Molecular basis oh herpes simplex virus entry into the cell and retargeting of the viral tropism for the design of oncolytic herpesviruses

Herpes simplex virus 1 (HSV-1) infects oral epitelial cells, then spreads to the nerve endings and estabilishes latency in sensory ganglia, from where it may, or may not reactivate. Diseases caused by virus reactivation include mild diseases such as muco-cutaneous lesions, and more severe, and even life-threatening encephalitis, or systemic infections affecting diverse organs. Herpes simplex virus represents the most comprehensive example of virus receptor interaction in Herpesviridae family, and the prototype virus encoding multipartite entry genes. In fact, it encodes 11-12 glycoproteins and a number of additional membrane proteins: five of these proteins play key roles in virus entry into subsceptible cells. Thus, glycoprotein B (gB) and glycoprotein C (gC) interact with heparan sulfate proteoglycan to enable initial attachment to cell surfaces. In the next step, in the entry cascade, gD binds a specific surface receptor such as nectin1 or HVEM. The interaction of glycoprotein D with the receptor alters the conformation of gD to enable the activation of gB, glycoprotein H, and glycoprotein L, a trio of glycoproteins that execute the fusion of the viral envelope with the plasma membrane. In this thesis, I described two distinct projects: I. The retargeting of viral tropism for the design of oncolytic Herpesviruses: • capable of infecting cells through the human epitelial growth factor receptor 2 (HER2), overexpressed in highly malignant mammary and ovarian tumors and correlates with a poor prognosis; • detargeted from its natural receptors, HVEM and nectin1. To this end, we inserted a ligand to HER2 in gD. Because HER2 has no natural ligand, the selected ligand was a single chain antibody (scFv) derived from MAb4D5 (monoclonal antibody to HER2), herein designated scHER2. All recombinant viruses were targeted to HER2 receptor, but only two viruses (R-LM113 and R-LM249) were completely detargeted from HVEM and nectin1. To engineer R-LM113, we removed a large portion at the N-terminus of gD (from aa 6 to aa 38) and inserted scHER2 sequence plus 9-aa serine-glycine flexible linker at position 39. On the other hand, to engineer R-LM249, we replaced the Ig-folded core of gD (from aa 61 to aa 218) with scHER2 flanked by Ser-Gly linkers. In summary, these results provide evidence that: i. gD can tolerate an insert almost as big as gD itself; ii. the Ig-like domain of gD can be removed; iii. the large portion at the N-terminus of gD (from aa 6 to aa 38) can be removed without loss of key function; iv. R-LM113 and R-LM249 recombinants are ready to be assayed in animal models of mammary and ovary tumour. This finding and the avaibility of a large number of scFv greatly increase the collection of potential receptors to which HSV can be redirected. II. The production and purification of recombinant truncated form of the heterodimer gHgL. We cloned a stable insect cell line expressing a soluble form of gH in complex with gL under the control of a metalloprotein inducible promoter and purified the heterodimer by means of ONE-STrEP-tag system by IBA. With respect to biological function, the purified heterodimer is capable: • of reacting to antibodies that recognize conformation dependent epitopes and neutralize virion infectivity; • of binding a variety cells at cell surface. No doubt, the availability of biological active purified gHgL heterodimer, in sufficient quantities, will speed up the efforts to solve its crystal structure and makes it feasible to identify more clearly whether gHgL has a cellular partner, and what is the role of this interaction on virus entry.

Interazioni tra le glicoproteine D, B, H ed L critiche per la fusione indotta dal virus Herpes simplex

Four glycoproteins (gD, gB, gH, and gL) are required for herpes simplex virus (HSV) entry into the cell and for cell-cell fusion in transfected cells. gD serves as the receptor-binding glycoprotein and as the trigger of fusion; the other three glycoproteins execute fusion between the viral envelope and the plasma or endocytic membranes. Little is known on the interaction of gD with gB, gH, and gL. Here, the interactions between herpes simplex virus gD and its nectin1 receptor or between gD, gB, and gH were analyzed by complementation of the N and C portions of split enhanced green fluorescent protein (EGFP) fused to the glycoproteins. Split EGFP complementation was detected between proteins designated gDN + gHC, gDN + gBC, and gHN + gBC + wtgD, both in cells transfected with two or tree glycoproteins and in cells transfected with the four glycoproteins, commited to form syncytia. The in situ assay provides evidence that gD interacts with gH and gB independently one of the other. We further document the interaction between gH and gB. To elucidate which portions of the glycoproteins interact with each other we generated mutants of gD and gB. gD triggers fusion through a specialised domain, named pro-fusion domain (PFD), located C-terminally in the ectodomain. Here, we show that PFD is made of subdomains 1 and 2 (amino acids 260–285 and 285–310) and that each one partially contributed to herpes simplex virus infectivity. Chimeric gB molecules composed of HSV and human herpesvirus 8 (HHV8) sequences failed to reach the cell surface and to complement a gB defective virus. By means of pull down experiments we analyzed the interactions of HSV-HHV8 gB chimeras with gH or gD fused to the strep-tag. The gB sequence between aa residues 219-360 was identified as putative region of interaction with gH or critical to the interaction.

Interazioni tra Glicoproteine che mediano la penetrazione del Virus Herpes Simplex nella cellula e disegno razionale di Peptidi Inibitori

Herpes simplex virus entry into cells requires a multipartite fusion apparatus made of gD, gB and heterodimer gH/gL. gD serves as receptor-binding glycoprotein and trigger of fusion; its ectodomain is organized in a N-terminal domain carrying the receptor-binding sites, and a C-terminal domain carrying the profusion domain, required for fusion but not receptor-binding. gB and gH/gL execute fusion. To understand how the four glycoproteins cross-talk to each other we searched for biochemical defined complexes in infected and transfected cells, and in virions. We report that gD formed complexes with gB in absence of gH/gL, and with gH/gL in absence of gB. Complexes with similar composition were formed in infected and transfected cells. They were also present in virions prior to entry, and did not increase at virus fusion with cell. A panel of gD mutants enabled the preliminary location of part of the binding site in gD to gB to the aa 240-260 portion and downstream, with T306P307 as critical residues, and of the binding site to gH/gL at aa 260-310 portion, with P291P292 as critical residues. The results indicate that gD carries composite independent binding sites for gB and gH/gL, both of which partly located in the profusion domain. The second part of the project dealt with rational design of peptides inhibiting virus entry has been performed. Considering gB and gD, the crystal structure is known, so we designed peptides that dock in the structure or prevent the adoption of the final conformation of target molecule. Considering the other glycoproteins, of which the structure is not known, peptide libraries were analyzed. Among several peptides, some were identified as active, designed on glycoprotein B. Two of them were further analyzed. We identified peptide residues fundamental for the inhibiting activity, suggesting a possible mechanism of action. Furthermore, changing the flexibility of peptides, an increased activity was observed,with an EC50 under 10μM. New approaches will try to demonstrate the direct interaction between these peptides and the target glycoprotein B.

Il risparmio delle risorse alla scala abitativa e di insediamento. Tecnologie non convenzionali e valutazione ambientale attraverso metodologia LCA.

Nel corso del mio lavoro di ricerca mi sono occupata di identificare strategie che permettano il risparmio delle risorse a livello edilizio e di approfondire un metodo per la valutazione ambientale di tali strategie. La convinzione di fondo è che bisogna uscire da una visione antropocentrica in cui tutto ciò che ci circonda è merce e materiale a disposizione dell’uomo, per entrare in una nuova era di equilibrio tra le risorse della terra e le attività che l’uomo esercita sul pianeta. Ho quindi affrontato il tema dell’edilizia responsabile approfondendo l’ambito delle costruzioni in balle di paglia e terra. Sono convinta che l’edilizia industriale abbia un futuro molto breve davanti a sé e lascerà inevitabilmente spazio a tecniche non convenzionali che coinvolgono materiali di semplice reperimento e posa in opera. Sono altresì convinta che il solo utilizzo di materiali naturali non sia garanzia di danni ridotti sull’ecosistema. Allo stesso tempo ritengo che una mera certificazione energetica non sia sinonimo di sostenibilità. Per questo motivo ho valutato le tecnologie non convenzionali con approccio LCA (Life Cycle Assessment), approfondendo gli impatti legati alla produzione, ai trasporti degli stessi, alla tipologia di messa in opera, e ai loro possibili scenari di fine vita. Inoltre ho approfondito il metodo di calcolo dei danni IMPACT, identificando una carenza nel sistema, che non prevede una categoria di danno legata alle modifiche delle condizioni idrogeologiche del terreno. La ricerca si è svolta attraverso attività pratiche e sperimentali in cantieri di edilizia non convenzionale e attività di ricerca e studio sull’LCA presso l’Enea di Bologna (Ing. Paolo Neri).

La mediazione civile e commerciale come strumento di gestione del conflitto. Analisi a seguito dell'entrata in vigore del d.Lgs 4/3/2010 n. 28

Dopo aver analizzato il conflitto, le sue funzioni e le modalità di gestione, l'autore si sofferma dapprima sulle varie tipologie di mediazione per poi focalizzare l'attenzione sulla mediazione civile e commerciale evidenziando i dati disponibili dall'entrata in vigore del tentativo obbligatorio come condizione di procedibilità della domanda giudiziale per le materie civili, alla fine del 2013.

Monismo e dualismo nei rapporti tra Cedu e ordinamento costituzionale interno. Fonti e processi interpretativi

La tesi analizza i rapporti tra l’ordinamento italiano e la Cedu, in particolare la collocazione della Cedu all’interno del sistema delle fonti alla luce della modifica dell’art. 117, comma 1 Cost. Si tratta di un tema molto dibattuto in dottrina, specialmente a seguito dell’entrata in vigore del Trattato di Lisbona. Questa tematica risulta strettamente connessa al profilo dell’interazione tra la Corte di Strasburgo e la Corte costituzionale e i giudici ordinari. L’analisi del profilo statico concernente lo status della Cedu nel sistema italiano deve quindi essere accompagnata dall’esame del profilo dinamico, relativo al ruolo della giurisprudenza della Corte di Strasburgo nell’esperienza dell’ordinamento nazionale. Entrambi i profili di indagine sono esaminati alla luce delle indicazioni provenienti dalla giurisprudenza della Corte costituzionale, della Corte di Cassazione e della Corte di Strasburgo. Prima di essere esaminate singolarmente, queste tematiche richiedono la preliminare ricognizione dei termini della dicotomia tra i due modelli concettuali di riferimento in tema di rapporti interordinamentali: il monismo e il dualismo. Trasferite nel peculiare contesto del sistema Cedu, tali categorie dogmatiche si arricchiscono di ulteriori profili, che esorbitano dalla sistemazione del rapporto tra fonti. La tenuta dei due paradigmi concettuali, che sono nati ed operano nel contesto della teorica delle fonti, deve essere verificata anche rispetto all’attuale fenomeno della produzione europea di diritto giurisprudenziale ed alla capacità paradigmatica assunta dalla giurisprudenza di Strasburgo. Il diritto e le istituzioni giuridiche tendono ad assumere sempre più sembianze giurisdizionali, generando un’osmosi che porta a trasferire il focus dai rapporti interordinamentali ai rapporti tra giurisprudenze.

L'equilibrio istituzionale nell'Unione europea

Il lavoro intende dimostrare che lo sviluppo giurisprudenziale del principio di equilibrio istituzionale, il rapporto tra detto principio e il principio di leale cooperazione, il riconoscimento istituzionale e giurisprudenziale dell’importanza della scelta della base giuridica nella tutela dell’equilibrio istituzionale hanno concorso a determinare la dinamicità dell’evoluzione dell’assetto interistituzionale della Comunità e dell’Unione. Focalizzata l’attenzione sulle nuove basi giuridiche introdotte dal Trattato di Lisbona, sono stati definiti gli assetti del nuovo equilibrio istituzionale analizzando, da un lato, il nuovo quadro istituzionale definito dal titolo III del Trattato sull’Unione europea e, in particolare la “costituzionalizzazione” del principio orizzontale di leale cooperazione. In conclusione, si rileva che con l´entrata in vigore del Trattato di Lisbona le dimensioni politica e giuridica dell’equilibrio istituzionale sono state interessate da due mutamenti di ampia portata. In primo luogo, il completamento del processo di revisione dei trattati apertosi con la dichiarazione di Laeken ha definito un nuovo quadro istituzionale, che si è riflesso in rinnovati meccanismi di funzionamento dell’architettura istituzionale. In secondo luogo, la risposta dell’Unione alla crisi economica e finanziaria ha messo al centro dell’agenda il suo bilancio, la programmazione pluriennale e l’Unione economica. Nel primo caso un’analisi dell’articolo 295 TFUE ha costituito la base di una riflessione sulle modalità di codificazione delle relazioni istituzionali attraverso accordi e sul rapporto tra questi ultimi e il titolo III TUE. Si è rilevata, in particolare, un’incongruenza tra gli obblighi di leale cooperazione orizzontale sanciti dall’articolo 13(2) TUE e gli strumenti finalizzati alla loro istituzionalizzazione. Nel secondo caso, invece, è stato evidenziato come il preminente ruolo del Consiglio europeo, al quale il Trattato di Lisbona ha riconosciuto lo status d'istituzione, abbia modificato gli equilibri, determinando un ritorno del ricorso all’integrazione differenziata rispetto a politiche disciplinate dai Trattati.

La prova penale nelle indagini difensive. Analisi comparata degli strumenti processuali concessi alla difesa nei sistemi italiano e statunitense.

L’elaborato si occupa di fare il punto in materia di indagini difensive a tre lustri dall’entrata in vigore della legge n. 397/2000, epilogo di un lungo processo evolutivo che ha visto da un lato, una gestazione faticosa e travagliata, dall’altro, un prodotto normativo accolto dagli operatori in un contesto di scetticismo generale. In un panorama normativo e giurisprudenziale in continua evoluzione, i paradigmi dettati dagli artt. 24 e 111 della Costituzione, in tema di diritto alla difesa e di formazione della prova penale secondo il principio del contraddittorio tra le parti, in condizioni di parità, richiedono che il sistema giustizia offra sia all’indagato che all’imputato sufficienti strumenti difensivi. Tenuto conto delle diversità che caratterizzano naturalmente i ruoli dell’accusa e della difesa che impongono asimmetrie genetiche inevitabili, l’obiettivo della ricerca consiste nella disamina degli strumenti idonei a garantire il diritto alla prova della difesa in ogni stato e grado del procedimento, nel tentativo di realizzare compiutamente il principio di parità accusa - difesa nel processo penale. La ricerca si dipana attraverso tre direttrici: l’analisi dello statuto sulle investigazioni difensive nella sua evoluzione storica sino ai giorni nostri, lo studio della prova penale nel sistema americano e, infine, in alcune considerazioni finali espresse in chiave comparatistica. Le suggestioni proposte sono caratterizzate da un denominatore comune, ovvero dal presupposto che per contraddire è necessario conoscere e che solo per tale via sia possibile, finalmente, riconoscere il diritto di difendersi indagando.

La identidad nacional de los Estados miembros en el Derecho de la Unión Europea

La identidad nacional es una categoría jurídica central del Derecho de la Unión que puede ser particularmente apta a los fines de articular un mejor encaje entre los ordenamientos jurídicos nacionales y el sistema jurídico europeo. Se enmarca en un debate clásico de la construcción europea relativo a cómo conciliar una integración cada vez más acentuada con el debido respeto a la diversidad estatal. Se caracteriza por tratarse de una figura jurídica sumamente controvertida, existiendo una rica y abierta discusión en relación a su sentido y a su alcance. Con la entrada en vigor del Tratado de Lisboa en el año 2009, la nueva redacción de la cláusula de identidad nacional ha suscitado un interés renovado tanto por parte de la doctrina como de la jurisprudencia nacional y europea gracias a su mayor elaboración y a la ampliación de las potestades de la jurisdicción supranacional. La presente tesis doctoral ofrece un análisis integral de esta norma desde una aproximación dialéctica, que comprende tanto la visión acuñada por el Tribunal de Justicia como la percepción que de la misma mantienen los Tribunales Constitucionales nacionales, en tanto que guardianes supremos del ordenamiento constitucionales interno. Cada uno de los cuales sostiene una visión no exactamente coincidente sobre la norma suprema y la autoridad judicial última en el complejo sistema constitucional común europeo. Se lleva a cabo un estudio desde una perspectiva histórica y actual, sustantiva y procesal, descriptiva y valorativa, así como una parte propositiva por medio de la cual se propone un modelo para la resolución de este tipo de conflictos en sede judicial.

Seismotectonic study on two strategic infrastructures in Southern Italy

With the entry into force of the latest Italian Building Code (NTC 2008, 2018), innovative criteria were provided, especially for what concerns the seismic verifications of large infrastructures. In particular, for buildings considered as strategic, such as large dams, a seismotectonic study of the site was declared necessary, which involves a re-assessment of the basic seismic hazard. This PhD project fits into this context, being part of the seismic re-evaluation process of large dams launched on a national scale following the O.P.C.M. 3274/2003, D.L. 79/2004. A full seismotectonic study in the region of two large earth dams in Southern Italy was carried out. We identified and characterized the structures that could generate earthquakes in our study area, together with the definition of the local seismic history. This information was used for the reassessment of the basic seismic hazard, using probabilistic seismic hazard assessment approaches. In recent years, fault-based models for the seismic hazard assessment have been proposed all over the world as a new emerging methodology. For this reason, we decided to test the innovative SHERIFS approach on our study area. The occasion of the seismotectonic study gave also the opportunity to focus on the characteristics of the seismic stations that provided the data for the study itself. In the context of the work presented here, we focused on the 10 stations that had been active for the longest time and we carried out a geophysical characterization, the data of which merged into a more general study on the soil-structure interaction at seismic stations and on the ways in which it could affect the SHA. Lastly, an additional experimental study on the two dams and their associated minor structures is also presented, aimed at defining their main dynamic parameters, useful for subsequent dynamic structural and geotechnical studies.

Regulating FinTech: The perspectives of law, economics, and technology

FinTech (financial technology, ‘‘FinTech’’) is a double-edged sword as it brings both benefits and risks. This study appraised FinTech’s technological nature that brings changes in complexity in modern financial markets to identify the information deficits and its undesirable outcomes. Besides, as FinTech is still developing, the information regarding, for instance, whether and how to apply regulation may be insufficient for both regulators and those regulated. More one-size-fits-all regulation might accordingly be adopted, thereby resulting in the adverse selection. Through the lens of both law and economics and law and technology, this study suggested AFR (adaptive financial regulation, ‘‘AFR’’) of FinTech to solve the underlying pacing issue. AFR is dynamic, enabling regulatory adjustments and learning. Exploring and collecting information through experiments and learning from experiments are the core of AFR. FinTech regulatory sandboxes epitomize AFR. This study chose Taiwan as a case study. This study found several barriers to adaptive and effective FinTech regulation. Unduly emphasizing consumer protection and the innovation entry criterion by improperly imposing limits on the entry into sandboxes, ignoring post-sandbox mechanisms, and relying on detailed, specific and prescriptive rules to formulate sandboxes are examples. To solve these barriers, this study proposed several solutions by looking into the experiences in other jurisdictions and analyzing. First, striking a balance between encouraging innovation and ensuring financial stability and consumer protection is indispensable. Second, entry to sandboxes should be facilitated by improving the selection criteria. Third, adhering to realizing regulatory adjustment and learning to adapt regulation to technology, this study argued that systematic post-sandbox mechanisms should be established. Fourth, this study recommended “more principles-based sandboxes”. Principles rather than rules should be the base on which sandboxes or FinTech regulation are established. Having principles could provide more flexibility, being easier to adjust and adapt, and better at avoiding.

L'iniziativa dei cittadini europei: un'analisi della sua efficacia come strumento di democrazia partecipativa

Fin dalla sua attuazione nel 2012, l'Iniziativa dei cittadini europei (ICE) ha catturato l'attenzione di accademici e politici per il suo apparente potenziale come strumento di democrazia partecipativa in grado di promuovere il coinvolgimento diretto dei cittadini nel processo decisionale dell'UE. Tuttavia, dopo il suo lancio, questo strumento sembra aver deluso le speranze e le aspettative riposte in esso e, invece di fungere da ponte tra i cittadini e le istituzioni dell'UE, sembra essere diventato una chiara prova della leadership burocratica dell'UE a Bruxelles. Con la riforma della sua legislazione di attuazione, le istituzioni europee hanno voluto dare all'ICE un'altra possibilità di raggiungere il suo pieno potenziale di democratizzazione. A tre anni dall'entrata in vigore del nuovo Regolamento 2019/788 e a più di dieci anni dal suo inserimento nell'ordinamento giuridico europeo, riteniamo che sia il momento giusto per valutare il reale impatto dell'ICE nella promozione della democrazia partecipativa nell'UE. Per raggiungere questo obiettivo, la presente tesi di dottorato intraprende un'analisi completa di questa struttura di opportunità per la partecipazione dei cittadini, esplorando le sue origini, il suo quadro normativo, la sua applicazione pratica e le sue implicazioni per la democrazia europea attraverso un approccio interdisciplinare che combina l'uso di metodi sia qualitativi che quantitativi. Questa ricerca mira a fornire una comprensione più profonda e critica dell'ICE e del suo ruolo nella costruzione di un'Europa più partecipativa e più vicina ai cittadini.

The school environment as a teacher. The role of space and place in enhancing ecological literacy and social competence development in children and young people

Can space and place foster child development, and in particular social competence and ecological literacy? If yes, how can space and place do that? This study shows that the answer to the first question is positive and then tries to explain the way space and place can make a difference. The thesis begins with the review of literature from different disciplines – child development and child psychology, education, environmental psychology, architecture and landscape architecture. Some bridges among such disciplines are created and in some cases the ideas from the different areas of research merge: thus, this is an interdisciplinary study. The interdisciplinary knowledge from these disciplines is translated into a range of design suggestions that can foster the development of social competence and ecological literacy. Using scientific knowledge from different disciplines is a way of introducing forms of evidence into the development of design criteria. However, the definition of design criteria also has to pass through the study of a series of school buildings and un-built projects: case studies can give a positive contribution to the criteria because examples and good practices can help “translating” the theoretical knowledge into design ideas and illustrations. To do that, the different case studies have to be assessed in relation to the various themes that emerged in the literature review. Finally, research by design can be used to help define the illustrated design criteria: based on all the background knowledge that has been built, the role of the architect is to provide a series of different design solutions that can give answers to the different “questions” emerged in the literature review.