Il nucleotide extracellulare UTP: induzione della migrazione di cellule staminali emopoietiche CD34+

La letteratura scientifica degli ultimi anni si �� arricchita di un numero sempre crescente di studi volti a chiarire i meccanismi che presiedono ai processi di homing di cellule staminali emopoietiche e del loro attecchimento a lungo termine nel midollo osseo. Tali fenomeni sembrano coinvolgere da un lato, l���interazione delle cellule staminali emopoietiche con la complessa architettura e componente cellulare midollare, e dall���altro la riposta ad un���ampia gamma di molecole regolatrici, tra le quali chemochine, citochine, molecole di adesione, enzimi proteolitici e mediatori non peptidici. Fanno parte di quest���ultimo gruppo anche i nucleotidi extracellulari, un gruppo di molecole-segnale recentemente caratterizzate come mediatori di numerose risposte biologiche, tra le quali l���allestimento di fenomeni flogistici e chemiotattici. Nel presente studio �� stata investigata la capacit�� dei nucleotidi extracellulari ATP ed UTP di promuovere, in associazione alla chemochina CXCL12, la migrazione di cellule staminali umane CD34+. E��� cos�� emerso che la stimolazione con UTP �� in grado di incrementare significativamente la migrazione dei progenitori emopoietici in risposta al gradiente chemioattrattivo di CXCL12, nonch�� la loro capacit�� adesiva. Le analisi citofluorimetriche condotte su cellule migranti sembrano inoltre suggerire che l���UTP agisca interferendo con le dinamiche di internalizzazione del recettore CXCR4, rendendo cos�� le cellule CD34+ maggiormente responsive, e per tempi pi�� lunghi, al gradiente attrattivo del CXCL12. Saggi di homing competitivo in vivo hanno parallelamente mostrato, in topi NOD/SCID, che la stimolazione con UTP aumenta significativamente la capacit�� dei progenitori emopoeitci umani di localizzarsi a livello midollare. Sono state inoltre indagate alcune possibili vie di trasduzione del segnale attivate dalla stimolazione di recettori P2Y con UTP. Esperimenti di inibizione in presenza della tossina della Pertosse hanno evidenziato il coinvolgimento di proteine G��i nella migrazione dipendente da CXCL12 ed UTP. Ulteriori indicazioni sono provenute dall���analisi del profilo trascrizionale di cellule staminali CD34+ stimolate con UTP, con CXCL12 o con entrambi i fattori contemporaneamente. Da questa analisi �� emerso il ruolo di proteine della famiglia delle Rho GTPasi e di loro effettori a valle (ROCK 1 e ROCK 2) nel promuovere la migrazione UTP-dipendente. Questi dati sono stati confermati successivamente in vitro mediante esperimenti con Tossina B di C. Difficile (un inibitore delle Rho GTPasi) e con Y27632 (in grado di inibire specificatamente le cinasi ROCK). Nel complesso, i dati emersi in questo studio dimostrano la capacit�� del nucleotide extracellulare UTP di modulare la migrazione in vitro di progenitori emopoietici umani, nonch�� il loro homing midollare in vivo. L���effetto dell���UTP su questi fenomeni si esplica in concerto con la chemochina CXCL12, attraverso l���attivazione concertata di vie di trasduzione del segnale almeno parzialmente condivise da CXCR4 e recettori P2Y e attraverso il reclutamento comune di proteine ad attivit�� GTPasica, tra le quali le proteine G��i e i membri della famiglia delle Rho GTPasi.

Effetto della combinazione di cellule CD4+CD25+, cellule staminali emopoietiche CD34+e ATG nella prevenzione della risposta alloreattiva delle cellule T in vitro ed in vivo

Il trapianto delle cellule staminali emopoietiche umane CD34+ in combinazione con le cellule T regolatorie CD4+/CD25+ FoxP3+ (Tregs) potrebbe prevenire l'alloreattivit�� verso le cellule staminali emopoietiche e ridurre il rischio di rigetto in trapianti allogenici HLA non correlati. Per dimostrare questa ipotesi abbiamo messo in coltura le cellule CD34+ e le cellule CD4+/CD25+ isolate con metodica immunomagnetica (Miltnyi Biotec)da sangue periferico non manipolato,sangue periferico mobilizzato con G-CSF o da Cordone ombelicale. Gli esperimenti svolti in vitro, hanno evidenziato che le cellule Tregs arricchite, ottenute dalla stessa fonte delle cellule CD34+( autologhe), mostravano un effetto inibitorio maggiore sulle celulle T alloreattive, rispetto alle cellule Tregs ottenute da un donatore terzo(allogenico).Inoltre l'attivit�� immunosoppressoria delle Tregs era mantenuta dopo stimolazione con cellule CD34+ allogeniche e i Tregs non modificavano l'attivit�� clonogenica delle cellule staminali CD34+. Avendo ottenuto questi dati in vitro abbiamo trapiantato in topi NOD/SCID le cellule Tregs e le cellule CD34+ in rapporto 1:1 o 1:2 ed �� stato osservato un normale attecchimento delle cellule staminali. Incubando queste cellule con dosi fisiologiche di timoglobulina derivata da coniglio (nota molecola immunosopressoria) non veniva modificato il numero dei Tregs dopo 6 giorni di coltura. Dopo l'esposizione alla Timoglobulina, inoltre, i Tregs mantenevano la loro attivit�� soppressoria, aumentava l'espressione del recettore chemochinico CCR7, e venivano rilasciate diverse citochine principalmente l'interleuchina 10(IL-10). Tali dati dimostrano come sia le cellule tregs autologhe che quelle allogeniche potrebbero essere trapiantate insieme alle cellule staminali CD34+ dopo un regime preparatorio di terapia che include la timoglobulina. A tale scopo sono state eseguite selezioni di Tregs da aferesi di donatori sani mobilizzati con G-CSF su scala clinica utilizzando biglie immunomagnetiche Clinical grade (Miltenyi Biotec) e sono state confrontate 2 modalit�� di selezione con due o tre passaggi con o senza la deplezione dei monociti CD14+.Si �� dimostrato cos�� che �� possibile selezionare un numero uguale di CD34+ e Tregs ,che con la metodica che prevede la deplezione dei monociti si ottiene una popolazione di cellule Tregs pi�� pura ( > 80%) e infine le applicazioni possibili di questi risultati includo: trapianto di cellule CD34+ del donatore insieme a cellule Tregs in trapianti aploidentici ; infusione of cellule tregs isolate da PBSC mobilizzati con G-nei casi di pazienti con GVHD steroide-resistente; infusione di G-Tregs del donatore nei casi di rigetto di organo trapiantato da of donatore ancora vivente.

Studio dell'interazione di HIV-1 sulle cellule progenitrici ematopoietiche CD34+ (HPCs)

Oltre alla progressiva perdita dei linfociti T CD4, i pazienti HIV-infetti presentano diverse citopenie periferiche. In particolare l���anemia si riscontra nel 10% dei pazienti asintomatici e nel 92% di quelli con AIDS e la terapia cART non �� in grado di risolvere tale problematica. I meccanismi patogenetici alla base di questa citopenia si ritiene che possano riguardare la deregolazione citochinica, il danno alle HPCs, alle cellule in differenziamento e alle cellule stromali. Le cellule progenitrici ematopoietiche CD34+, dopo essere state separate da sangue cordonale e differenziate verso la linea eritroide, sono state trattate con HIV-1 attivo, inattivato al calore e gp120. In prima istanza �� stata messa in luce la mancata suscettibilit�� all���infezione e l���aumento dell��� apoptosi dovuto al legame gp120-CD4/CXCR4 e mediato dal TGF-��1 nelle cellule progenitrici indifferenziate. L���aspetto innovativo di questo studio per�� si evidenzia esaminando l���effetto di gp120 durante il differenziamento verso la filiera eritrocitaria. Sono stati utilizzati due protocolli sperimentali: nel primo le cellule sono inizialmente trattate per 24 ore con gp120 (o con HIV-1 inattivato al calore) e poi indotte in differenziamento, nel secondo vengono prima differenziate e poi trattate con gp120. Il ���priming��� negativo determina una apoptosi gp120-indotta molto marcata gi�� dopo 48 ore dal trattamento ed una riduzione del differenziamento. Se tali cellule vengono invece prima differenziate per 24 ore e poi trattate con gp120, nei primi 5 giorni dal trattamento, �� presente un aumento di proliferazione e differenziamento, a cui segue un brusco arresto che culmina con una apoptosi molto marcata (anch���essa dipendente dal legame gp120-CD4 e CXCR4 e TGF-��1 dipendente) e con una drastica riduzione del differenziamento. L���insieme dei risultati ha permesso di definire in modo consistente la complessit�� della genesi dell���anemia in questi pazienti e di poter suggerire nuovi target terapeutici in questi soggetti, gi�� sottoposti a cART.