Studio della patogenesi di HIV-1 nel compartimento osseo: effetti della terapia antiretrovirale convenzionale e nuovi approcci all'eradicazione

L’obiettivo della tesi è studiare il virus HIV-1 in relazione alle alterazioni sistemiche, riscontrate nel paziente HIV-infetto, in particolare alterazioni a carico del sistema scheletrico, indotte dal virus o dall’azione dei farmaci utilizzati nella terapia antiretrovirale (HAART). L’incidenza dell’osteoporosi nei pazienti HIV-positivi è drammaticamente elevata rispetto alla popolazione sana. Studi clinici hanno evidenziato come alcuni farmaci, ad esempio inibitori della proteasi virale, portino alla compromissione dell’omeostasi ossea, con aumento del rischio fratturativo. Il nostro studio prevede un follow-up di 12 mesi dall’inizio della HAART in una coorte di pazienti naïve, monitorando diversi markers ossei. I risultati ottenuti mostrano un incremento dei markers metabolici del turnover osseo, confermando l’impatto della HAART sull’omeostasi ossea. Successivamente abbiamo focalizzato la nostra attenzione sugli osteoblasti, il citotipo che regola la sintesi di nuova matrice ossea. Gli esperimenti condotti sulla linea HOBIT mettono in evidenza come il trattamento, in particolare con inibitori della proteasi, porti ad apoptosi nel caso in cui vi sia una concentrazione di farmaco maggiore di quella fisiologica. Tuttavia, anche concentrazioni fisiologiche di farmaci possono regolare negativamente alcuni marker ossei, come ALP e osteocalcina. Infine esiste la problematica dell’eradicazione di HIV-1 dai reservoirs virali. La HAART riesce a controllare i livelli viremici, ciononostante diversi studi propongono alcuni citotipi come potenziali reservoir di infezione, vanificando l’effetto della terapia. Abbiamo, perciò, sviluppato un nuovo approccio molecolare all’eradicazione: sfruttare l’enzima virale integrasi per riconoscere in modo selettivo le sequenze LTR virali per colpire il virus integrato. Fondendo integrasi e l’endonucleasi FokI, abbiamo generato diversi cloni. Questi sono stati transfettati stabilmente in cellule Jurkat, suscettibili all’infezione. Una volta infettate, abbiamo ottenuto una significativa riduzione dei markers di infezione. Successivamente la transfezione nella linea linfoblastica 8E5/LAV, che porta integrata nel genoma una copia di HIV, ha dato risultati molto incoraggianti, come la forte riduzione del DNA virale integrato.

Effetti sulle funzioni autonomiche e sugli stati di veglia e di sonno della manipolazione centrale farmacologica del sistema ipocretinergico nel ratto

Obiettivo della tesi è stato quello di studiare il ruolo svolto dall’ipotalamo laterale (LH) nella regolazione dei processi di integrazione dell’attività autonomica e termoregolatoria con quella degli stati di veglia e sonno. A questo scopo, l’attività dell’LH è stata inibita per 6 ore (Esperimento A) mediante microiniezioni locali dell’agonista GABAA muscimolo nel ratto libero di muoversi, nel quale sono stati monitorati in continuo l’elelttroencefalogramma, l’elettromiogramma nucale, la pressione arteriosa (PA) e la temperatura ipotalamica (Thy) e cutanea. Gli animali sono stati studiati a temperatura ambientale (Ta) di 24°C e 10°C. I risultati hanno mostrato che l’inibizione acuta dell’LH riduce l’attività di veglia e sopprime la comparsa del sonno REM. Ciò avviene attraverso l’induzione di uno stato di sonno NREM caratterizzato da ipersincronizzazione corticale, con scomparsa degli stati transizionali al sonno REM. Quando l’animale è esposto a bassa Ta, tali alterazioni si associano a un ampio calo della Thy, che viene compensato da meccanismi vicarianti solo dopo un paio d’ore dall’iniezione. Sulla base di tali risultati, si è proceduto ad un ulteriore studio (Esperimento B) volto ad indagare il ruolo del neuropeptide ipocretina (prodotto in modo esclusivo a livello dell’LH) nei processi termoregolatori, mediante microiniezioni del medesimo nel bulbo rostrale ventromediale (RVMM), stazione cruciale della rete nervosa preposta all’attivazione dei processi termogenetici. La somministrazione di ipocretina è stata in grado di attivare la termogenesi e di potenziare la comparsa della veglia, con concomitante lieve incremento della PA e della frequenza cardiaca, quando effettuata alle Ta di 24°C o di 10°C, ma non alla Ta di 32°C. In conclusione, i risultati indicano che l’LH svolge un ruolo cruciale nella promozione degli stati di veglia e di sonno REM e, per tramite dell’ipocretina, interviene in modo coplesso a livello del RVMM nella regolazione dei processi di coordinamento dell'attività di veglia con quella termoregolatoria.

Composti perfluorurati: Valutazione degli effetti biologici e molecolari in modelli cellulari

L’acido perfluorottanoico (PFOA) e l’acido perfluoronanoico (PFNA) sono composti perfluorurati (PFCs) comunemente utilizzati nell’industria, negli ultimi 60 anni, per diverse applicazioni. A causa della loro resistenza alla degradazione, questi composti sono in grado di accumularsi nell’ambiente e negli organismi viventi, da cui possono essere assunti in particolare attraverso la dieta. Le esistenti evidenze sugli effetti dell’esposizione negli animali, tra cui la potenziale cancerogenicità, hanno accresciuto l’interesse sui possibili rischi per la salute nell’uomo. Recenti studi sull’uomo indicano che i PFC sono presenti nel siero, con livelli molto alti soprattutto nei lavoratori cronicamente esposti, e sono associati positivamente al cancro al seno e alla prostata. Inoltre, sono state riportate proprietà estrogen-like e variazioni nei livelli di metilazione sui promotori di alcuni geni. L’esposizione in utero è stata associata positivamente a ipometilazione globale del DNA nel siero cordonale. L’obiettivo di questo studio è stato quello di indagare gli effetti dell’esposizione a questi perfluorurati su linee cellulari tumorali e primarie umane (MOLM-13, RPMI, HEPG2, MCF7,WBC, HMEC e MCF12A), appartenenti a diversi tessuti target, utilizzando un ampio range di concentrazioni (3.12 nM - 500 μM). In particolare, si è valutato: la vitalità, il ciclo cellulare, l’espressione genica, la metilazione globale del DNA e la metilazione gene specifica. Dai risultati è emerso come entrambi i perfluorurati abbiano effetti biologici: PFOA presenta un effetto prevalente citostatico, PFNA prevalentemente citotossico. L’effetto è, però, prevalente sulle linee cellulari primarie di epitelio mammario (HMEC, MCF12A), anche a concentrazioni riscontrate in lavoratori cronicamente esposti (≥31,25 µM). Dall’analisi su queste cellule primarie, non risultano variazioni significative della metilazione globale del DNA alle concentrazioni di 15,6 e 31,25 µM. Emergono invece variazioni sui geni marcatori del cancro al seno, del ciclo cellulare, dell’apoptosi, del pathway di PPAR-α e degli estrogeni, ad una concentrazione di 31,25 µM di entrambi i PFCs.

Raccontare, resistere. La denuncia tra novela negra e testimonio. Affinita' e differenze in tre scrittori ispanoamericani: Serna, Walsh e Bolaño.

La tesi è incentrata sui recenti sviluppi della narrativa testimoniale dell’America Latina. Verranno presi in considerazione gli ultimi contributi critici dedicati al rapporto tra finzione e realtà in letteratura, e sarà dato spazio alla costruzione narrativa della realtà e alla nascita del testimonio, come genere a sé, che raccoglie alcune delle principali opere latinoamericane degli ultimi quaranta anni. Nello specifico, l’indagine riguarderà la rappresentazione letteraria della violenza nella narrativa di denuncia di tre autori ispoanoamericani: la novela negra di Enrique Serna, il poliziesco testimoniale di Rodolfo Walsh e la scrittura estrema di Roberto Bolaño. Obiettivo della ricerca è capire in che modo i tre scrittori hanno raccontato le loro verità alternative, provando a salvaguardare la memoria, e quali effetti hanno ottenuto. Verranno analizzate non solo le tematiche affrontate, facendo riferimento quindi al contesto storico, politico e sociale al quale si rifanno, ma saranno illustrate anche le differenti tecniche di costruzione del romanzo, dell’intreccio e della trama, e verrà isolato il ruolo del testimone (diretto o indiretto) e delle fonti, per cogliere le differenze ma anche le similitudini stilistiche e narrative di ognuna delle opere. Più in generale, dimostreremo come e quanto i testi di questi autori costituiscano in realtà una forte critica al sistema imperante e diano voce alle categorie sociali altrimenti emarginate.

Effetti dell’introduzione dei Principi contabili internazionali sul principio di derivazione del reddito d’impresa dal risultato di bilancio

Con il presente lavoro si è tentato di verificare se le ragioni che hanno portato l’ordinamento italiano ad adottare il principio della derivazione del reddito d'impresa dal risultato contabile, possano essere considerate ancora attuali alla luce dell'introduzione dei principi IAS/IFRS nel nostro sistema contabile. In particolare, si è cercato di esaminare se questo collegamento ai principi contabili internazionali, introdotto nel nostro ordinamento anche per la redazione dei bilanci d'esercizio, abbia comportato il venir meno della neutralità dell'imposizione fiscale tra le società cd. Ias adopter e no Ias adopter. L'analisi di questa problematica è stata condotta anche prendendo come riferimento le modalità di recepimento delle opzioni contenute nel Regolamento n. 1606/2002 da parte dei legislatori di alcuni Stati europei, e valutando se le conseguenze fiscali emergenti tra i vari ordinamenti possano creare possibili distorsioni alla concorrenza ed alle libertà fondamentali dell’Unione europea.

Ricerca di nuove strategie differenziative: Analisi degli effetti di stimoli fisici e molecolari su cellule mesenchimali umane isolate da tessuto adiposo

Introduzione. Le cellule mesenchimali derivate dal tessuto adiposo (hASC) rappresentano un importante strumento per la terapia cellulare, in quanto derivano da un tessuto adulto abbondante e facilmente reperibile. Con il dispositivo medico Lipogems l’isolamento di tali cellule è eseguito esclusivamente mediante sollecitazioni meccaniche. Il prodotto ottenuto è quindi minimamente manipolato e subito utilizzabile. Ad oggi, il condizionamento pro-differenziativo delle staminali è per lo più attuato mediante molecole di sintesi. Tuttavia, altri fattori possono modulare la fisiologia cellulare, come gli stimoli fisici e molecole naturali. Onde elettromagnetiche hanno indotto in modelli cellulari staminali l’espressione di alcuni marcatori di differenziamento e, in cellule adulte, una riprogrammazione, mentre estratti embrionali di Zebrafish sono risultati antiproliferativi sia in vitro che in vivo. Metodi. La ricerca di nuove strategie differenziative sia di natura fisica che molecolare, nel particolare onde acustiche ed estratti embrionali di Zebrafish, è stata condotta utilizzando come modello cellulare le hASC isolate con Lipogems. Onde acustiche sono state somministrate mediante l’utilizzo di due apparati di trasduzione, un generatore di onde meccaniche e il Cell Exciter . I trattamenti con gli estratti embrionali sono stati effettuati utilizzando diverse concentrazioni e diversi tempi sperimentali. Gli effetti sull’espressione dei marcatori di staminalità e differenziamento relativi ai trattamenti sono stati saggiati in RT-PCR quantitativa relativa e/o in qPCR. Per i trattamenti di tipo molecolare è stata valutata anche la proliferazione. Risultati e conclusioni. La meta-analisi dei dati delle colture di controllo mostra la stabilità d’espressione genica del modello. I trattamenti con i suoni inducono variazioni dell’espressione genica, suggerendo un ruolo regolatorio di tali stimoli, in particolare del processo di commitment cardiovascolare. Due degli estratti embrionali di Zebrafish testati inibiscono la proliferazione alle 72 ore dalla somministrazione. L’analisi d’espressione associata ai trattamenti antiproliferativi suggerisce che tale effetto abbia basi molecolari simili ai processi di differenziamento.

Studio degli effetti della mordenzatura con acido fluoridrico sul disilicato di litio utilizzato in odontoiatria

Scopo dello studio: valutare i cambiamenti indotti da diversi trattamenti di mordenzatura sulla morfologia superficiale e sulla microstruttura di due vetro-ceramiche a base disilicato di litio (IPS e.max® Press e IPS e.max® CAD) ed esaminarne gli effetti sia sull’adesione con un cemento resinoso che sulla resistenza alla flessione. Materiali e metodi: Settanta dischetti (12 mm di diametro, 2 mm di spessore) di ogni ceramica sono stati preparati e divisi in 5 gruppi: nessun trattamento (G1), HF 5% 20s (G2), HF 5% 60s (G3), HF 9.6% 20s (G4), HF 9.6% 60s (G5). Un campione per ogni gruppo è stato analizzato mediante profilometro ottico e osservato al SEM. Per gli altri campioni è stato determinato lo shear bond strength (SBS) con un cemento resinoso. Dopo l’SBS test, i campioni sono stati caricati fino a frattura utilizzando il piston-on-three-ball test per determinarne la resistenza biassiale alla flessione. Risultati: L’analisi morfologica e microstrutturale dei campioni ha rivelato come diversi trattamenti di mordenzatura producano delle modifiche nella rugosità superficiale che non sono direttamente collegate ad un aumento dei valori di adesione e dei cambiamenti microstrutturali che sono più rilevanti con l’aumento del tempo di mordenzatura e di concentrazione dell’acido. I valori medi di adesione (MPa) per IPS e.max® CAD sono significativamente più alti in G2 e G3 (21,28 +/- 4,9 e 19,55 +/- 5,41 rispettivamente); per IPS e.max® Press, i valori più elevati sono in G3 (16,80 +/- 3,96). La resistenza biassiale alla flessione media (MPa) è più alta in IPS e.max® CAD (695 +/- 161) che in IPS e.max® Press (588 +/- 117), ma non è non influenzata dalla mordenzatura con HF. Conclusioni: il disilicato di litio va mordenzato preferibilmente con HF al 5%. La mordenzatura produce alcuni cambiamenti superficiali e microstrutturali nel materiale, ma tali cambiamenti non ne influenzano la resistenza in flessione.

Modellazione edilizia e simulazione energetica per le analisi delle prestazioni e la progettazione integrata delle cantine aziendali

Il presente studio si colloca nell’ambito di una ricerca il cui obiettivo è la formulazione di criteri progettuali finalizzati alla ottimizzazione delle prestazioni energetiche delle cantine di aziende vitivinicole con dimensioni produttive medio-piccole. Nello specifico la ricerca si pone l’obiettivo di individuare degli indicatori che possano valutare l’influenza che le principali variabili progettuali hanno sul fabbisogno energetico dell’edificio e sull’andamento delle temperature all’interno dei locali di conservazione ed invecchiamento del vino. Tali indicatori forniscono informazioni sulla prestazione energetica dell’edificio e sull’idoneità dei locali non climatizzati finalizzata alla conservazione del vino Essendo la progettazione una complessa attività multidisciplinare, la ricerca ha previsto l’ideazione di un programma di calcolo in grado di gestire ed elaborare dati provenienti da diversi ambiti (ingegneristici, architettonici, delle produzioni agroindustriali, ecc.), e di restituire risultati sintetici attraverso indicatori allo scopo individuati. Il programma è stato applicato su un caso-studio aziendale rappresentativo del settore produttivo. Sono stati vagliati gli effetti di due modalità di vendemmia e di quattro soluzioni architettoniche differenti. Le soluzioni edilizie derivano dalla combinazione di diversi isolamenti termici e dalla presenza o meno di locali interrati. Per le analisi sul caso-studio ci si è avvalsi di simulazioni energetiche in regime dinamico, supportate e validate da campagne di monitoraggio termico e meteorologico all’interno dell’azienda oggetto di studio. I risultati ottenuti hanno evidenziato come il programma di calcolo concepito nell’ambito di questo studio individui le criticità dell’edificio in termini energetici e di “benessere termico” del vino e consenta una iterativa revisione delle variabili progettuale indagate. Esso quindi risulta essere uno strumento informatizzato di valutazione a supporto della progettazione, finalizzato ad una ottimizzazione del processo progettuale in grado di coniugare, in maniera integrata, gli obiettivi della qualità del prodotto, della efficienza produttiva e della sostenibilità economica ed ambientale.

Simulazione dinamica di un veicolo dotato di powertrain ibrido endotermico-elettrico

Nel panorama motoristico ed automobilistico moderno lo sviluppo di motori a combustione interna e veicoli è fortemente influenzato da diverse esigenze che spesso sono in contrasto le une con le altre. Infatti gli obiettivi di economicità e riduzione dei costi riguardanti la produzione e la commercializzazione dei prodotti sono in contrasto con gli sforzi che devono essere operati dalle case produttrici per soddisfare le sempre più stringenti normative riguardanti le emissioni inquinanti ed i consumi di carburante dei veicoli. Fra le numerose soluzioni presenti i veicoli ibridi rappresentano una alternativa che allo stato attuale è già presente sul mercato in varie forme, a seconda della tipologie di energie accoppiate. In letteratura è possibile trovare numerosi studi che trattano l’ottimizzazione dei componenti o delle strategie di controllo di queste tipologie di veicoli: in moltissimi casi l’obiettivo è quello di minimizzare consumi ed emissioni inquinanti. Normalmente non viene posta particolare attenzione agli effetti che l’aggiunta delle macchine elettriche e dei componenti necessari per il funzionamento delle stesse hanno sulla dinamica del veicolo. Il presente lavoro di tesi è incentrato su questi aspetti: si è considerata la tipologia di veicoli ibridi termici-elettrici di tipo parallelo andando ad analizzare come cambiasse il comportamento dinamico del veicolo in funzione del tipo di installazione considerato per la parte elettrica del powertrain. In primo luogo è stato quindi necessario costruire ed implementare un modello dinamico di veicolo che permettesse di applicare coppie alle quattro ruote in maniera indipendente per considerare diverse tipologie di powertrain. In seguito si sono analizzate le differenze di comportamento dinamico fra il veicolo considerato e l’equivalente versione ibrida e i possibili utilizzi delle macchine elettriche per correggere eventuali deterioramenti o cambiamenti indesiderati nelle prestazioni del veicolo.

Stress abiotici e trattamenti ultra-diluiti: effetti fisiologici e molecolari sulla crescita in vitro di frumento

Gli stress abiotici determinando modificazioni a livello fisiologico, biochimico e molecolare delle piante, costituiscono una delle principali limitazioni per la produzione agricola mondiale. Nel 2007 la FAO ha stimato come solamente il 3,5% della superficie mondiale non sia sottoposta a stress abiotici. Il modello agro-industriale degli ultimi cinquant'anni, oltre ad avere contribuito allo sviluppo economico dell'Europa, è stato anche causa di inquinamento di acqua, aria e suolo, mediante uno sfruttamento indiscriminato delle risorse naturali. L'arsenico in particolare, naturalmente presente nell'ambiente e rilasciato dalle attività antropiche, desta particolare preoccupazione a causa dell'ampia distribuzione come contaminante ambientale e per gli effetti di fitotossicità provocati. In tale contesto, la diffusione di sistemi agricoli a basso impatto rappresenta una importante risorsa per rispondere all'emergenza del cambiamento climatico che negli anni a venire sottoporrà una superficie agricola sempre maggiore a stress di natura abiotica. Nello studio condotto è stato utilizzato uno stabile modello di crescita in vitro per valutare l'efficacia di preparati ultra diluiti (PUD), che non contenendo molecole chimiche di sintesi ben si adattano a sistemi agricoli sostenibili, su semi di frumento preventivamente sottoposti a stress sub-letale da arsenico. Sono state quindi condotte valutazioni sia a livello morfometrico (germinazione, lunghezza di germogli e radici) che molecolare (espressione genica valutata mediante analisi microarray, con validazione tramite Real-Time PCR) arricchendo la letteratura esistente di interessanti risultati. In particolare è stato osservato come lo stress da arsenico, determini una minore vigoria di coleptile e radici e a livello molecolare induca l'attivazione di pathways metabolici per proteggere e difendere le cellule vegetali dai danni derivanti dallo stress; mentre il PUD in esame (As 45x), nel sistema stressato ha indotto un recupero nella vigoria di germoglio e radici e livelli di espressione genica simili a quelli riscontrati nel controllo suggerendo un effetto "riequilibrante" del metabolismo vegetale.

Applicazione ed integrazione di metodi di prospezione geofisica: studio idrogeofisico della Zona Insatura in condizioni idriche controllate

Il lavoro è incentrato sull’applicazione ed integrazione di differenti tecniche di indagine geofisica in campo ambientale e ingegneristico/archeologico. Alcuni esempi sono stati descritti al fine di dimostrare l’utilità delle metodologie geofisiche nella risoluzione di svariate problematiche. Nello specifico l’attenzione è stata rivolta all’utilizzo delle tecniche del Ground Penetrating Radar e del Time Domain Reflectometry in misure condotte su un corpo sabbioso simulante una Zona Insatura. L’esperimento è stato realizzato all’interno di un’area test costruita presso l’azienda agricola dell’Università La Tuscia di Viterbo. Hanno partecipato al progetto le Università di Roma Tre, Roma La Sapienza, La Tuscia, con il supporto tecnico della Sensore&Software. Nello studio è stato condotto un approccio definito idrogeofisico al fine di ottenere informazioni da misure dei parametri fisici relativi alla Zona Insatura simulata nell’area test. Il confronto e l’integrazione delle due differenti tecniche di indagine ha offerto la possibilità di estendere la profondità di indagine all’interno del corpo sabbioso e di verificare l’utilità della tecnica GPR nello studio degli effetti legati alle variazioni del contenuto d’acqua nel suolo, oltre a determinare la posizione della superficie piezometrica per i differenti scenari di saturazione. Uno specifico studio è stato realizzato sul segnale radar al fine di stabilire i fattori di influenza sulla sua propagazione all’interno del suolo. Il comportamento dei parametri dielettrici nelle condizioni di drenaggio e di imbibizione del corpo sabbioso è stato riprodotto attraverso una modellizzazione delle proprietà dielettriche ed idrologiche sulla base della dimensione, forma e distribuzione dei granuli di roccia e pori, nonché sulla base della storia relativa alla distribuzione dei fluidi di saturazione all’interno del mezzo. La modellizzazione è stata operata sulle basi concettuali del Differential Effective Medium Approximation.

3-D reconstruction of the human skeleton during motion

L’analisi del movimento umano ha come obiettivo la descrizione del movimento assoluto e relativo dei segmenti ossei del soggetto e, ove richiesto, dei relativi tessuti molli durante l’esecuzione di esercizi fisici. La bioingegneria mette a disposizione dell’analisi del movimento gli strumenti ed i metodi necessari per una valutazione quantitativa di efficacia, funzione e/o qualità del movimento umano, consentendo al clinico l’analisi di aspetti non individuabili con gli esami tradizionali. Tali valutazioni possono essere di ausilio all’analisi clinica di pazienti e, specialmente con riferimento a problemi ortopedici, richiedono una elevata accuratezza e precisione perché il loro uso sia valido. Il miglioramento della affidabilità dell’analisi del movimento ha quindi un impatto positivo sia sulla metodologia utilizzata, sia sulle ricadute cliniche della stessa. Per perseguire gli obiettivi scientifici descritti, è necessario effettuare una stima precisa ed accurata della posizione e orientamento nello spazio dei segmenti ossei in esame durante l’esecuzione di un qualsiasi atto motorio. Tale descrizione può essere ottenuta mediante la definizione di un modello della porzione del corpo sotto analisi e la misura di due tipi di informazione: una relativa al movimento ed una alla morfologia. L’obiettivo è quindi stimare il vettore posizione e la matrice di orientamento necessari a descrivere la collocazione nello spazio virtuale 3D di un osso utilizzando le posizioni di punti, definiti sulla superficie cutanea ottenute attraverso la stereofotogrammetria. Le traiettorie dei marker, così ottenute, vengono utilizzate per la ricostruzione della posizione e dell’orientamento istantaneo di un sistema di assi solidale con il segmento sotto esame (sistema tecnico) (Cappozzo et al. 2005). Tali traiettorie e conseguentemente i sistemi tecnici, sono affetti da due tipi di errore, uno associato allo strumento di misura e l’altro associato alla presenza di tessuti molli interposti tra osso e cute. La propagazione di quest’ultimo ai risultati finali è molto più distruttiva rispetto a quella dell’errore strumentale che è facilmente minimizzabile attraverso semplici tecniche di filtraggio (Chiari et al. 2005). In letteratura è stato evidenziato che l’errore dovuto alla deformabilità dei tessuti molli durante l’analisi del movimento umano provoca inaccuratezze tali da mettere a rischio l’utilizzabilità dei risultati. A tal proposito Andriacchi scrive: “attualmente, uno dei fattori critici che rallentano il progresso negli studi del movimento umano è la misura del movimento scheletrico partendo dai marcatori posti sulla cute” (Andriacchi et al. 2000). Relativamente alla morfologia, essa può essere acquisita, ad esempio, attraverso l’utilizzazione di tecniche per bioimmagini. Queste vengono fornite con riferimento a sistemi di assi locali in generale diversi dai sistemi tecnici. Per integrare i dati relativi al movimento con i dati morfologici occorre determinare l’operatore che consente la trasformazione tra questi due sistemi di assi (matrice di registrazione) e di conseguenza è fondamentale l’individuazione di particolari terne di riferimento, dette terne anatomiche. L’identificazione di queste terne richiede la localizzazione sul segmento osseo di particolari punti notevoli, detti repere anatomici, rispetto ad un sistema di riferimento solidale con l’osso sotto esame. Tale operazione prende il nome di calibrazione anatomica. Nella maggior parte dei laboratori di analisi del movimento viene implementata una calibrazione anatomica a “bassa risoluzione” che prevede la descrizione della morfologia dell’osso a partire dall’informazione relativa alla posizione di alcuni repere corrispondenti a prominenze ossee individuabili tramite palpazione. Attraverso la stereofotogrammetria è quindi possibile registrare la posizione di questi repere rispetto ad un sistema tecnico. Un diverso approccio di calibrazione anatomica può essere realizzato avvalendosi delle tecniche ad “alta risoluzione”, ovvero attraverso l’uso di bioimmagini. In questo caso è necessario disporre di una rappresentazione digitale dell’osso in un sistema di riferimento morfologico e localizzare i repere d’interesse attraverso palpazione in ambiente virtuale (Benedetti et al. 1994 ; Van Sint Jan et al. 2002; Van Sint Jan et al. 2003). Un simile approccio è difficilmente applicabile nella maggior parte dei laboratori di analisi del movimento, in quanto normalmente non si dispone della strumentazione necessaria per ottenere le bioimmagini; inoltre è noto che tale strumentazione in alcuni casi può essere invasiva. Per entrambe le calibrazioni anatomiche rimane da tenere in considerazione che, generalmente, i repere anatomici sono dei punti definiti arbitrariamente all’interno di un’area più vasta e irregolare che i manuali di anatomia definiscono essere il repere anatomico. L’identificazione dei repere attraverso una loro descrizione verbale è quindi povera in precisione e la difficoltà nella loro identificazione tramite palpazione manuale, a causa della presenza dei tessuti molli interposti, genera errori sia in precisione che in accuratezza. Tali errori si propagano alla stima della cinematica e della dinamica articolare (Ramakrishnan et al. 1991; Della Croce et al. 1999). Della Croce (Della Croce et al. 1999) ha inoltre evidenziato che gli errori che influenzano la collocazione nello spazio delle terne anatomiche non dipendono soltanto dalla precisione con cui vengono identificati i repere anatomici, ma anche dalle regole che si utilizzano per definire le terne. E’ infine necessario evidenziare che la palpazione manuale richiede tempo e può essere effettuata esclusivamente da personale altamente specializzato, risultando quindi molto onerosa (Simon 2004). La presente tesi prende lo spunto dai problemi sopra elencati e ha come obiettivo quello di migliorare la qualità delle informazioni necessarie alla ricostruzione della cinematica 3D dei segmenti ossei in esame affrontando i problemi posti dall’artefatto di tessuto molle e le limitazioni intrinseche nelle attuali procedure di calibrazione anatomica. I problemi sono stati affrontati sia mediante procedure di elaborazione dei dati, sia apportando modifiche ai protocolli sperimentali che consentano di conseguire tale obiettivo. Per quanto riguarda l’artefatto da tessuto molle, si è affrontato l’obiettivo di sviluppare un metodo di stima che fosse specifico per il soggetto e per l’atto motorio in esame e, conseguentemente, di elaborare un metodo che ne consentisse la minimizzazione. Il metodo di stima è non invasivo, non impone restrizione al movimento dei tessuti molli, utilizza la sola misura stereofotogrammetrica ed è basato sul principio della media correlata. Le prestazioni del metodo sono state valutate su dati ottenuti mediante una misura 3D stereofotogrammetrica e fluoroscopica sincrona (Stagni et al. 2005), (Stagni et al. 2005). La coerenza dei risultati raggiunti attraverso i due differenti metodi permette di considerare ragionevoli le stime dell’artefatto ottenute con il nuovo metodo. Tale metodo fornisce informazioni sull’artefatto di pelle in differenti porzioni della coscia del soggetto e durante diversi compiti motori, può quindi essere utilizzato come base per un piazzamento ottimo dei marcatori. Lo si è quindi utilizzato come punto di partenza per elaborare un metodo di compensazione dell’errore dovuto all’artefatto di pelle che lo modella come combinazione lineare degli angoli articolari di anca e ginocchio. Il metodo di compensazione è stato validato attraverso una procedura di simulazione sviluppata ad-hoc. Relativamente alla calibrazione anatomica si è ritenuto prioritario affrontare il problema associato all’identificazione dei repere anatomici perseguendo i seguenti obiettivi: 1. migliorare la precisione nell’identificazione dei repere e, di conseguenza, la ripetibilità dell’identificazione delle terne anatomiche e della cinematica articolare, 2. diminuire il tempo richiesto, 3. permettere che la procedura di identificazione possa essere eseguita anche da personale non specializzato. Il perseguimento di tali obiettivi ha portato alla implementazione dei seguenti metodi: • Inizialmente è stata sviluppata una procedura di palpazione virtuale automatica. Dato un osso digitale, la procedura identifica automaticamente i punti di repere più significativi, nella maniera più precisa possibile e senza l'ausilio di un operatore esperto, sulla base delle informazioni ricavabili da un osso digitale di riferimento (template), preliminarmente palpato manualmente. • E’ stato poi condotto uno studio volto ad indagare i fattori metodologici che influenzano le prestazioni del metodo funzionale nell’individuazione del centro articolare d’anca, come prerequisito fondamentale per migliorare la procedura di calibrazione anatomica. A tale scopo sono stati confrontati diversi algoritmi, diversi cluster di marcatori ed è stata valutata la prestazione del metodo in presenza di compensazione dell’artefatto di pelle. • E’stato infine proposto un metodo alternativo di calibrazione anatomica basato sull’individuazione di un insieme di punti non etichettati, giacenti sulla superficie dell’osso e ricostruiti rispetto ad un TF (UP-CAST). A partire dalla posizione di questi punti, misurati su pelvi coscia e gamba, la morfologia del relativo segmento osseo è stata stimata senza identificare i repere, bensì effettuando un’operazione di matching dei punti misurati con un modello digitale dell’osso in esame. La procedura di individuazione dei punti è stata eseguita da personale non specializzato nell’individuazione dei repere anatomici. Ai soggetti in esame è stato richiesto di effettuare dei cicli di cammino in modo tale da poter indagare gli effetti della nuova procedura di calibrazione anatomica sulla determinazione della cinematica articolare. I risultati ottenuti hanno mostrato, per quel che riguarda la identificazione dei repere, che il metodo proposto migliora sia la precisione inter- che intraoperatore, rispetto alla palpazione convenzionale (Della Croce et al. 1999). E’ stato inoltre riscontrato un notevole miglioramento, rispetto ad altri protocolli (Charlton et al. 2004; Schwartz et al. 2004), nella ripetibilità della cinematica 3D di anca e ginocchio. Bisogna inoltre evidenziare che il protocollo è stato applicato da operatori non specializzati nell’identificazione dei repere anatomici. Grazie a questo miglioramento, la presenza di diversi operatori nel laboratorio non genera una riduzione di ripetibilità. Infine, il tempo richiesto per la procedura è drasticamente diminuito. Per una analisi che include la pelvi e i due arti inferiori, ad esempio, l’identificazione dei 16 repere caratteristici usando la calibrazione convenzionale richiede circa 15 minuti, mentre col nuovo metodo tra i 5 e i 10 minuti.

Dinamica sedimentaria torbiditica in bacini confinati: margine orientale della Sardegna

La sedimentazione clastica di mare profondo è attualmente uno dei principali argomenti della ricerca sedimentologica sia in ambito puramente accademico che in ambito petrolifero-industriale. Gli studi recenti hanno enfatizzato l'influenza fondamentale della topografia preesistente del fondo marino sulla crescita e la morfologia sui fan di mare profondo; si è visto come, in molti systemi torbiditici, l’evoluzione dei processi deposizionali sia stata da moderatamente a fortemente controllata dall’ effetto di confinamento di scarpate tettoniche, ridge strutturali e seamounts. Scopo di questo lavoro è studiare l'effetto del confinamento alla scala di bacino sui principali sistemi torbiditici del margine orientale della Sardegna che rappresenta un margine passivo articolato di bacini di intraslope confinati verso mare da seamounts. Lo studio dei sistemi deposizionali è stato eseguito attraverso l'interpretazione di dati di batimetria multibeam ad alto dettaglio acquisiti dall’ISMAR di Bologna durante la crociera Tir99. L’ interpretazione multibeam è stata integrata con l’ analisi di profili sismici a riflessione per comprendere la morfologia l’organizzazione interna e l’evoluzione nel tempo dei principali elementi deposizionali dei sistemi torbiditici. Tre bacini di intraslope (Olbia, Baronie e il settore settentrionale del bacino Ogliastra) sono stati investigati. Il bacino di Olbia è il bacino più settentrionale del margine orientale della Sardegna ed è limitato verso mare dai seamount Etruschi e Baronie. Il principale sistema torbiditico del bacino di Olbia è costituito dal Caprera, articolato in un sistema di canyon alimentatori nella piattaforma e nella scarpata continentale e da un ampio canale con argini alla base della scarpata. Il Caprera è fiancheggiato da un ampia piattaforma continentale, e questa, fungendo da “magazzino” per il materiale piu grossolando, può spiegare la peculiare architettura sedimentaria del suo fan. L'effetto di confinamento del bacino sulla forma e sull'evoluzione del fan del Caprera è evidente soprattutto sull'asimmetria dei leve e su fenomeni di avulsione che hanno coinvolto il canale. Il bacino di intraslope di Olbia appare completamente riempito, e, nel bordo orientale, è presente il canyon di intrabacino verso il bacino sottostante. Gli effetti dell'abbassamento del livello di base sono visibili nel settore distale del sistema, dove si ha lo sviluppo di canali distributari e di valli erosive a basso rilievo, che rappresentano le porzioni "upslope" dei canyon di "bypass". Il bacino di intraslope del Baronie è il bacino centrale del margine, confinato verso mare dal seamount delle Baronie, e presenta una via di fuga laterale rappresentato dal sistema di canyon di Gonone-Orosei. Il Posada è il sistema torbiditico principale, consiste di un canyon profondamente inciso nella piattaforma e nella scarpata, e sviluppa alla base della scarpata un piccolo fa radiale. La morfologia del è il risultato dell'interazione complessa tra la geoemtria del bacino ricevente ed il comportamento dei flussi sedimentari. La forma del bacino ha costretto il sistema torbiditico a cambiare la direzione di sviluppo, da est verso sud. Processi di framanento in massa a grande scala hanno inoltre contribuito alla riorganizzazione del sistema torbiditico. Il bacino dell’Ogliastra è localizzato nel settore meridionale del margine, limitato verso mare dal seamount Quirra. Il settore settentrionale della scarpata continentale del bacino Ogliastra è caratterizzato da canyon e incisioni di carattere ibrido, con tratti deposizionali ed erosivi. L'Arbatax è il principale sistema torbiditico del bacino di Ogliastra caratterizzato da un settore meridionale dominato da un canale alimentatore e da un settore settentrionale abbandonato, caratterizzato da fenomeni di smantellamento e instabilità gravitativa. In generale i risultati dello studio evidenziano l'importanza della combinazione dei fattori di controllo esterni, e della topografia preesistente, nello sviluppo dei processi sedimentari e degli elementi deposizionali dei sistemi torbiditici. In particolare, appare evidente come lo stile deposizionale dei sistemi torbiditici in ambiente confinato diverga sostanzialmente da quello previsto dai modelli di fan sottomarini usati come strumenti predittivi nella esplorazione e sfruttamento dei giacimenti di idrocarburi.

The photosynthetic bacterial reaction center in native and artificial envirnoments: effects on light-induced electron transfer

In this thesis we focussed on the characterization of the reaction center (RC) protein purified from the photosynthetic bacterium Rhodobacter sphaeroides. In particular, we discussed the effects of native and artificial environment on the light-induced electron transfer processes. The native environment consist of the inner antenna LH1 complex that copurifies with the RC forming the so called core complex, and the lipid phase tightly associated with it. In parallel, we analyzed the role of saccharidic glassy matrices on the interplay between electron transfer processes and internal protein dynamics. As a different artificial matrix, we incorporated the RC protein in a layer-by-layer structure with a twofold aim: to check the behaviour of the protein in such an unusual environment and to test the response of the system to herbicides. By examining the RC in its native environment, we found that the light-induced charge separated state P+QB - is markedly stabilized (by about 40 meV) in the core complex as compared to the RC-only system over a physiological pH range. We also verified that, as compared to the average composition of the membrane, the core complex copurifies with a tightly bound lipid complement of about 90 phospholipid molecules per RC, which is strongly enriched in cardiolipin. In parallel, a large ubiquinone pool was found in association with the core complex, giving rise to a quinone concentration about ten times larger than the average one in the membrane. Moreover, this quinone pool is fully functional, i.e. it is promptly available at the QB site during multiple turnover excitation of the RC. The latter two observations suggest important heterogeneities and anisotropies in the native membranes which can in principle account for the stabilization of the charge separated state in the core complex. The thermodynamic and kinetic parameters obtained in the RC-LH1 complex are very close to those measured in intact membranes, indicating that the electron transfer properties of the RC in vivo are essentially determined by its local environment. The studies performed by incorporating the RC into saccharidic matrices evidenced the relevance of solvent-protein interactions and dynamical coupling in determining the kinetics of electron transfer processes. The usual approach when studying the interplay between internal motions and protein function consists in freezing the degrees of freedom of the protein at cryogenic temperature. We proved that the “trehalose approach” offers distinct advantages with respect to this traditional methodology. We showed, in fact, that the RC conformational dynamics, coupled to specific electron transfer processes, can be modulated by varying the hydration level of the trehalose matrix at room temperature, thus allowing to disentangle solvent from temperature effects. The comparison between different saccharidic matrices has revealed that the structural and dynamical protein-matrix coupling depends strongly upon the sugar. The analyses performed in RCs embedded in polyelectrolyte multilayers (PEM) structures have shown that the electron transfer from QA - to QB, a conformationally gated process extremely sensitive to the RC environment, can be strongly modulated by the hydration level of the matrix, confirming analogous results obtained for this electron transfer reaction in sugar matrices. We found that PEM-RCs are a very stable system, particularly suitable to study the thermodynamics and kinetics of herbicide binding to the QB site. These features make PEM-RC structures quite promising in the development of herbicide biosensors. The studies discussed in the present thesis have shown that, although the effects on electron transfer induced by the native and artificial environments tested are markedly different, they can be described on the basis of a common kinetic model which takes into account the static conformational heterogeneity of the RC and the interconversion between conformational substates. Interestingly, the same distribution of rate constants (i.e. a Gamma distribution function) can describe charge recombination processes in solutions of purified RC, in RC-LH1 complexes, in wet and dry RC-PEM structures and in glassy saccharidic matrices over a wide range of hydration levels. In conclusion, the results obtained for RCs in different physico-chemical environments emphasize the relevance of the structure/dynamics solvent/protein coupling in determining the energetics and the kinetics of electron transfer processes in a membrane protein complex.

Caratterizzazione mediante HPLC-MS di modifiche post-trasduzionali di proteine istoniche

Gli istoni sono proteine basiche che possono essere classificate in varie classi: H1, H2A, H2B, H3 e H4. Queste proteine formano l’ottamero proteico attorno al quale si avvolge il DNA per formare il nucleosoma che è l’unità fondamentale della cromatina. A livello delle code N-terminali, gli istoni possono essere soggetti a numerose modifiche posttraduzionali quali acetilazioni, metilazioni, fosforilazioni, ADP-ribosilazioni e ubiquitinazioni. Queste modifiche portano alla formazione di diversi siti di riconoscimento per diversi complessi enzimatici coinvolti in importanti processi come la riparazione e la replicazione del DNA e l’assemblaggio della cromatina. La più importante e la più studiata di queste modifiche è l’acetilazione che avviene a livello dei residui amminici della catena laterale dell’amminoacido lisina. I livelli corretti di acetilazione delle proteine istoniche sono mantenuti dall’attività combinata di due enzimi: istone acetil transferasi (HAT) e istone deacetilasi (HDAC). Gli enzimi appartenenti a questa famiglia possono essere suddivisi in varie classi a seconda delle loro diverse caratteristiche, quali la localizzazione cellulare, la dimensione, l’omologia strutturale e il meccanismo d’azione. Recentemente è stato osservato che livelli aberranti di HDAC sono coinvolti nella carcinogenesi; per questo motivo numerosi gruppi di ricerca sono interessati alla progettazione e alla sintesi di composti che siano in grado di inibire questa classe enzimatica. L’inibizione delle HDAC può infatti provocare arresto della crescita cellulare, apoptosi o morte cellulare. Per questo motivo la ricerca farmaceutica in campo antitumorale è mirata alla sintesi di inibitori selettivi verso le diverse classi di HDAC per sviluppare farmaci meno tossici e per cercare di comprendere con maggiore chiarezza il ruolo biologico di questi enzimi. Il potenziale antitumorale degli inibitori delle HDAC deriva infatti dalla loro capacità di interferire con diversi processi cellulari, generalmente non più controllati nelle cellule neoplastiche. Nella maggior parte dei casi l’attività antitumorale risiede nella capacità di attivare programmi di differenziamento, di inibire la progressione del ciclo cellulare e di indurre apoptosi. Inoltre sembra essere molto importante anche la capacità di attivare la risposta immunitaria e l’inibizione dell’angiogenesi. Gli inibitori delle HDAC possono essere a loro volta classificati in base alla struttura chimica, alla loro origine (naturale o sintetica), e alla loro capacità di inibire selettivamente le HDAC appartenenti a classi diverse. Non è ancora chiaro se la selettività di queste molecole verso una specifica classe di HDAC sia importante per ottenere un effetto antitumorale, ma sicuramente inibitori selettivi possono essere molto utili per investigare e chiarire il ruolo delle HDAC nei processi cellulari che portano all’insorgenza del tumore. Nel primo capitolo di questa tesi quindi è riportata un’introduzione sull’importanza delle proteine istoniche non solo da un punto di vista strutturale ma anche funzionale per il destino cellulare. Nel secondo capitolo è riportato lo stato dell’arte dell’analisi delle proteine istoniche che comprende sia i metodi tradizionali come il microsequenziamento e l’utilizzo di anticorpi, sia metodi più innovativi (RP-LC, HILIC, HPCE) ideati per poter essere accoppiati ad analisi mediante spettrometria di massa. Questa tecnica consente infatti di ottenere importanti e precise informazioni che possono aiutare sia a identificare gli istoni come proteine che a individuare i siti coinvolti nelle modifiche post-traduzionali. Nel capitolo 3 è riportata la prima parte del lavoro sperimentale di questa tesi volto alla caratterizzazione delle proteine istoniche mediante tecniche cromatografiche accoppiate alla spettrometria di massa. Nella prima fase del lavoro è stato messo a punto un nuovo metodo cromatografico HPLC che ha consentito di ottenere una buona separazione, alla linea di base, delle otto classi istoniche (H1-1, H1-2, H2A-1, H2A-2, H2B, H3-1, H3-2 e H4). La separazione HPLC delle proteine istoniche ha permesso di poter eseguire analisi accurate di spettrometria di massa mediante accoppiamento con un analizzatore a trappola ionica tramite la sorgente electrospray (ESI). E’ stato così possibile identificare e quantificare tutte le isoforme istoniche, che differiscono per il tipo e il numero di modifiche post-traduzionali alle quali sono soggette, previa estrazione da colture cellulari di HT29 (cancro del colon). Un’analisi così dettagliata delle isoforme non può essere ottenuta con i metodi immunologici e permette di eseguire un’indagine molto accurata delle modifiche delle proteine istoniche correlandole ai diversi stadi della progressione del ciclo e alla morte cellulare. Il metodo messo a punto è stato convalidato mediante analisi comparative che prevedono la stessa separazione cromatografica ma accoppiata a uno spettrometro di massa avente sorgente ESI e analizzatore Q-TOF, dotato di maggiore sensibilità e risoluzione. Successivamente, per identificare quali sono gli specifici amminoacidi coinvolti nelle diverse modifiche post-traduzionali, l’istone H4 è stato sottoposto a digestione enzimatica e successiva analisi mediante tecniche MALDI-TOF e LC-ESI-MSMS. Queste analisi hanno permesso di identificare le specifiche lisine acetilate della coda N-terminale e la sequenza temporale di acetilazione delle lisine stesse. Nel quarto capitolo sono invece riportati gli studi di inibizione, mirati a caratterizzare le modifiche a carico delle proteine istoniche indotte da inibitori delle HDAC, dotati di diverso profilo di potenza e selettività. Dapprima Il metodo messo a punto per l’analisi delle proteine istoniche è stato applicato all’analisi di istoni estratti da cellule HT29 trattate con due noti inibitori delle HDAC, valproato e butirrato, somministrati alle cellule a dosi diverse, che corrispondono alle dosi con cui sono stati testati in vivo, per convalidare il metodo per studi di inibizione di composti incogniti. Successivamente, lo studio è proseguito con lo scopo di evidenziare effetti legati alla diversa potenza e selettività degli inibitori. Le cellule sono state trattate con due inibitori più potenti, SAHA e MS275, alla stessa concentrazione. In entrambi i casi il metodo messo a punto ha permesso di evidenziare l’aumento dei livelli di acetilazione indotto dal trattamento con gli inibitori; ha inoltre messo in luce differenti livelli di acetilazione. Ad esempio il SAHA, potente inibitore di tutte le classi di HDAC, ha prodotto un’estesa iperacetilazione di tutte le proteine istoniche, mentre MS275 selettivo per la classe I di HDAC, ha prodotto modifiche molto più blande. E’ stato quindi deciso di applicare questo metodo per studiare la dose e la tempo-dipendenza dell’effetto di quattro diversi inibitori delle HDAC (SAHA, MS275, MC1855 e MC1568) sulle modifiche post-traduzionali di istoni estratti da cellule HT29. Questi inibitori differiscono oltre che per la struttura chimica anche per il profilo di selettività nei confronti delle HDAC appartenenti alle diverse classi. Sono stati condotti quindi studi di dose-dipendenza che hanno consentito di ottenere i valori di IC50 (concentrazione capace di ridurre della metà la quantità relativa dell’istone meno acetilato) caratteristici per ogni inibitore nei confronti di tutte le classi istoniche. E’ stata inoltre calcolata la percentuale massima di inibizione per ogni inibitore. Infine sono stati eseguiti studi di tempo-dipendenza. I risultati ottenuti da questi studi hanno permesso di correlare i livelli di acetilazione delle varie classi istoniche con la selettività d’azione e la struttura chimica degli inibitori somministrati alle cellule. In particolare, SAHA e MC1855, inibitori delle HDAC di classi I e II a struttura idrossamica, hanno causato l’iperacetilazione di tutte le proteine istoniche, mentre MC1568 (inibitore selettivo per HDAC di classe II) ha prodotto l’iperacetilazione solo di H4. Inoltre la potenza e la selettività degli inibitori nel provocare un aumento dei livelli di acetilazione a livello delle distinte classi istoniche è stata correlata al destino biologico della cellula, tramite studi di vitalità cellulare. E’ stato osservato che il SAHA e MC1855, inibitori potenti e non selettivi, somministrati alla coltura HT29 a dose 50 μM producono morte cellulare, mentre MS275 alla stessa dose produce accumulo citostatico in G1/G0. MC1568, invece, non produce effetti significatici sul ciclo cellulare. Questo studio ha perciò dimostrato che l’analisi tramite HPLC-ESI-MS delle proteine istoniche permette di caratterizzare finemente la potenza e la selettività di nuovi composti inibitori delle HDAC, prevedendone l’effetto sul ciclo cellulare. In maggiore dettaglio è risultato che l’iperacetilazione di H4 non è in grado di provocare modifiche significative sul ciclo cellulare. Questo metodo, insieme alle analisi MALDI-TOF e LC-ESI-MSMS che permettono di individuare l’ordine di acetilazione delle lisine della coda N-terminale, potrà fornire importanti informazioni sugli inibitori delle HDAC e potrà essere applicato per delineare la potenza, la selettività e il meccanismo di azione di nuovi potenziali inibitori di questa classe enzimatica in colture cellulari tumorali.