Genetic engineering and preclinical evaluation of oncolytic herpes simplex viruses retargeted to cancer-specific receptors

Oncolytic virotherapy exploits the ability of viruses to infect and kill cells. It is suitable as treatment for tumors that are not accessible by surgery and/or respond poorly to the current therapeutic approach. HSV is a promising oncolytic agent. It has a large genome size able to accommodate large transgenes and some attenuated oncolytic HSVs (oHSV) are already in clinical trials phase I and II. The aim of this thesis was the generation of HSV-1 retargeted to tumor-specific receptors and detargeted from HSV natural receptors, HVEM and Nectin-1. The retargeting was achieved by inserting a specific single chain antibody (scFv) for the tumor receptor selected inside the HSV glycoprotein gD. In this research three tumor receptors were considered: epidermal growth factor receptor 2 (HER2) overexpressed in 25-30% of breast and ovarian cancers and gliomas, prostate specific membrane antigen (PSMA) expressed in prostate carcinomas and in neovascolature of solid tumors; and epidermal growth factor receptor variant III (EGFRvIII). In vivo studies on HER2 retargeted viruses R-LM113 and R-LM249 have demonstrated their high safety profile. For R-LM249 the antitumor efficacy has been highlighted by target-specific inhibition of the growth of human tumors in models of HER2-positive breast and ovarian cancer in nude mice. In a murine model of HER2-positive glioma in nude mice, R-LM113 was able to significantly increase the survival time of treated mice compared to control. Up to now, PSMA and EGFRvIII viruses (R-LM593 and R-LM613) are only characterized in vitro, confirming the specific retargeting to selected targets. This strategy has proved to be generally applicable to a broad spectrum of receptors for which a single chain antibody is available.

Pre-clinical and clinical development of leukemia stem cell inhibitors in acute leukemias

In Leukemias, recent developments have demonstrated that the Hedgehog pathway plays a key-role in the peculiar ability of self renewal of leukemia stem cells. The aim of this research activity was to investigate, through a first in man, Phase I, open label, clinical trial, the role and the impact, mainly in terms of safety profile, adverse events and pharmacokinetics, of a Sonic Hedgehog inhibitor compound on a population of heavely pretreated patients affected by AML, CML, MF, or MDS, resistant or refractory to standard chemotherapy. Thirty-five patients have been enrolled. The drug was administered orally, in 28 days cycles, without rest periods. The compound showed a good safety profile. The half life was of 17-35 hours, justifying the daily administration. Significant signs of activity, in terms of reduction of bone marrow blast cell amount were seen in most of the patients enrolled. Interestingly, correlative biological studies demonstrated that, comparing the gene expression profyiling signature of separated CD34+ cells before and after one cycle of treatment, the most variably expressed genes were involved in the Hh pathway. Moreover, we observed that many genes involved in MDR (multidrug resistance)were significantly down regulated after treatment. These data might lead to future clinical trials based on combinatory approaches, including, for instance, Hh inhibitors and conventional chemotherapy.

Caratterizzazione citogenetico-molecolare alla diagnosi di pazienti con leucemia mieloide cronica in fase cronica trattati con inibitori delle tirosinchinasi: ruolo prognostico.

L’applicazione della citogenetica convenzionale e molecolare può identificare: Ph-negatività, traslocazioni t(9;22) varianti e alterazioni citogenetiche addizionali (ACA) al cromsoma Ph in pazienti con LMC alla diagnosi. Prima dell’introduzione della terapia con Imatinib, esse mostravano un impatto prognostico negativo o non chiaro. Nel nostro studio, 6 casi di LMC Ph- erano trattati con Imatinib. La FISH identificava 4 casi con riarrangiamento BCR/ABL sul der(9q), 1 sul der(22q) e 1 su entrambi i derivativi. Quattro pazienti (66,7%) raggiungevano la RCgC, 2 fallivano il trattamento e 1 sottoposto a TMO. A causa dello scarso numero di casi, non era possibile nessuna correlazione con la prognosi. Nell’ambito di studi prospettici multicentrici del GIMEMA-WP, abbiamo valutato: traslocazioni varianti e ACA. Dei 559 pazienti arruolati, 30(5%) mostravano traslocazioni varianti, 24 valutabili in FISH: 18(75%) mostravano meccanismo 1-step, 4(16,7%) meccanismo 2-step e 2(8,3%) meccanismo complesso. Abbiamo confermato che le varianti non influenzano la risposta e la sopravvivenza dei pazienti trattati con Imatinib. Dei 378 pazienti valutabili alla diagnosi con citogenetica convenzionale, 21(5,6%) mostravano ACA: 9(43%) avevano la perdita del cromosoma Y, 3(14%) trisomia 8, 2(10%) trisomia 19, 6(28%) altre singole anomalie e 1 cariotipo complesso. La presenza di ACA influenzava la risposta: le RCgC e RMolM erano significativamente più basse rispetto al gruppo senza ACA e le curve di sopravvivenza EFS e FFS non erano significativamente diverse. Le curve di PFS e OS erano sovrapponibili nei due gruppi, per il basso numero di eventi avversi oppure perché alcuni raggiungevano la risposta con TKI di seconda generazione. Le anomalie “major route” mostravano decorso clinico peggiore, ma non è stato possibile determinare l’impatto prognostico in relazione al tipo di alterazione. Pertanto, le ACAs alla diagnosi rivestono un ruolo negativo nella prognosi dei pazienti trattati con Imatinib, che quindi rappresentano una categoria più a rischio per la risposta.

Analisi fosfo-proteomica di campioni di tumore: il problema della stratificazione dei pazienti ed eterogeneità intra-tumorale nell'era della terapia personalizzata

Nella presente tesi indaghiamo la potenzialità di LCM e Reverse Phase Protein microarray negli studi clinici. Si analizza la possibilità di creare una bio banca con line cellular primarie, al fine di conseguire drug test di sensibilità prima di decidere il trattamento da somministrare ai singoli pazienti. Sono stati ottenuti profili proteomici da biopsie pre e post terapia. I risultati dimostrano che questa piattaforma mostra il meccanismo di resistenza acquisito durante la terapia biologica. Questo ci ha portato ad analizzare una possibile stratificazione per pazienti con mCRC . I dati hanno rivelato distinti pathway di attivazione tra metastasi resecabile e non resecabili. I risultati mostrano inoltre due potenziali bersagli farmacologici. Ma la valutazione dell'intero tumore tramite singole biopsie sembra essere un problema a causa dell’eterogeneità intratumorale a livello genomico. Abbiamo indagato questo problema a livello dell'architettura del segnale in campioni di mCRC e ccRCC . I risultati indicano una somiglianza complessiva nei profili proteomici all'interno dello stesso tumore. Considerando che una singola biopsia è rappresentativa di un intera lesione , abbiamo studiato la possibilità di creare linee di cellule primarie, per valutare il profilo molecolare di ogni paziente. Fino ad oggi non c'era un protocollo per creare linee cellulari immortalizzate senza alcuna variazione genetica . abbiamo cosiderato, però, l'approccio innovativo delle CRCs. Ad oggi , non è ancora chiaro se tali cellule mimino il profilo dei tessuti oppure I passaggi in vitro modifichino i loro pathways . Sulla base di un modello di topo , i nostri dati mostrano un profilo di proteomica simile tra le linee di cellule e tessuti di topo LCM. In conclusione, i nostri dati dimostrano l'utilità della piattaforma LCM / RPPA nella sperimentazione clinica e la possibilità di creare una bio - banca di linee cellulari primarie, per migliorare la decisione del trattamento.

“Clinical and biological role of adjuvant dendritic cells vaccination in newly glioblastoma patients”

Background. Glioblastoma (GBM) is the most common primary tumor of central nervous system and it has a poor prognosis. Standard first line treatment, which includes surgery followed by adjuvant radio-chemotherapy,produces only modest benefits to survival. The interest for immunotherapy in this field derives from the development of new drugs and effective therapies as immune-check points inhibitors, adoptive T-cell approaches or dendritic cell (DC) based vaccines or a combinations of these. GBM is described as a typical “immune-deserted” cancer exhibiting a number of systemic and environmental immunosuppressive factors. Considering the role of microenvironment, and above all the lower tumor load and depletion of immunosuppressive cells in GBM, our hypothesis is that DC vaccine may induce an immune response. Main aims and study design. The main aim of this project is to study the role of immune system in GBM, including identification of potential prognostic and predictive markers of outcome and response to dendritic cell vaccine. Firstly, we performed a retrospective analysis on blood samples. Then, we analyzed the immuno-component in tissues samples of enrolled patients; and compared that with blood results. Then, the last part of the project is based on a prospective clinical trial on patients enrolled in DC-based vaccination produced at IRST Cell Factory and actually used for patients with melanoma and other tumors. The enrollment is still ongoing. Expected results. The project will i) develop an immune-panel of prognostic and predictive markers to help clinicians to improve the therapeutic strategy for GBM patients; ii) provide preliminary results on the effectiveness of immunotherapy on GBM patients.