Abiotic and prebiotic phosphorus chemistry

The chief obstacle to understand the metabolic origin of life or RNA-based life is to identify a plausible mechanism for overcoming the clutter wrought by abiotic chemistry. Probably trough simple abiotic and then prebiotic reactions we could arrive to simple pre-RNA molecules. Here we report a possible preibiotic synthesis for heterocyclic compounds, and a self-assembling process of adenosine phosphates a constituent of RNA. In these processes we use a simple and prebiotic phosphorus cyclic compounds, as P4O10 and its derivatives. The processes are driven by the formation of hypercoordinated species that activate the processes by a factor of 106-8.

Synthesis and Supramolecular Architectures of Lipophilic Derivatives of Guanine

Self-assembly relies on the association of pre-programmed building blocks through non-covalent interactions to give complex supramolecular architectures. Previous studies provided evidence for the unique self-assembly properties of semi-synthetic lipophilic guanosine derivatives which can sequestrate ions from an aqueous phase, carry them into an organic phase where they promote the generation of well-defined supramolecular assemblies. In the presence of cations lipophilic guanosines form columnar aggregates while in their absence they generate supramolecular ribbons. The aim of this thesis has been the synthesis of guanine derivatives, in particular N9-alkylated guanines and a guanosine functionalized as a perchlorotriphenylmetil moiety (Gace-a-HPTM) in order to observe their supramolecular behaviour in the absence of sugar (ribose or deoxyribose) and in the presence of a bulky and chiral substituent respectively. By using guanine instead of guanosine, while maintaining all the hydrogen bond acceptor and donor groups required for supramolecular aggregation, the steric hindrance to supramolecular aggregation is notably reduced because (i.e. guanines with groups in N9 different from sugar are expected to have a greatest conformational freedom even in presence of bulky groups in C8). Supramolecular self-assembly of these derivatives has been accomplished in solutions by NMR and CD spectroscopy and on surface by STM technique. In analogy with other guanosine derivatives, also N9-substituted guanines and GAceHPTM form either ribbon-like aggregates or cation-templated G-quartet based columnar structures.

Valutazione sperimentale della rigenerazione cartilaginea articolare dopo stimolazione biofisica con campi elettromagnetici pulsati in associazione a trattamenti chirurgici

Diverse tecniche di ingegneria tessutale sono state sviluppate per promuovere la riparazione delle lesioni della cartilagine articolare. Nonostante i buoni risultati clinici a breve termine, il tessuto rigenerato fallisce nel tempo poiché non possiede le caratteristiche meccaniche e funzionali della cartilagine articolare nativa. La stimolazione con campi elettromagnetici pulsati (CEMP) rappresenta un approccio terapeutico innovativo. I CEMP aumentano l’attività anabolica dei condrociti con conseguente incremento della sintesi della matrice, e limitano l’effetto catabolico delle citochine pro-infiammatorie riducendo la degradazione della cartilagine nel microambiente articolare. I CEMP agiscono mediante l’up-regolazione dei recettori adenosinici A2A potenziando il loro affetto anti-infiammatorio. Lo scopo di questo studio è stato quello di valutare l’effetto della stimolazione con CEMP sulla guarigione di difetti osteocondrali in un modello sperimentale nel coniglio. Un difetto osteocondrale del diametro di 4mm è stato eseguito nel condilo femorale mediale di entrambe le ginocchia di 20 conigli. A destra la lesione è stata lasciata a guarigione spontanea mentre a sinistra e stata trattata mediante inserimento di scaffold collagenico o trapianto di cellule mesenchimali midollari sul medesimo scaffold precedentemente prelevate dalla cresta iliaca. In base al trattamento eseguito 10 animali sono stati stimolati con CEMP 4 ore/die per 40 giorni mentre altri 10 hanno ricevuto stimolatori placebo. Dopo il sacrificio a 40 giorni, sono state eseguite analisi istologiche mediante un punteggio di O’Driscoll modificato. Confrontando le lesioni lasciate a guarigione spontanea, la stimolazione con CEMP ha migliorato significativamente il punteggio (p=0.021). Lo stesso risultato si è osservato nel confronto tra lesioni trattate mediante trapianto di cellule mesenchimali midollari (p=0.032). Nessuna differenza è stata osservata tra animali stimolati e placebo quando la lesione è stata trattata con il solo scaffold (p=0.413). La stimolazione con CEMP è risultata efficace nel promuovere la guarigione di difetti osteocartilaginei in associazione a tecniche chirurgiche di ingegneria tessutale.

Effetti dell'inibizione di Tanchirasi in linee cellulari di Medulloblastoma umano

Tanchirasi (TNKS) è un membro della superfamiglia delle PARP (Poli ADP-Ribosio Polimerasi). TNKS è coinvolta nella stabilizzazione della subunità catalitca del complesso proteico DNA-PK (protein chinasi DNA-dipendente), la DNA-PKcs. Questa proteina è fondamentale per il corretto funzionamento del meccanismo di riparo del DNA chiamato "Saldatura Non Omologa delle Estremità" (NHEJ). La deplezione di TNKS induce una degradazione della DNA-PKcs e una maggiore sensibilità alle radiazioni ionizzanti (RI). TNKS è inoltre un regolatore negativo di axina e di conseguenza un attivatore del pathway di WNT; l'inibizione quindi di TNKS induce anche una inibizione del pathway di WNT. Alterazioni in questo signalling si riscontrano frequentemente nel Medulloblastoma (MB), il tumore cerebrale embrionale più comune dell'infanzia. La radioterapia post-operatoria risulta essere molto efficacia in questa neoplasia, ma causa gravi effetti collaterali e un terzo dei pazienti presenta radioresistenza intrinseca. Un'importante sfida per la ricerca è quindi l'aumento della radiosensibilità tumorale. In questo lavoro, abbiamo studiato gli effetti dell'inibizione farmacologica di TNKS in linee cellulari di MB umano, mediante la small molecule XAV939, potente e specifico inibitore di TNKS. Il trattamento con XAV939 induce una consistente inibizione della capacità proliferativa e clonogenica, non correlata ad un aumento della mortalità cellulare, indicando una bassa tossicità legata alla molecola. Il co-trattamento di XAV939 e RI (γ-ray, dose 2 Gy) causa una ulteriore inibizione della proliferazione cellulare e della capacità di formare colonie. Abbiamo inoltre constatato, mediante Neutral Comet Assay, una minore efficacia nel riparo del DNA in cellule irradiate trattate con XAV939, indicando un effettivo aumento della radiosensibilità in cellule di MB trattate con l'inibitore di TNKS. L'aumentata mortalità cellulare in cellule tumorali trattate con XAV939 e RI ha confermato la nostra ipotesi. Il nostro studio in vitro indica come TNKS possa essere un utile target terapeutico per rendere più efficace l'attuale terapia contro il MB.

Leucemia Acuta Mieloide e signaling purinergico: possibili sviluppi terapeutici

I nucleotidi trifosfato sono, dal punto di vista evoluzionistico, tra le molecole più antiche e conservate tra le specie. Oltre al ruolo che ricoprono nella sintesi degli acidi nucleici e nel metabolismo energetico della cellula, negli ultimi anni è emerso sempre di più il loro coinvolgimento nella regolazione di numerose funzioni cellulari. Questi importanti mediatori cellulari sono presenti nel microambiente e cambiamenti nella loro concentrazione extracellulare possono modulare la funzionalità cellulare. I nucleotidi trifosfato ATP e UTP, presenti nel microambiente midollare, sono dei potenti stimolatori dei progenitori emopoietici. Essi stimolano la proliferazione e l’attecchimento delle cellule staminali emopoietiche, così come la loro capacità migratoria, attraverso l’attivazione di specifici recettori di membrana, i recettori purinergici (P2R). In questo studio abbiamo dimostrato che ATP e UTP esercitano un effetto opposto sul compartimento staminale leucemico di leucemia acuta mieloide (LAM). Abbiamo dimostrato che le cellule leucemiche esprimono i recettori P2 funzionalmente attivi. Studi di microarray hanno evidenziato che, a differenza di ciò che avviene nelle CD34+, la stimolazione di cellule leucemiche con ATP induce la down-regolazione dei geni coinvolti nella proliferazione e nella migrazione, mentre up-regola geni inibitori del ciclo cellulare. Abbiamo poi confermato a livello funzionale, mediante test in vitro, gli effetti osservati a livello molecolare. Studi di inibizione farmacologica, ci hanno permesso di capire che l’attività inibitoria dell’ATP sulla proliferazione si esplica attraverso l’attivazione del recettore P2X7, mentre i sottotipi recettoriali P2 prevalentemente coinvolti nella regolazione della migrazione sono i recettori P2Y2 e P2Y4. Esperimenti di xenotrapianto, hanno evidenziato che l’esposizione ad ATP e UTP sia dei blasti leucemici sia delle cellule staminali leucemiche CD38-CD34+ diminuisce la loro capacità di homing e di engraftment in vivo. Inoltre, il trattamento farmacologico con ATP, di topi ai quali è stata indotta una leucemia umana, ha diminuito lo sviluppo della leucemia in vivo.