutazione. Settantasette familiari di primo grado sono stati arruolati. Sono state identificate cinque forme familiari. In una famiglia è stata trovata una mutazione del gene MYH11 non ritenuta patogenetica. Conclusioni La mancanza di mutazioni, sia nelle forme sporadiche sia in quelle familiari, ci suggerisce che questo gene non è coinvolto nello sviluppo della BAV e TAA e, l’associazione che è stata riportata deve essere considerata occasionale. L’architettura genetica della BAV verosimilmente dovrebbe consistere in svariate differenti varianti genetiche che interagiscono in maniera additiva nel determinare un aumento del rischio.

Marcatori di eta biologica nella malattia di Parkinson: risultati di un'analisi glicomica e epigenomica

La malattia di Parkinson è una malattia neurodegenerativa caratterizzata da una progressiva disfunzione motoria e cognitiva. È noto che l'età avanzata è il principale fattore di rischio per la malattia di Parkinson e alcuni studi hanno dimostrato un'accelerazione dell'età biologica nelle fasi più avanzate della malattia. Questo studio si propone di valutare se l'accelerazione dell'invecchiamento biologico descritta nelle fasi avanzate della malattia di Parkinson caratterizzi anche le prime fasi della malattia. A tal fine sono stati utilizzati due tipi di marcatori biologici di età, basati sull'analisi della metilazione del DNA del sangue (l'orologio epigenetico e sue varianti) e dei profili degli N-glicani nel plasma (GlycoAge Test). I biomarcatori sono stati valutati in campioni ottenuti da pazienti con malattia di Parkinson de novo, con diagnosi recente e non ancora in trattamento farmacologico, nonché da pazienti con stadi più avanzati della malattia e da controlli sani. I risultati ottenuti nelle prime fasi della malattia non mostrano segni di invecchiamento accelerato, che trovano conferma nelle fasi più avanzate. Dai dati di metilazione è possibile prevedere le proporzioni delle diverse popolazioni di leucociti. Questa analisi nelle prime fasi della malattia ha già evidenziato significative alterazioni che seguono in parte quelle caratteristiche dell'invecchiamento del sistema immunitario, suggerendo un'immunosenescenza accelerata nella malattia di Parkinson. Infine, i dati sulla metilazione del DNA sono stati analizzati per identificare le differenze nelle regioni metilate del genoma tra pazienti con malattia di Parkinson e controlli. I risultati suggeriscono l'esistenza di piccole ma significative alterazioni nella metilazione del DNA che caratterizzano lo stadio precoce e/o avanzato della malattia. In conclusione, questo studio suggerisce che le prime fasi della malattia di Parkinson sono caratterizzate da specifiche alterazioni epigenetiche e invecchiamento precoce del sistema immunitario, che tuttavia non si traducono in un'alterazione dei biomarcatori di invecchiamento epigenetici e glicomici.