Organismi acquatici e ambiente: meccanismi biochimici di interazione, risposta e adattamento

The research is focused on the relationship between some Mg2+-dependent ATPase activities of plasma- and mitochondrial membranes from tissues of cultured marine bivalve molluscs and potentially stressful environmental conditions, such as the exposure to contaminants both of natural origin (ammonia nitrogen, the main contaminant of aquaculture plants) and of anthropic source (alkyltins). The two filter-feeding bivalve species selected colonize different habitats: the common mussel Mytilus galloprovincialis binds to hard substrates and the Philippine clam Tapes philippinarum burrows into sea bottom sandy beds. The choice of typical species of coastal waters, extremely suitable for environmental studies due to their features of poor motility, resistance to transport and great filtering efficiency, may constitute a model to evaluate responses to contaminants of membrane-bound enzyme activities involved in key biochemical mechanisms, namely cell ionic regulation and mitochondrial energy production. In vitro and in vitro approaches have been pursued. In vitro assays were carried out by adding the contaminants (NH4Cl and alkyltins) directly to the ATPase reaction media. In vivo experiments were carried out by exposing mussels to various tributyl tin (TBT) concentrations under controlled conditions in aquaria. ATPase activities were determined spectrophotometrically according to the principles of the method of Fiske and Subbarow (1925). The main results obtained are detailed below. In Tapes philippinarum the interaction of NH4 +, the main form of ammonia nitrogen at physiological and seawater pHs, with the Na,K-ATPase and the ouabaininsensitive Na-ATPase was investigated in vitro on gill and mantle microsomal membranes. The proven replacement by NH4 +of K+ in the activation of the Na,KATPase and of Na+ in the activation of the ouabain-insensitive ATPase displayed similar enzyme affinity for the substituted cation. on the one hand this finding may represent one of the possible mechanisms of ammonia toxicity and, on the other, it supports the hypothesis that NH4 + can be transported across the plasma membrane through the two ATPases. In this case both microsomal ATPases may be involved and co-operate, at least under peculiar circumstances, to nitrogen excretion and ammonia detoxification mechanisms in bivalve molluscs. The two ATPase activities stimulated by NH4 + maintained their typical response to the glycoside ouabain, specific inhibitor of the Na,K-ATPase, being the Na++ NH4 +-activated ATPase even more susceptive to the inhibitor and the ouabain-insensitive ATPase activity activated indifferently by Na+ or NH4 + unaffected by up to 10-2 M ouabain. In vitro assays were carried out to evaluate the response of the two Na-dependent ATPases to organotins in clams and mussels and to investigate the interaction of TBT with mussel mitochondrial oligomycin-sensitive Mg-ATPase. Since no literature data were available, the optimal assay conditions and oligomycin sensitivity of mussel mitochondrial MgATPase were determined. In T. philippinarum the ouabain-insensitive Na-ATPase was found to be refractory to TBT both in the gills and in the mantle, whereas the Na,K-ATPase was progressively inhibited by increasing TBT doses; the enzyme inhibition was more pronounced in the gills than in the mantle. In both tissues of M. galloprovincialis the Na,K-ATPase inhibition by alkyltins decreased in the order TBT>DBT(dibutyltin)>>MBT(monobutyltin)=TeET(tetraethyltin) (no effect). Mussel Na-ATPase confirmed its refractorimess to TBT and derivatives both in the gills and in the mantle. These results indicate that the Na,K-ATPase inhibition decreases as the number of alkyl chains bound to tin decreases; however a certain polarity of the organotin molecule is required to yield Na,K-ATPase inhibition, since no enzyme inhibition occurred in the presence of tetraalkyl-substituted derivatives such as TeET . Assays carried out in the presence of the dithioerythritol (DTE) pointed out that the sulphhydrylic agent is capable to prevent the Na,K-ATPase inhibition by TBT, thus suggesting that the inhibitor may link to -SH groups of the enzyme complex.. Finally, the different effect of alkyltins on the two Na-dependent ATPases may constitute a further tool to differentiate between the two enzyme activities. These results add to the wealth of literature data describing different responses of the two enzyme activities to endogenous and exogenous modulators . Mussel mitochondrial Mg-ATPase was also found to be in vitro inhibited by TBT both in the gills and in the mantle: the enzyme inhibition followed non competitive kinetics. The failed effect of DTE pointed out that in this case the interaction of TBT with the enzyme complex is probably different from that with the Na,K-ATPase. The results are consistent with literature data showing that alkyltin may interact with enzyme structures with different mechanisms. Mussel exposure to different TBT sublethal doses in aquaria was carried out for 120 hours. Two samplings (after 24 and 120 hrs) were performed in order to evaluate a short-term response of gill and mantle Na,K-ATPase, ouabain-insensitive Na-ATPase and Mg-ATPase activities. The in vivo response to the contaminants of the enzyme activities under study was shown to be partially different from that pointed out in the in vitro assays. Mitochondrial Mg-ATPase activity appeared to be activated in TBTexposed mussels with respect to control ones, thus confirming the complexity of evaluating in vivo responses of the enzyme activities to contaminants, due to possible interactions of toxicants with molluscan metabolism. Concluding, the whole of data point out that microsomal and mitochondrial ATPase activities of bivalve molluscs are generally responsive to environmental contaminants and suggest that in some cases membrane-bound enzyme activities may represent the molecular target of their toxicity. Since the Na,K-ATPase, the Na-ATPase and the Mg-ATPase activities are poorly studied in marine bivalves, this research may contribute to enlarge knowledge in this quite unexplored field.

Localizzazione della topoisomerasi IB sui telomeri di S. cerevisiae e ruolo della sua attività catalitica sulle modificazioni istoniche

Il superavvolgimento del DNA nelle cellule, regolato dalle DNA Topoisomerasi, influenza molti processi biologici, quali la trascrizione, la replicazione, la ricombinazione ed il rimodellamento della cromatina. La DNA Topoisomerasi IB eucariotica, (Top1), è un enzima efficiente nella rimozione dei superavvolgimenti del DNA in vitro e la sua principale funzione cellulare è la rimozione dei superavvolgimenti positivi e negativi generati durante la trascrizione e la replicazione. Risultati recenti hanno fornito evidenze sperimentali del coinvolgimento di Top1 in meccanismi multipli di regolazione dell’espressione genica eucariotica, in particolare nella fase di inizio e maturazione dei trascritti. Tuttavia, le funzioni di Top1 non sono ancora state stabilite a livello globale. Pertanto, nella presente tesi di dottorato abbiamo risposto a questa domanda con l’analisi dei profili di trascrizione genica globale e con studi di immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) in cellule di S. cerevisiae. Circa il 9% dei geni sono influenzati da Top1, e l’analisi dei profili di espressione mostra che Top1 wt aumenta l’utilizzo del glucosio e dei pathway per la produzione di energia, con specifica diminuzione della trascrizione dei geni telomerici e subtelomerici. Abbiamo inoltre dimostrato che Top1 wt, ma non il suo mutante inattivo, aumenta la velocità di crescita cellulare nelle cellule di lievito studiate. Le analisi di ChIP mostrano che, in confronto all’assenza dell’enzima, Top1 wt diminuisce l’acetilazione dell’istone H4, compresa quella specifica della lisina 16, nel telomero destro del cromosoma XIV mentre la mutazione che inattiva l’enzima aumenta in maniera marcata l’acetilazione dell’istone H4 e la di-metilazione della lisina 4 dell’istone H3. Top1 wt incrementa anche il reclutamento di Sir3 nelle regioni di confine della cromatina silenziata dello stesso telomero. Studi di immunoprecipitazione indicano che l’enzima interagisce direttamente con la struttura della cromatina telomerica poichè entrambe le proteine, quella wt e quella inattiva, sono localizzate sulle ripetizioni telomeriche dei cromosomi di lievito. Questi risultati dimostrano che Top1, una proteina non essenziale in lievito, ottimizza i livelli globali dei trascritti per una crescita più efficiente di cellule in fase esponenziale. Indagando il meccanismo che è alla base della specifica repressione dei geni telomerici, abbiamo dimostrato che Top1 favorisce delle modifiche posttraduzionali degli istoni che indicano una struttura della cromatina repressa nelle regioni telomeriche.

Il nucleotide extracellulare UTP: induzione della migrazione di cellule staminali emopoietiche CD34+

La letteratura scientifica degli ultimi anni si è arricchita di un numero sempre crescente di studi volti a chiarire i meccanismi che presiedono ai processi di homing di cellule staminali emopoietiche e del loro attecchimento a lungo termine nel midollo osseo. Tali fenomeni sembrano coinvolgere da un lato, l’interazione delle cellule staminali emopoietiche con la complessa architettura e componente cellulare midollare, e dall’altro la riposta ad un’ampia gamma di molecole regolatrici, tra le quali chemochine, citochine, molecole di adesione, enzimi proteolitici e mediatori non peptidici. Fanno parte di quest’ultimo gruppo anche i nucleotidi extracellulari, un gruppo di molecole-segnale recentemente caratterizzate come mediatori di numerose risposte biologiche, tra le quali l’allestimento di fenomeni flogistici e chemiotattici. Nel presente studio è stata investigata la capacità dei nucleotidi extracellulari ATP ed UTP di promuovere, in associazione alla chemochina CXCL12, la migrazione di cellule staminali umane CD34+. E’ così emerso che la stimolazione con UTP è in grado di incrementare significativamente la migrazione dei progenitori emopoietici in risposta al gradiente chemioattrattivo di CXCL12, nonché la loro capacità adesiva. Le analisi citofluorimetriche condotte su cellule migranti sembrano inoltre suggerire che l’UTP agisca interferendo con le dinamiche di internalizzazione del recettore CXCR4, rendendo così le cellule CD34+ maggiormente responsive, e per tempi più lunghi, al gradiente attrattivo del CXCL12. Saggi di homing competitivo in vivo hanno parallelamente mostrato, in topi NOD/SCID, che la stimolazione con UTP aumenta significativamente la capacità dei progenitori emopoeitci umani di localizzarsi a livello midollare. Sono state inoltre indagate alcune possibili vie di trasduzione del segnale attivate dalla stimolazione di recettori P2Y con UTP. Esperimenti di inibizione in presenza della tossina della Pertosse hanno evidenziato il coinvolgimento di proteine Gαi nella migrazione dipendente da CXCL12 ed UTP. Ulteriori indicazioni sono provenute dall’analisi del profilo trascrizionale di cellule staminali CD34+ stimolate con UTP, con CXCL12 o con entrambi i fattori contemporaneamente. Da questa analisi è emerso il ruolo di proteine della famiglia delle Rho GTPasi e di loro effettori a valle (ROCK 1 e ROCK 2) nel promuovere la migrazione UTP-dipendente. Questi dati sono stati confermati successivamente in vitro mediante esperimenti con Tossina B di C. Difficile (un inibitore delle Rho GTPasi) e con Y27632 (in grado di inibire specificatamente le cinasi ROCK). Nel complesso, i dati emersi in questo studio dimostrano la capacità del nucleotide extracellulare UTP di modulare la migrazione in vitro di progenitori emopoietici umani, nonché il loro homing midollare in vivo. L’effetto dell’UTP su questi fenomeni si esplica in concerto con la chemochina CXCL12, attraverso l’attivazione concertata di vie di trasduzione del segnale almeno parzialmente condivise da CXCR4 e recettori P2Y e attraverso il reclutamento comune di proteine ad attività GTPasica, tra le quali le proteine Gαi e i membri della famiglia delle Rho GTPasi.

Effetti dell'acido urico sulle cellule glomerulari mesangiali: meccanismi intracellulari di trasduzione del segnale e possibili implicazioni nella progressione del danno renale e nella sindrome infiammatoria in corso di nefropatie croniche

Uric acid is a major inducer of inflammation in renal interstitium and may play a role in the progression of renal damage in hyperuricemic subjects with primary nephropathies, renal vascular disease, and essential hypertension. At the same time, UA also acts as a water-soluble scavenger of reactive oxygen species. We evaluated the cellular effects of UA on cultured HMC as a potential interstitial target for abnormally elevated levels in acute and chronic renal disease. Intracellular free Ca2+ ([Ca2+]i) was monitored by microfluorometry of fura 2-loaded cells, while oxidation of intracellularly trapped non-fluorescent 2’,7’-dichlorofluorescein diacetate (DCFHDA, 20 uM) was employed to assess the generation of reactive oxygen species during 12-hr incubations with various concentrations of UA or monosodium urate. Fluorescent metabolites of DCFH-DA in the culture media of HMC were detected at 485/530 nm excitation/emission wavelengths, respectively. UA dose-dependently lowered resting [Ca2+]i (from 102±9 nM to 95±3, 57±2, 48±6 nM at 1-100 uM UA, respectively, p <0.05), leaving responses to vasoconstrictors such as angiotensin II unaffected. The effect was not due to Ca2+/H+ exchange upon acidification of the bathing media, as acetate, glutamate, lactate and other organic acids rather increased [Ca2+]i (to max. levels of 497±42 nM with 0.1 mM acetate). The decrease of [Ca2+]i was abolished by raising extracellular Ca2+ and not due to effects on Ca2+ channels or activation of Ca2+-ATPases, since unaffected by thapsigargin. The process rather appeared sensitive to removal of extracellular Na+ in combination with blockers of Na+/Ca2+ exchange, such as 2’,4’-dichlorobenzamil, pointing to a countertransport mechanism. UA dose-dependently prompted the extracellular release of oxidised DCFH (control 37±2 relative fluorescence units (RFU)/ml, 0.1uM 47±2, 1 uM 48±2, 10 uM 51±4, 0.1 mM 53±4; positive control, 10 uM sodium nitroprusside 92±5 RFU/ml, p<0.01). In summary, UA interferes with Ca2+ transport in cultured HMC, triggering oxidative stress which may initiate a sequence of events leading to interstitial injury and possibly amplifying renal vascular damage and/or the progression of chronic disease.