Atomic Force Microscopy Studies of the Amyloidogenic Processes of Intrinsically Unstructured Proteins related to Neurodegenerative Diseases

Protein aggregation and formation of insoluble aggregates in central nervous system is the main cause of neurodegenerative disease. Parkinson’s disease is associated with the appearance of spherical masses of aggregated proteins inside nerve cells called Lewy bodies. α-Synuclein is the main component of Lewy bodies. In addition to α-synuclein, there are more than a hundred of other proteins co-localized in Lewy bodies: 14-3-3η protein is one of them. In order to increase our understanding on the aggregation mechanism of α-synuclein and to study the effect of 14-3-3η on it, I addressed the following questions. (i) How α-synuclein monomers pack each other during aggregation? (ii) Which is the role of 14-3-3η on α-synuclein packing during its aggregation? (iii) Which is the role of 14-3-3η on an aggregation of α-synuclein “seeded” by fragments of its fibrils? In order to answer these questions, I used different biophysical techniques (e.g., Atomic force microscope (AFM), Nuclear magnetic resonance (NMR), Surface plasmon resonance (SPR) and Fluorescence spectroscopy (FS)).

The coupling between electron transfer and Protein/Solvent Dynamics in Photosynthetic Reaction Centers: Spectroscopic Studies in Amorphous Matrices

We investigated at the molecular level protein/solvent interactions and their relevance in protein function through the use of amorphous matrices at room temperature. As a model protein, we used the bacterial photosynthetic reaction center (RC) of Rhodobacter sphaeroides, a pigment protein complex which catalyzes the light-induced charge separation initiating the conversion of solar into chemical energy. The thermal fluctuations of the RC and its dielectric conformational relaxation following photoexcitation have been probed by analyzing the recombination kinetics of the primary charge-separated (P+QA-) state, using time resolved optical and EPR spectroscopies. We have shown that the RC dynamics coupled to this electron transfer process can be progressively inhibited at room temperature by decreasing the water content of RC films or of RC-trehalose glassy matrices. Extensive dehydration of the amorphous matrices inhibits RC relaxation and interconversion among conformational substates to an extent comparable to that attained at cryogenic temperatures in water-glycerol samples. An isopiestic method has been developed to finely tune the hydration level of the system. We have combined FTIR spectral analysis of the combination and association bands of residual water with differential light-minus-dark FTIR and high-field EPR spectroscopy to gain information on thermodynamics of water sorption, and on structure/dynamics of the residual water molecules, of protein residues and of RC cofactors. The following main conclusions were reached: (i) the RC dynamics is slaved to that of the hydration shell; (ii) in dehydrated trehalose glasses inhibition of protein dynamics is most likely mediated by residual water molecules simultaneously bound to protein residues and sugar molecules at the protein-matrix interface; (iii) the local environment of cofactors is not involved in the conformational dynamics which stabilizes the P+QA-; (iv) this conformational relaxation appears to be rather delocalized over several aminoacidic residues as well as water molecules weakly hydrogen-bonded to the RC.

Analysis of the memory B cell response against glycoconjugate vaccines

The development of vaccines directed against polysaccharide capsules of S. pneumoniae, H. influenzae and N. meningitidis have been of great importance in preventing potentially fatal infections. Bacterial capsular polysaccharides are T-cell-independent antigens that induce specific antibody response characterized by IgM immunoglobulins, with a very low IgG class switched response and lack of capability of inducing a booster response. The inability of pure polysaccharides to induce sustained immune responses has required the development of vaccines containing polysaccharides conjugated to a carrier protein, with the aim to generate T cell help. It is clear that the immunogenicity of glycoconjugate vaccines can vary depending on different factors, e.g. chemical nature of the linked polysaccharide, carrier protein, age of the target population, adjuvant used. The present study analyzes the memory B cell (MBC) response to the polysaccharide and to the carrier protein following vaccination with a glycoconjugate vaccine for the prevention of Group B streptococcus (GBS) infection. Not much is known about the role of adjuvants in the development of immunological memory raised against GBS polysaccharides, as well as about the influence of having a pre-existing immunity against the carrier protein on the B cell response raised against the polysaccharide component of the vaccine. We demonstrate in the mouse model that adjuvants can increase the antibody and memory B cell response to the carrier protein and to the conjugated polysaccharide. We also demonstrate that a pre-existing immunity to the carrier protein favors the development of the antibody and memory B cell response to subsequent vaccinations with a glycoconjugate, even in absence of adjuvants. These data provide a useful insight for a better understanding of the mechanism of action of this class of vaccines and for designing the best vaccine that could result in a productive and long lasting memory response.

Studio dei Vulcani di Fango per la definizione della Migrazione dei Fluidi Profondi

L’unione di approcci differenti durante lo studio dei sistemi petroliferi, come l’accoppiamento dello studio delle emissioni in superficie con le analisi geochimiche e strutturali, è un aspetto principale nelle strategie di sviluppo per la ricerca degli idrocarburi. La presenza di acqua connata nelle sequenze sedimentarie profonde e la sua sovrappressione che viene generata dalle spesse coperture sedimentarie, incrementata inoltre dalla generazione di idrocarburi in profondità, sono fattori di controllo primari per la migrazione e l’emissione di fluidi in superficie. I risultati ottenuti da questo studio forniscono nuovi elementi per la comprensione del ruolo dello studio dei vulcani di fango nell’esplorazione petrolifera, e nuove importanti prove per la caratterizzazione dei sistemi petroliferi nelle aree considerate.

CRRT nel paziente ad alto rischio emorragico: ottimizzazione di un protocollo di anticoagulazione regionale con citrato

L’anticoagulazione regionale con citrato (RCA) è una valida opzione in pazienti ad alto rischio emorragico. Lo scopo del nostro studio è stato di valutare, in pazienti critici sottoposti a CRRT per insufficienza renale acuta post-cardiochirurgica, efficacia e sicurezza di un protocollo di RCA in CVVH con l’impiego di una soluzione di citrato a bassa concentrazione (12mmol/L). Metodi: L’RCA-CVVH è stata adottata come alternativa all’eparina o alla CRRT senza anticoagulante (no-AC). Criteri per lo switch verso l’RCA: coagulazione dei circuiti entro 24h o complicanze legate all’eparina. Per facilitare l’impostazione dei parametri CVVH, abbiamo sviluppato un modello matematico per stimare il carico metabolico di citrato e la perdita di calcio. Risultati: In 36 mesi, sono stati sottoposti a RCA-CVVH 30 pazienti. La durata dei circuiti con RCA (50.5 ± 35.8 h, mediana 41, 146 circuiti) è risultata significativamente maggiore (p<0.0001) rispetto all’eparina (29.2±22.7 h, mediana 22, 69 circuiti) o alla no-AC CRRT (24.7±20.6 h, mediana 20, 74 circuiti). Il numero di circuiti funzionanti a 24, 48, 72 h è risultato maggiore durante RCA (p<0.0001). I target di Ca++ sistemico e del circuito sono stati facilmente mantenuti (1.18±0.13 e 0.37±0.09 mmol/L). Durante l’RCA-CVVH nessun paziente ha avuto complicanze emorragiche e il fabbisogno trasfusionale si è ridotto rispetto alle altre modalità (0.29 vs 0.69 unità/die, p<0.05). Le piastrine (p=0.012) e l’AT-III (p=0.004) sono aumentate durante RCA riducendo la necessità di supplementazione. L’RCA è stata interrotta per accumulo di citrato in un solo paziente (calcemia totale/s-Ca++ >2.5). Conclusioni: L’RCA ha consentito di prolungare la durata dei circuiti riducendo il fabbisogno trasfusionale e la necessità di supplementazione di AT-III e piastrine. L’utilizzo di un modello matematico ha facilitato l’impostazione dei parametri CVVH. L’RCA appare meritevole di maggiore considerazione come metodica di anticoagulazione di prima scelta in pazienti ad alto rischio emorragico sottoposti a CRRT.

La sostenibilità ambientale dal Progetto Edilizio al Piano Urbano: L'integrazione della variabile energetica nella pianificazione del territorio

La questione energetica ha assunto, negli ultimi anni, un ruolo centrale nel dibattito mondiale in relazione a quattro fattori principali: la non riproducibilità delle risorse naturali, l’aumento esponenziale dei consumi, gli interessi economici e la salvaguardia dell'equilibrio ambientale e climatico del nostro Pianeta. E’ necessario, dunque, cambiare il modello di produzione e consumo dell’energia soprattutto nelle città, dove si ha la massima concentrazione dei consumi energetici. Per queste ragioni, il ricorso alle Fonti Energetiche Rinnovabili (FER) si configura ormai come una misura necessaria, opportuna ed urgente anche nella pianificazione urbanistica. Per migliorare la prestazione energetica complessiva del sistema città bisogna implementare politiche di governo delle trasformazioni che escano da una logica operativa “edificio-centrica” e ricomprendano, oltre al singolo manufatto, le aggregazioni di manufatti e le loro relazioni/ interazioni in termini di input e output materico-energetiche. La sostituzione generalizzata del patrimonio edilizio esistente con nuovi edifici iper-tecnologici, è improponibile. In che modo quindi, è possibile ridefinire la normativa e la prassi urbanistica per generare tessuti edilizi energeticamente efficienti? La presente ricerca propone l’integrazione tra la nascente pianificazione energetica del territorio e le più consolidate norme urbanistiche, nella generazione di tessuti urbani “energy saving” che aggiungano alle prestazioni energetico-ambientali dei singoli manufatti quelle del contesto, in un bilancio energetico complessivo. Questo studio, dopo aver descritto e confrontato le principali FER oggi disponibili, suggerisce una metodologia per una valutazione preliminare del mix di tecnologie e di FER più adatto per ciascun sito configurato come “distretto energetico”. I risultati di tale processo forniscono gli elementi basilari per predisporre le azioni necessarie all’integrazione della materia energetica nei Piani Urbanistici attraverso l’applicazione dei principi della perequazione nella definizione di requisiti prestazionali alla scala insediativa, indispensabili per un corretto passaggio alla progettazione degli “oggetti” e dei “sistemi” urbani.

The Domon Family of Plant Plasma Membrane B-Type Cytochromes: Heterologous Expression, Biochemical Characterization and Physiological Roles in Vivo

The DOMON domain is a domain widespread in nature, predicted to fold in a β-sandwich structure. In plants, AIR12 is constituted by a single DOMON domain located in the apoplastic space and is GPI-modified for anchoring to the plasma membrane. Arabidopsis thaliana AIR12 has been heterologously expressed as a recombinant protein (recAtAIR12) in Pichia pastoris. Spectrophotometrical analysis of the purified protein showed that recAtAir12 is a cytochrome b. RecAtAIR12 is highly glycosylated, it is reduced by ascorbate, superoxide and naftoquinones, oxidised by monodehydroascorbate and oxygen and insensitive to hydrogen peroxide. The addition of recAtAIR12 to permeabilized plasma membranes containing NADH, FeEDTA and menadione, caused a statistically significant increase in hydroxyl radicals as detected by electron paramagnetic resonance. In these conditions, recAtAIR12 has thus a pro-oxidant role. Interestingly, AIR12 is related to the cytochrome domain of cellobiose dehydrogenase which is involved in lignin degradation, possibly via reactive oxygen species (ROS) production. In Arabidopsis the Air12 promoter is specifically activated at sites where cell separations occur and ROS, including •OH, are involved in cell wall modifications. air12 knock-out plants infected with Botrytis cinerea are more resistant than wild-type and air12 complemented plants. Also during B. cinerea infection, cell wall modifications and ROS are involved. Our results thus suggest that AIR12 could be involved in cell wall modifying reactions by interacting with ROS and ascorbate. CyDOMs are plasma membrane redox proteins of plants that are predicted to contain an apoplastic DOMON fused with a transmembrane cytochrome b561 domain. CyDOMs have never been purified nor characterised. The trans-membrane portion of a soybean CyDOM was expressed in E. coli but purification could not be achieved. The DOMON domain was expressed in P. pastoris and shown to be itself a cytochrome b that could be reduced by ascorbate.

RNA non-codificanti indotti da danno al DNA regolano il fattore di trascrizione HIF-1α

Recenti analisi sull’intero trascrittoma hanno rivelato una estensiva trascrizione di RNA non codificanti (ncRNA), le quali funzioni sono tuttavia in gran parte sconosciute. In questo lavoro è stato dimostrato che alte dosi di camptotecina (CPT), un farmaco antitumorale inibitore della Top1, aumentano la trascrizione di due ncRNA antisenso in 5’ e 3’ (5'aHIF-1α e 3'aHIF-1α rispettivamente) al locus genico di HIF-1α e diminuiscono i livelli dell’mRNA di HIF-1α stesso. Gli effetti del trattamento sono Top1-dipendenti, mentre non dipendono dal danno al DNA alla forca di replicazione o dai checkpoint attivati dal danno al DNA. I ncRNA vengono attivati in risposta a diversi tipi di stress, il 5'aHIF-1α è lungo circa 10 kb e possiede sia il CAP in 5’ sia poliadenilazione in 3’ (in letteratura è noto che il 3'aHIF-1α è un trascritto di 1,7 kb, senza 5’CAP né poliadenilazione). Analisi di localizzazione intracellulare hanno dimostrato che entrambi sono trascritti nucleari. In particolare 5'aHIF-1α co-localizza con proteine del complesso del poro nucleare, suggerendo un suo possibile ruolo come mediatore degli scambi della membrana nucleare. È stata dimostrata inoltre la trascrizione dei due ncRNA in tessuti di tumore umano del rene, evidenziandone possibili ruoli nello sviluppo del cancro. È anche noto in letteratura che basse dosi di CPT in condizioni di ipossia diminuiscono i livelli di proteina di HIF-1α. Dopo aver dimostrato su diverse linee cellulari che i due ncRNA sopracitati non potessero essere implicati in tale effetto, abbiamo studiato le variazioni dell’intero miRnoma alle nuove condizioni sperimentali. In tal modo abbiamo scoperto che il miR-X sembra essere il mediatore molecolare dell’abbattimento di HIF-1α dopo trattamento con basse dosi di CPT in ipossia. Complessivamente, questi risultati suggeriscono che il fattore di trascrizione HIF-1α venga finemente regolato da RNA non-codificanti indotti da danno al DNA.

Streptococcus agalactiae adapts to glucose stress conditions by modulating gene expression profile

Diabetes mellitus is considered a risk factor for Group B Streptococcus (GBS) infections. Typically, this pathology is associated to high glucose levels in the bloodstream. Although clinical evidences support this notion, the physiological mechanisms underlying GBS adaptation to such conditions are not yet defined. In the attempt to address this issue, we performed comparative global gene expression analysis of GBS grown under glucose-stress conditions and observed that a number of metabolic and virulence genes was differentially regulated. Of importance, we also demonstrated that by knocking-out the csrRS locus the transcription profile of GBS grown in high-glucose conditions was profoundly affected, with more than a third of glucose-dependent genes, including the virulence factor bibA, found to be controlled by this two-component system. Furthermore, in vitro molecular analysis showed that CsrR specifically binds to the bibA promoter and the phosphorilation increases the affinity of the regulator to this promoter region. Moreover, we demonstrated that CsrR acts as a repressor of bibA expression by binding to its promoter in vivo. In conclusion, this work by elucidating both the response of GBS to pathological glucose conditions and the underlined molecular mechanisms will set the basis for a better understanding of GBS pathogenesis.

Pratiche del possibile: i Participatory Guarantee Systems e le scelte d'acquisto del consumatore brasiliano

Negli ultimi anni, parallelamente all’espansione del settore biologico, si è assistito a un crescente interesse per i modelli alternativi di garanzia dell’integrità e della genuinità dei prodotti biologici. Gruppi di piccoli agricoltori di tutto il mondo hanno iniziato a sviluppare approcci alternativi per affrontare i problemi connessi alla certificazione di terza parte. Queste pratiche sono note come Sistemi di Garanzia Partecipativa (PGS). Tali modelli: (i) si basano sugli standard di certificazione biologica dell’IFOAM, (ii) riguardano il complesso dei produttori di una comunità rurale, (iii) comportano l’inclusione di una grande varietà di attori e (iv) hanno lo scopo di ridurre al minimo burocrazia e costi semplificando le procedure di verifica e incorporando un elemento di educazione ambientale e sociale sia per i produttori sia per i consumatori. Gli obiettivi di questo lavoro di ricerca: • descrivere il funzionamento dei sistemi di garanzia partecipativa; • indicare i vantaggi della loro adozione nei Paesi in via di sviluppo e non; • illustrare il caso della Rede Ecovida de Agroecologia (Brasile); • offrire uno spunto di riflessione che riguarda il consumatore e la relativa fiducia nel modello PGS. L’impianto teorico fa riferimento alla Teoria delle Convenzioni. Sulla base del quadro teorico è stato costruito un questionario per i consumatori con lo scopo di testare l’appropriatezza delle ipotesi teoriche. I risultati finali riguardano la stima del livello di conoscenza attuale, la fiducia e la volontà d’acquisto dei prodotti PGS da parte dei consumatori nelle aree considerate. Sulla base di questa ricerca sarà possibile adattare ed esportare il modello empirico in altri paesi che presentano economie diverse per cercare di comprendere il potenziale campo di applicazione dei sistemi di garanzia partecipativa.

Trascriptome analysis and functional genomics of Neisseria meningitidis in human blood

Neisseria meningitidis (Nm) is the major cause of septicemia and meningococcal meningitis. During the course of infection, it must adapt to different host environments as a crucial factor for survival. Despite the severity of meningococcal sepsis, little is known about how Nm adapts to permit survival and growth in human blood. A previous time-course transcriptome analysis, using an ex vivo model of human whole blood infection, showed that Nm alters the expression of nearly 30% of ORFs of the genome: major dynamic changes were observed in the expression of transcriptional regulators, transport and binding proteins, energy metabolism, and surface-exposed virulence factors. Starting from these data, mutagenesis studies of a subset of up-regulated genes were performed and the mutants were tested for the ability to survive in human whole blood; Nm mutant strains lacking the genes encoding NMB1483, NalP, Mip, NspA, Fur, TbpB, and LctP were sensitive to killing by human blood. Then, the analysis was extended to the whole Nm transcriptome in human blood, using a customized 60-mer oligonucleotide tiling microarray. The application of specifically developed software combined with this new tiling array allowed the identification of different types of regulated transcripts: small intergenic RNAs, antisense RNAs, 5’ and 3’ untranslated regions and operons. The expression of these RNA molecules was confirmed by 5’-3’RACE protocol and specific RT-PCR. Here we describe the complete transcriptome of Nm during incubation in human blood; we were able to identify new proteins important for survival in human blood and also to identify additional roles of previously known virulence factors in aiding survival in blood. In addition the tiling array analysis demonstrated that Nm expresses a set of new transcripts, not previously identified, and suggests the presence of a circuit of regulatory RNA elements used by Nm to adapt to proliferate in human blood.

Characterization of the structure and iron uptake mechanisms of the Staphylococcus aureus ferric hydroxamate-binding lipoprotein FhuD2

The Reverse Vaccinology (RV) approach allows using genomic information for the delineation of new protein-based vaccines starting from an in silico analysis. The first powerful example of the application of the RV approach is given by the development of a protein-based vaccine against serogroup B Meningococcus. A similar approach was also used to identify new Staphylococcus aureus vaccine candidates, including the ferric hydroxamate-binding lipoprotein FhuD2. S. aureus is a widespread human pathogen, which employs various different strategies for iron uptake, including: (i) siderophore-mediated iron acquisition using the endogenous siderophores staphyloferrin A and B, (ii) siderophore-mediated iron acquisition using xeno-siderophores (the pathway exploited by FhuD2) and (iii) heme-mediated iron acquisition. In this work the high resolution crystal structure of FhuD2 in the iron (III)-siderophore-bound form was determined. FhuD2 belongs to the Periplasmic Binding Protein family (PBP ) class III, and is principally formed by two globular domains, at the N- and C-termini of the protein, that make up a cleft where ferrichrome-iron (III) is bound. The N- and C-terminal domains, connected by a single long α-helix, present Rossmann-like folds, showing a β-stranded core and an α-helical periphery, which do not undergo extensive structural rearrangement when they interact with the ligand, typical of class III PBP members. The structure shows that ferrichrome-bound iron does not come directly into contact with the protein; rather, the metal ion is fully coordinated by six oxygen donors of the hydroxamate groups of three ornithine residues, which, with the three glycine residues, make up the peptide backbone of ferrichrome. Furthermore, it was found that iron-free ferrichrome is able to subtract iron from transferrin. This study shows for the first time the structure of FhuD2, which was found to bind to siderophores ,and that the protein plays an important role in S. aureus colonization and infection phases.

Insights in the maturation of pathogenic bacteria vaccine candidates using mass spectrometry based approaches

The study of the maturation process that occurs to a protein is of pivotal importance for the understanding of its function. This is true also in the vaccine field but in this case is also important to evaluate if inappropriate protein conformation and maturation play roles in the impairment of the functional immunogenicity of protein vaccines. Mass spectrometry (MS) is the method of choice for the study of the maturation process since each modification that occurs during the maturation will lead to a change in the mass of the entire protein. Therefore the aim of my thesis is the development of mass spectrometry-based approaches to study the maturation of proteins and the application of these methods to proteic vaccine candidates. The thesis is divided in two main parts. In the first part, I focused my attention on the study of the maturation of different vaccine candidates using native mass spectrometry. The analyses in this case have been performed using recombinant proteins produced in E. coli. In the second part I applied different MS strategies for the identification of unknown PTMs on pathogenic bacteria surface proteins since modified surface proteins are now considered for vaccine candidate selection.

Sistemi strutturali cellulari a pareti portanti in cemento armato gettato in opera realizzate con la tecnologia del pannello di supporto in polistirene

In questa Tesi di Dottorato di Ricerca sono state studiate le caratteristiche strutturali e le relative prestazioni dei sistemi strutturali cellulari a pareti tozze di tipo sandwich in c. a. gettato in opera realizzate con la tecnologia del pannello di supporto in polistirene. Tali sistemi strutturali sono caratterizzati da numerose peculiarità; infatti, (i) il comportamento globale delle strutture risulta essere di tipo cellulare, e, le pareti che costituiscono il sistema resistente alle azioni sia orizzontali che verticali risultano essere: (ii) tozze, (iii) di tipo sandwich e caratterizzate da: (iv) basse percentuali di armatura, (v) ridotti tassi di lavoro a sforzo assiale e (vi) stesso quantitativo di armatura orizzontale e verticale. Date le specificità dei sistemi strutturali in esame, si è, in primo luogo, cercato di inquadrare le peculiarità strutturali sopra elencate nell’ambito scientifico. Ciò ha consentito di riscontrare una profonda carenza nella conoscenza relativa al comportamento di tali strutture specialmente nei confronti delle azioni orizzontali di tipo sismico. Pertanto i due principali obiettivi di questa Tesi di Dottorato sono stati: (1) la sistematizzazione scientifica e la relativa interpretazione di 10 anni di prove sperimentali condotte sul sistema strutturale in esame; e (2) la progettazione, la realizzazione e l’interpretazione preliminare dei risultati di una prova su tavola vibrante di una struttura a tre piani con pianta rettangolare, realizzata con la tecnologia del pannello di supporto in polistirene (la prova è stata effettuata nell’ambito del progetto di ricerca Europeo SERIES). Questa ricerca ha dunque consentito di far luce sul comportamento (in particolar modo, nei confronti delle azioni orizzontali di tipo sismico) dei sistemi strutturali composti da pareti tozze di tipo sandwich in c. a. gettato in opera realizzati con la tecnologia del pannello di supporto in polistirene.

The effect of osmolytes on protein fold stability at the single-molecule level

By pulling and releasing the tension on protein homomers with the Atomic Force Miscroscope (AFM) at different pulling speeds, dwell times and dwell distances, the observed force-response of the protein can be fitted with suitable theoretical models. In this respect we developed mathematical procedures and open-source computer codes for driving such experiments and fitting Bell’s model to experimental protein unfolding forces and protein folding frequencies. We applied the above techniques to the study of proteins GB1 (the B1 IgG-binding domain of protein G from Streptococcus) and I27 (a module of human cardiac titin) in aqueous solutions of protecting osmolytes such as dimethyl sulfoxide (DMSO), glycerol and trimethylamine N-oxide (TMAO). In order to get a molecular understanding of the experimental results we developed an Ising-like model for proteins that incorporates the osmophobic nature of their backbone. The model benefits from analytical thermodynamics and kinetics amenable to Monte-Carlo simulation. The prevailing view used to be that small protecting osmolytes bridge the separating beta-strands of proteins with mechanical resistance, presumably shifting the transition state to significantly higher distances that correlate with the molecular size of the osmolyte molecules. Our experiments showed instead that protecting osmolytes slow down protein unfolding and speed-up protein folding at physiological pH without shifting the protein transition state on the mechanical reaction coordinate. Together with the theoretical results of the Ising-model, our results lend support to the osmophobic theory according to which osmolyte stabilisation is a result of the preferential exclusion of the osmolyte molecules from the protein backbone. The results obtained during this thesis work have markedly improved our understanding of the strategy selected by Nature to strengthen protein stability in hostile environments, shifting the focus from hypothetical protein-osmolyte interactions to the more general mechanism based on the osmophobicity of the protein backbone.