Eterogeneità delle proprietà fisico – chimiche della proteina prionica patologica e variabilità fenotipica ceppo specifica nella malattia di Creutzfeldt – Jakob

Transmissible spongiform encephalopathies (TSEs), or prion diseases, are neurodegenerative disorders that affect humans and mammals. Creutzfeldt-Jakob disease (CJD), the most common TSE in humans, can be sporadic (sCJD), genetic (gCJD), or acquired by infection. All TSEs are characterised by the accumulation of PrPSc, a misfolded form of the cellular protein PrPC. PrPSc is insoluble in detergents, partially resistant to proteolysis and shows a highly enriched β-sheet secondary structure. Six clinico-pathological phenotypes of sCJD have been characterized which correlate at the molecular level with two types (1 or 2) of PrPSc with distinctive physicochemical properties and the genotype at the polymorphic (methionine or valine) codon 129 of the prion protein gene. According to the protein-only hypothesis, which postulates that prions are composed exclusively of PrPSc, the strains of prions that are largely responsible for the wide spectrum of TSE phenotypes are enciphered in PrPSc conformation. In support to this view, studies mainly conducted in experimental scrapie, have shown that several prion strains can be identified based on distinguishing PrPSc biochemical properties. To further contribute to the understanding of the molecular basis of strains and to develop more sensitive strain typing assays in humans we have analyzed PrPSc biochemical properties in two experimental setting. In the first we compared the size of the core after protease digestion and the glycoform pattern of PrPSc before and after transmission of human prions to non human primates or bank voles, whereas in the second we analyzed the conformational stability of PrPSc associated with sCJD, vCJD or fCJD using guanidine hydrochloride (GdnHCl) as denaturant. Combining the results of the two studies, we were able to distinguish five human strains for at least one biochemical property. The present data extend our knowledge about the extent of strain variation and its relationship with PrPSc properties in human TSEs.

Effect of host genotype and prion strain on the phenotypic heterogeneity of Creutzfeldt-Jakob disease: the peripheral nervous system involvement and the spectrum of the genetic form

The first study was designed to assess whether the involvement of the peripheral nervous system (PNS) belongs to the phenotypic spectrum of sporadic Creutzfeldt-Jakob disease (sCJD). To this aim, we reviewed medical records of 117 sCJDVV2, 65 sCJDMV2K, and 121 sCJDMM(V)1 subjects for symptoms/signs and neurophysiological data. We looked for the presence of PrPSc in postmortem PNS samples from 14 subjects by western blotting and real-time quaking-induced conversion (RT-QuIC) assay. Seventy-five (41.2%) VV2-MV2K patients, but only 11 (9.1%) MM(V)1, had symptoms/signs suggestive of PNS involvement and neuropathy was documented in half of the VV2-MV2K patients tested. RT-QuIC was positive in all PNS samples, whereas western blotting detected PrPSc in the sciatic nerve in only one VV2 and one MV2K. These results support the conclusion that peripheral neuropathy, likely related to PrPSc deposition, belongs to the phenotypic spectrum of sCJDMV2K and VV2, the two variants linked to the V2 strain. The second study aimed to characterize the genetic/molecular determinants of phenotypic variability in genetic CJD (gCJD). To this purpose, we compared 157 cases of gCJD to 300 of sCJD. We analyzed: demographic aspects, neurological symptoms/signs, histopathologic features and biochemical characteristics of PrPSc. The results strongly indicated that the clinicopathological phenotypes of gCJD largely overlap with those of sCJD and that the genotype at codon 129 in cis with the mutation (i.e. haplotype) contributes more than the latter to the disease phenotype. Some mutations, however, cause phenotypic variations including haplotype-specific patterns of PrPSc deposition such as the “dense” synaptic pattern (E200K-129M), the intraneuronal dots (E200K-129V), and the linear stripes perpendicular to the surface in the molecular layer of cerebellum (OPRIs-129M). Overall, these results suggest that in gCJD PRNP mutations do not cause the emergence of novel prion strains, but rather confer increased susceptibility to the disease in conjunction with “minor” clinicopathological variations.

Studio in vitro della suscettibilità genetica degli ovini alle EST: il PMCA come alternativa agli studi di trasmissione in vivo

Le encefalopatie spongiformi trasmissibili (EST), o malattie da prioni, sono malattie neurodegenerative che colpiscono l'uomo e gli animali. Le più note tra le EST animali sono la scrapie della pecora e della capra, l’encefalopatia spongiforme bovina (BSE), la Sindrome del dimagrimento cronico (CWD) dei cervidi. Negli uomini ricordiamo la malattia di Creutzfeldt-Jakob (CJD) nelle sue diverse forme (sporadica, genetica, iatrogenica e variante). La dimostrazione che la variante della CJD (vCJD) sia causata dallo stesso agente eziologico della BSE, ha evidenziato il potenziale zoonotico di queste malattie. Le EST sono caratterizzate da tempi di incubazione estremamente lunghi ed esito invariabilmente fatale. Il momento patogenetico centrale comune a tutte queste malattie è rappresentato dalla modificazione conformazionale di una proteina cellulare denominata PrPC (proteina prionica cellulare) in una isoforma patologica denominata PrPSc, insolubile e caratterizzata da una parziale resistenza alle proteasi, che tende a depositarsi sotto forma di fibrille amiloidee nel SNC dei soggetti colpiti. La suscettibilità degli ovini alla scrapie è largamente influenzata dal genotipo del gene dell’ospite che codifica per la PrP (PRNP), e più precisamente da tre polimorfismi presenti ai codoni 136, 154 e 171. Questi si combinano in cinque principali alleli, ARQ, VRQ, AHQ, ARH e ARR, correlati a differenti gradi di suscettibilità alla malattia. Risultati ottenuti da un precedente studio d’infezione sperimentale di ovini di razza Sarda con scrapie classica (Vaccari G et al 2007), hanno suggeriscono l’ordine di suscettibilità ARQ>AHQ>ARH. L’allele ARR, è risultato invece associato ai più alti livelli di protezione dalla malattia. Dallo stesso studio di trasmissione sperimentale e da uno studio epidemiologico di tipo caso-controllo, è inoltre emerso che nella razza Sarda, ovini con l’allele ARQ, con sostituzione amminoacidica al codone 137 Metionina (M)/Treonina (T) (AT137RQ) o al 176 Asparagina (N)/Lisina (K) (ARQK176) in eterozigosi sono protetti dalla scrapie. Inoltre studi di trasmissione sperimentale della BSE in ovini della stessa razza con tre differenti genotipi (ARQ/ARQ, ARQ/ARR e ARR/ARR), hanno dimostrato come la BSE abbia un targeting genetico molto simile a quello della scrapie, evidenziando il genotipo ARQ/ARQ come il più suscettibile. L’obbiettivo della seguente tesi è stato quello di verificare se fosse possibile riprodurre in vitro la differente suscettibilità genetica degli ovini alle EST evidenziata in vivo, utilizzando il PMCA (Protein Misfolding Cyclic Amplification), la metodica ad oggi più promettente e di cui è stata dimostrata la capacità di riprodurre in vitro diverse proprietà biologiche dei prioni. La tecnica, attraverso cicli ripetuti di sonicazione/incubazione, permette la conversione in vitro della PrPC presente in un omogenato cerebrale (substrato), da parte di una quantità minima di PrPSc (inoculo) che funge da “innesco” della reazione. Si è voluto inoltre utilizzare il PMCA per indagare il livello di protezione in omozigosi di alleli rari per i quali, in vivo, si avevano evidenze di protezione dalla scrapie solo in eterozigosi, e per studiare la suscettibilità degli ovini alla BSE adattata in questa specie. È stata quindi testata in PMCA la capacità diversi substrati ovini recanti differenti genotipi, di amplificare la PrPSc dello stesso isolato di scrapie classica impiegato nel precedente studio in vivo o di un inoculo di BSE bovina. Inoltre sono stati saggiati in vitro due inoculi di BSE costituiti da omogenato cerebrale di due ovini sperimentalmente infettati con BSE (BSE ovina) e recanti due differenti genotipi (ARQ/ARQ e ARR/ARR). Per poter descrivere quantitativamente il grado di correlazione osservato i risultati ottenuti in vitro e i quelli riscontrati dallo studio di sperimentazione con scrapie, espressi rispettivamente come fattori di amplificazione e tempi d’incubazione registrati in vivo, sono stati analizzati con un modello di regressione lineare. Per quanto riguarda la scrapie, i risultati ottenuti hanno evidenziato come i genotipi associati in vivo a suscettibilità (ARQ/ARQ, ARQ/AHQ and AHQ/ARH) siano anche quelli in grado di sostenere in PMCA l’amplificazione della PrPSc, e come quelli associati a resistenza (ARQ/ARR and ARR/ARR) non mostrino invece nessuna capacità di conversione. Dall’analisi di regressione lineare è inoltre emerso come l’efficienza di amplificazione in vitro dei differenti genotipi testati sia inversamente proporzionale ai tempi d’incubazione registrati in vivo. Inoltre nessuna amplificazione è stata riscontrata utilizzando il substrato con genotipo raro ARQK176/ARQK176 suggerendo come anche questo possa essere associato a resistenza, almeno nei confronti dell’isolato di scrapie classica utilizzato. Utilizzando come inoculo in PMCA l’isolato di BSE bovina, è stato possibile riscontrare, nei tre genotipi analizzati (ARQ/ARQ, ARQ/ARR e ARR/ARR) un evidente amplificazione per il solo genotipo ARQ/ARQ, sottolineando anche in questo caso l’esistenza di una correlazione tra suscettibilità riscontrata in vivo e capacità di conversione in PMCA. I tre i substrati analizzati mostrano inoltre una buona efficienza di amplificazione, per altro simile, se si utilizza la PrPSc dell’inoculo di BSE sperimentalemente trasmessa agli ovini. Questi genotipi sembrerebbero dunque ugualmente suscettibili se esposti a BSE adattata alla specie ovina. I risultati di questa tesi indicano dunque una correlazione diretta tra la capacità di conversione della PrPC con il PMCA e la suscettibilità osservata in vivo per i differenti genotipi analizzati. Mostrano inoltre come il PMCA possa essere una valida alternativa agli studi di trasmissione in vivo e un rapido strumento utile non soltanto per testare, ma anche per predire la suscettibilità genetica degli ovini a diversi ceppi di EST, rappresentando un valido aiuto per l’individuazione di ulteriori genotipi resistenti, così da incrementare la variabilità genetica dei piani di selezione attuati per gli ovini per il controllo di queste malattie.

Integrating omics in prion diseases as a model to explore the strain paradigm in neurodegenerative diseases

This project aims at deepening the understanding of the molecular basis of the phenotypic heterogeneity of prion diseases. Prion diseases represent the first and clearest example of “protein misfolding diseases”, that are all the neurodegenerative diseases caused by the accumulation of misfolded proteins in the central nervous system. In the field of protein misfolding diseases, the term “strain” describes the heterogeneity observed among the same disease in the clinical and pathologic progression, biochemical features of the aggregated protein, conformational memory and pattern of lesions. In this work, the two most common strains of Creutzfeldt-Jakob Disease (CJD), named MM1 and VV2, were analyzed. This thesis investigates the strain paradigm with the production of new multi omic data, and, on such data, appropriate computational analysis combining bioinformatics, data science and statistical approaches was performed. In this work, genomic and transcriptomic profiling allowed an improved characterization of the molecular features of the two most common strains of CJD, identifying multiple possible genetic contributors to the disease and finding several shared impaired pathways between the VV2 strain and Parkinson Disease. On the epigenomic level, the tridimensional chromatin folding in peripheral immune cells of CJD patients at onset and of healthy controls was investigated with Hi-C. While being the first application of this very advanced technology in prion diseases and one of the first in general in neurobiology, this work found a significant and diffuse loss of genomic interactions in immune cells of CJD patients at disease onset, particularly in the PRNP locus, suggesting a possible impairment of chromatin conformation in the disease. The results of this project represent a novelty in the state of the art in this field, both from a biomedical and technological point of view.

Skin as a promising biomatrix for the early detection of misfolded proteins by RT-QuIC in neurodegenerative diseases

Real-Time Quaking-Induced Conversion (RT-QuIC) is an ultrasensitive assay capable of detecting pathological aggregates of misfolded proteins in biospecimens. In recent years, efforts have been made to find a more feasible and convenient biomatrix as an alternative to CSF, and skin biopsy may be a suitable candidate. This project aimed to evaluate the diagnostic performance of skin RT-QuIC in 3 different cohorts of patients: 1. Creutzfeldt-Jakob disease (CJD), 2. Lewy body disease (LBD), and 3. Isolated REM sleep behavior disorder (iRBD). We studied 71 punch skin samples of 35 patients with CJD, including five assessed in vitam, using 2 two different substrates: Bank vole 23-230 (Bv23-230) and Syrian hamster 23-231 (Ha23-231) recombinant prion protein. Skin prion RT-QuIC showed a 100% specificity with both substrates and a higher sensitivity with the Bv23-230 than Ha23-231 (87.5% vs. 65.6%, respectively). Forty-one patients underwent both lumbar puncture (LB) and skin biopsy; CSF and skin RT-QuIC showed a high level of concordance (38/41, 92.7%). Then, we analyzed samples taken in vitam (n=69) or postmortem (n=49) from patients with Parkinson’s disease (PD), dementia with Lewy bodies (DLB), incidental Lewy body pathology, and neurological controls. Skin α-syn RT-QuIC distinguished LBD patients with an overall accuracy of 94.1% in the two cohorts (sensitivity, 89.2%; specificity, 96.3%). Seventy-nine patients underwent both CSF and skin α-syn RT-QuIC, and the two assays yielded similar diagnostic accuracy (skin, 97.5%; CSF, 98.7%). Finally, we studied 91 iRBD patients and 41 control. In the skin, RT-QuIC showed a sensitivity of 76.9%, specificity of 97.6%, and 82.0% accuracy. 128 participants (88 patients plus 40 controls) underwent both CSF and skin RT-QuIC. The two protocols showed 99.2% of concordance. These works confirmed that skin punch biopsies might represent a valid and convenient alternative to CSF analysis for an early diagnosis of prion diseases and LB-related pathologies.