Funzionalizzazione della mandibola dopo ricostruzione con lembo libero rivascolarizzato di fibula "single strut". Al di l�� del deficit di verticalit��.

Obiettivi: Valutare la modalit���� pi�� efficace per la riabilitazione funzionale del limbo libero di fibula "single strut", dopo ampie resezioni per patologia neoplastica maligna del cavo orale. Metodi: Da una casistica di 62 ricostruzioni microvascolari con limbo libero di fibula, 11 casi sono stati selezionati per essere riabilitati mediante protesi dentale a supporto implantare. 6 casi sono stati trattati senza ulteriori procedure chirurgiche ad eccezione dell'implantologia (gruppo 1), affrontando il deficit di verticalit���� della fibula attraverso la protesi dentaria, mentre i restanti casi sono stati trattati con la distrazione osteogenetica (DO) della fibula prima della riabilitazione protesica (gruppo 2). Il deficit di verticalit���� fibula/mandibola �� stato misurato. I criteri di valutazione utilizzati includono la misurazione clinica e radiografica del livello osseo e dei tessuti molli peri-implantari, ed il livello di soddisfazione del paziente attraverso un questionario appositamente redatto. Risultati: Tutte le riabilitazioni protesiche sono costituite da protesi dentali avvitate su impianti. L'et���� media �� di 52 anni, il rapporto uomini/donne �� di 6/5. Il numero medio di impianti inseriti nelle fibule �� di 5. Il periodo massimo di follow-up dopo il carico masticatorio �� stato di 30 mesi per il gruppo 1 e di 38.5 mesi (17-81) di media per il gruppo 2. Non abbiamo riportato complicazioni chirurgiche. Nessun impianto �� stato rimosso dai pazienti del gruppo 1, la perdita media di osso peri-implantare registrata �� stata di 1,5 mm. Nel gruppo 2 sono stati riportati un caso di tipping linguale del vettore di distrazione durante la fase di consolidazione e un caso di frattura della corticale basale in assenza di formazione di nuovo osso. L'incremento medio di osso in verticalit������ stato di 13,6 mm (12-15). 4 impianti su 32 (12.5%) sono andati persi dopo il periodo di follow-up. Il riassorbimento medio peri-implantare, �� stato di 2,5 mm. Conclusioni: Le soluzioni pi�� utilizzate per superare il deficit di verticalit���� del limbo libero di fibula consistono nell'allestimento del lembo libero di cresta iliaca, nel posizionare la fibula in posizione ideale da un punto di vista protesico a discapito del profilo osseo basale, l'utilizzo del lembo di fibula nella versione descritta come "double barrel", nella distrazione osteogenetica della fibula. La nostra esperienza concerne il lembo libero di fibula che nella patologia neoplastica maligna utilizziamo nella versione "single strut", per mantenere disponibili tutte le potenzialit���� di lunghezza del peduncolo vascolare, senza necessit���� di innesti di vena. Entrambe le soluzioni, la protesi dentale ortopedica e la distrazione osteogenetica seguita da protesi, entrambe avvitate su impianti, costituiscono soluzioni soddisfacenti per la riabilitazione funzionale della fibula al di l���� del suo deficit di verticalit����. La prima soluzione ha preso spunto dall'osservazione dei buoni risultati della protesi dentale su impianti corti, avendo un paragonabile rapporto corona/radice, la DO applicata alla fibula, sebbene sia risultata una metodica con un numero di complicazioni pi�� elevato ed un maggior livello di riassorbimento di osso peri-implantare, costituisce in ogni caso una valida opzione riabilitativa, specialmente in caso di notevole discrepanza mandibulo/fibulare. Decisiva �� la scelta del percorso terapeutico dopo una accurata valutazione di ogni singolo caso. Vengono illustrati i criteri di selezione provenienti dalla nostra esperienza.

La gestione dell'acqua come oggetto d'indagine per la ricostruzione delle dinamiche insediamentali e delle trasformazioni del territorio. Il caso di Samarcanda nella Media Valle dello Zeravshan (Uzbekistan)

The Project dealt with the development of settlement pattern and the irrigation system in Samarkand oasis. The main topic of the research is the dating of the Dargom canal, the main water supply of Samarkand in the ancient times as well as today. The Project provided a new hypothesis on the chronology of Dargom, dated back to the Early centuires of the Current Era, in relation with the different phases of the settlement patterns. The researches were carried out with several international teams and schoalrs belonging to several disciplines.

Funzioni della subunit�� �� e del dominio PHP della subunit�� �� nel core catalitico della DNA polimerasi III di Escherichia coli

Il core catalitico della DNA polimerasi III, composto dalle tre subunit�� ��, �� e ��, �� il complesso minimo responsabile della replicazione del DNA cromosomiale in Escherichia coli. Nell'oloenzima, �� ed �� possiedono rispettivamente un'attivit�� 5'-3' polimerasica ed un'attivit�� 3'-5' esonucleasica, mentre �� non ha funzioni enzimatiche. Il presente studio si �� concentrato sulle regioni del core che interagiscono direttamente con ��, ovvero �� (interagente all'estremit�� N-terminale di ��) e il dominio PHP di �� (interagente all'estremit�� C-terminale di ��), delle quali non �� stato sinora identificato il ruolo. Al fine di assegnare loro una funzione sono state seguite tre linee di ricerca parallele. Innanzitutto il ruolo di �� �� stato studiato utilizzando approcci ex-vivo ed in vivo. I risultati presentati in questo studio mostrano che �� incrementa significativamente la stabilit�� della subunit�� ��, intrinsecamente labile. Durante gli esperimenti condotti �� stata anche identificata una nuova forma dimerica di ��. Per quanto la funzione del dimero non sia definita, si �� dimostrato che esso �� attivamente dissociato da ��, che potrebbe quindi fungere da suo regolatore. Inoltre, �� stato ritrovato e caratterizzato il primo fenotipo di �� associato alla crescita. Per quanto concerne il dominio PHP, si �� dimostrato che esso possiede un'attivit�� pirofosfatasica utilizzando un nuovo saggio, progettato per seguire le cinetiche di reazione catalizzate da enzimi rilascianti fosfato o pirofosfato. L'idrolisi del pirofosfato catalizzata dal PHP �� stata dimostrata in grado di sostenere l'attivit�� polimerasica di �� in vitro, il che suggerisce il suo possibile ruolo in vivo durante la replicazione del DNA. Infine, �� stata messa a punto una nuova procedura per la coespressione e purificazione del complesso ��-��-��

Fra il nome e la storia. Trasformazioni del discorso politico e concetto di classe al principio della monarchia di Luglio (1831-1832)

La ricerca indaga tensioni e trasformazioni che investono le principali correnti di pensiero politico in Francia nei primi anni della monarchia di Luglio, e vi osserva l���emergere del concetto di classe. Assumendo la dimensione dell���avvenimento come punto di intersezione fra storia e teoria, l���elaborato si concentra sul periodo novembre 1831-giugno 1832 per analizzare il modo in cui, nell���ordine del discorso politico repubblicano, liberale e socialista, le vicende di questi mesi vengono interpretate cercando di dar nome alle figure sociali che esse fanno irrompere nel dibattito pubblico. Il titolo Fra il nome e la storia fa dunque riferimento allo sforzo di indagare il campo di tensione che si apre fra concreto divenire storico e grandi operazioni di nominazione che segnano l���affiorare di strutture concettuali della lunga durata. L���emergere della nozione di classe operaia e delle categorie che intorno a essa si organizzano viene interpretata come una ��formazione discorsiva�� che pone in questione significato e confini del politico. La frattura del 1848 �� assunta come orizzonte e margine esterno della ricerca nella misura in cui si ipotizza che essa segni una prima affermazione del regime di verit�� di tale formazione discorsiva: lo statuto politico del lavoro. L���elaborato consta di quattro capitoli. I primi tre indagano la riflessione sul politico e la funzione che in essa svolge il concetto di classe a partire dall���interpretazione di alcuni avvenimenti del tornante 1831-32 proposta nel discorso repubblicano del quotidiano ��Le National�� e della Soci��t�� des Amis du Peuple, in quello del liberalismo dottrinario di Fran��ois Guizot e in quello socialista nascente, prima del movimento sansimoniano, e poi muovendo fino al 1848 francese con l���analisi propostane da Karl Marx. Il quarto capitolo indaga infine la dimensione del ��sociale��, la sua elaborazione e articolazione attraverso il lavoro di studio e oggettivazione delle figure del mondo del lavoro.

Il principio di proporzionalit�� nella disciplina del mandato d'arresto europeo

Il presente lavoro affronta un tema di particolare attualit�� nella applicazione del mandato d���arresto europeo. Pensate per il contrasto alle forme pi�� gravi di criminalit��, le procedure di consegna hanno trovato sempre pi�� spesso applicazione per vicende criminose di scarsa offensivit��, determinando conseguenze gravi sui diritti fondamentali degli individui coinvolti e mettendo a rischio la reciproca fiducia tra gli Stati membri nello spazio di libert��, sicurezza e giustizia. Ci�� ha imposto alle istituzioni europee di richiamare gli Stati membri al rispetto del principio di proporzionalit��, quale principio generale del diritto europeo. Il presente studio analizza i presupposti e le modalit�� di applicazione di tale principio, alla luce del nuovo assetto impresso all���Unione dal Trattato di Lisbona e nella prospettiva dei diritti fondamentali. In particolare, esso si sofferma sul ruolo da attribuire, rispetto allo specifico tema, alla Carta dei diritti fondamentali dell���Unione ed all���art. 52 par. 1 in essa previsto, ove emerge la valenza costituzionale del principio di proporzionalit��.

Effetti sulle funzioni autonomiche e sugli stati di veglia e di sonno della manipolazione centrale farmacologica del sistema ipocretinergico nel ratto

Obiettivo della tesi �� stato quello di studiare il ruolo svolto dall���ipotalamo laterale (LH) nella regolazione dei processi di integrazione dell���attivit�� autonomica e termoregolatoria con quella degli stati di veglia e sonno. A questo scopo, l���attivit�� dell���LH �� stata inibita per 6 ore (Esperimento A) mediante microiniezioni locali dell���agonista GABAA muscimolo nel ratto libero di muoversi, nel quale sono stati monitorati in continuo l���elelttroencefalogramma, l���elettromiogramma nucale, la pressione arteriosa (PA) e la temperatura ipotalamica (Thy) e cutanea. Gli animali sono stati studiati a temperatura ambientale (Ta) di 24��C e 10��C. I risultati hanno mostrato che l���inibizione acuta dell���LH riduce l���attivit�� di veglia e sopprime la comparsa del sonno REM. Ci�� avviene attraverso l���induzione di uno stato di sonno NREM caratterizzato da ipersincronizzazione corticale, con scomparsa degli stati transizionali al sonno REM. Quando l���animale �� esposto a bassa Ta, tali alterazioni si associano a un ampio calo della Thy, che viene compensato da meccanismi vicarianti solo dopo un paio d���ore dall���iniezione. Sulla base di tali risultati, si �� proceduto ad un ulteriore studio (Esperimento B) volto ad indagare il ruolo del neuropeptide ipocretina (prodotto in modo esclusivo a livello dell���LH) nei processi termoregolatori, mediante microiniezioni del medesimo nel bulbo rostrale ventromediale (RVMM), stazione cruciale della rete nervosa preposta all���attivazione dei processi termogenetici. La somministrazione di ipocretina �� stata in grado di attivare la termogenesi e di potenziare la comparsa della veglia, con concomitante lieve incremento della PA e della frequenza cardiaca, quando effettuata alle Ta di 24��C o di 10��C, ma non alla Ta di 32��C. In conclusione, i risultati indicano che l���LH svolge un ruolo cruciale nella promozione degli stati di veglia e di sonno REM e, per tramite dell���ipocretina, interviene in modo coplesso a livello del RVMM nella regolazione dei processi di coordinamento dell'attivit�� di veglia con quella termoregolatoria.

Effetti dell���introduzione dei Principi contabili internazionali sul principio di derivazione del reddito d���impresa dal risultato di bilancio

Con il presente lavoro si �� tentato di verificare se le ragioni che hanno portato l���ordinamento italiano ad adottare il principio della derivazione del reddito d'impresa dal risultato contabile, possano essere considerate ancora attuali alla luce dell'introduzione dei principi IAS/IFRS nel nostro sistema contabile. In particolare, si �� cercato di esaminare se questo collegamento ai principi contabili internazionali, introdotto nel nostro ordinamento anche per la redazione dei bilanci d'esercizio, abbia comportato il venir meno della neutralit�� dell'imposizione fiscale tra le societ�� cd. Ias adopter e no Ias adopter. L'analisi di questa problematica �� stata condotta anche prendendo come riferimento le modalit�� di recepimento delle opzioni contenute nel Regolamento n. 1606/2002 da parte dei legislatori di alcuni Stati europei, e valutando se le conseguenze fiscali emergenti tra i vari ordinamenti possano creare possibili distorsioni alla concorrenza ed alle libert�� fondamentali dell���Unione europea.

Il principio di consensualita' e la tutela dell'interesse pubblico nel governo del territorio. Un'analisi comparata

La tesi di dottorato ha ad oggetto il principio di consensualit�� nell���agere amministrativo, inteso quale principio generale dell���ordinamento, che regola un���azione della Pubblica amministrazione di necessit�� funzionalizzata al perseguimento dell���interesse pubblico. E��� pertanto sull���oscillazione problematica tra un rapporto duale e dicotomico, che ricorre tra la dimensione bilaterale dell���uso di moduli negoziali pubblico-privati aventi ad oggetto l���esercizio del potere pubblico, e la prospettiva generale e collettiva che sottintende la cura dell���interesse pubblico, che si riflette nell���elaborato. Materia di studio prescelta ��, poi, il governo del territorio, settore dell���ordinamento ove pi�� diffusamente si concludono accordi amministrativi tra Pubblica amministrazione e privati. In particolare, l���analisi �� rivolta allo studio delle tanto nuove quanto problematiche fattispecie denominate accordi ���a monte��� delle prescrizioni urbanistiche, che rappresentano l���espressione pi�� alta, al momento, del principio di consensualit��. I problemi di ammissibilit�� giuridica posti da una parte della dottrina hanno richiesto una ricerca di un possibile fondamento positivo espresso per gli accordi ���a monte���, anche al fine di mettere al riparo le leggi regionali che li disciplinano, da eventuali dubbi di legittimit�� costituzionale. Tale ricerca �� stata condotta anche attraverso l���ausilio del diritto comparato. E��� cos��, stato possibile riscontrare anzitutto l���esistenza del principio di consensualit�� in un numero considerevole di Paesi, salve alcune eccezioni, alla cui analisi �� stato dedicato ampio spazio di trattazione (in particolare, la Francia). Per altro verso, le analoghe esperienze giuridiche provenienti da altri Stati europei (in particolare, la Spagna) sono state d���ausilio per la finale elaborazione di un possibile modello di procedimento per la conclusione degli accordi ���a monte���; mentre la constatazione di comuni giustificazioni dottrinali ha permesso l���elaborazione di una nuova possibile natura giuridica da riconoscere agli accordi in parola (accordi normativi) e la definizione di precise ricadute pratiche e giuridiche quanto al rapporto.

Valutazione delle funzioni cardio-respiratorie ed epatiche in pazienti con cuore univentricolare trattati con intervento di connessione cavo-polmonare totale

L'intervento di connessione cavo-polmonare totale (TCPC) nei pazienti portatori di cuore univentricolare, a causa della particolare condizione emodinamica, determina un risentimento a carico di numerosi parenchimi. Scopo della ricerca �� di valutare l'entit�� di questo danno ad un follow-up medio-lungo. Sono stati arruolati 115 pazienti, sottoposti ad intervento presso i centri di Cardiochirurgia Pediatrica di Bologna (52 pz) e Torino (63 pz). Il follow-up medio �� stato di 125��2 mesi. I pazienti sono stati sottoposti ad indagine emodinamica (88 pz), test cardiopolmonare (75 pz) e Fibroscan ed ecografia epatica (47 pz). La pressione polmonare media �� stata di 11.5��2.6mmHg, ed in 12 pazienti i valori di pressione polmonare erano superiori a 15mmHg. La pressione atriale media era di 6.7��2.3mmHg ed il calcolo delle resistenze vascolari polmonari indicizzate (RVP) era in media di 2��0.99 UW/m2. In 29 pazienti le RVP erano superiori a 2 UW/m2. La VO2 max in media era pari a 28��31 ml/Kg/min, 58��15 % del valore teorico. La frequenza cardiaca massima all'apice dello sforzo era di 151��22 bpm, pari al 74��17% del valore teorico. Il Fibroscan ha fornito un valore medio di 17.01 kPa (8-34.3kPa). Cinque pazienti erano in classe F2, 9 pazienti in classe F3 e 33 pazienti risultavano in classe F4. Nei pazienti con follow-up maggiore di 10 anni il valore di stiffness epatica (19.6��5.2kPa) �� risultato significativamente maggiore a quello dei pazienti con follow-up minore di 10 anni (15.1��5.8kPa, p<0.01). La frequenza cardiaca massima raggiunta durante lo sforzo del test cardiopolmonare �� risultata significativamente correlata alla morfologia del ventricolo unico, risultando del 67.8��14.4% del valore teorico nei pazienti portatori di ventricolo destro contro il 79.6��8.7% dei portatori di ventricolo sinistro (p=0.006). L'intervento di TCPC determina un risentimento a carico di numerosi parenchimi proporzionale alla lunghezza del follow-up, e necessita pertanto un costante monitoraggio clinico-strumentale multidisciplinare.

Gli effetti della terapia di resincronizzazione cardiaca in pazienti con fibrillazione atriale permanente sulla sopravvivenza a lungo-termine: l'importanza dell'ablazione del nodo atrio-ventricolare

La terapia di resincronizzazione cardiaca (TRC) �� un presidio non farmacologico che riduce la mortalit�� e la morbosit�� nei pazienti con scompenso refrattario alla terapia medica. La maggior parte dei dati riguardanti gli effetti della TRC coinvolgono i pazienti con le indicazioni consolidate seguenti: classe NYHA III-IV, ritardo della conduzione ventricolare (QRS>opp= 20 msec), disfunzione sistolica ventricolare sinistra (frazione di eiezione ventricolare sinistra >opp= 35%) e ritmo sinusale (RS). Mentre �� noto che la fibrillazione atriale permanente (FA) sia presente in una porzione consistente dei pazienti con scompenso cardiaco, vi sono pochi dati riguardanti la sopravvivenza e gli effetti a lungo-termine della TRC in pazienti con scompenso cardiaco e fibrillazione atriale (FA); la maggior parte degli studi sono osservazionali ed hanno dimostrato che la TRC potrebbe conferire dei benefici a corto e medio termine anche in pazienti con FA permanente. Solo recentemente un ampio studio osservazionale ha descritto che, a lungo-termine, la TRC migliora significativamente la capacit�� funzionale, la frazione di eiezione e induce il rimodellamento inverso del ventricolo sinistro solamente in quei pazienti con FA dove la TRC viene combinata con l���ablazione del nodo atrio-ventricolare (NAV). La strategia ablativa del NAV infatti conferendo una stimolazione completa e costante, permette di eliminare gli effetti del ritmo spontaneo di FA (ritmo irregolare e tendenzialmente tachicardico) cheinterferisce in maniera importante con la stimolazione biventricolare in particolare durante gli sforzi fisici. Sulla base di queste premesse il presente studio si propone di valutare gli effetti a lungo-termine della TRC su pazienti con scompenso cardiaco e FA permanente focalizzando su due aspetti principali: 1) confrontando la sopravvivenza di pazienti con FA permanente rispetto ai pazienti in RS; 2) confrontando la sopravvivenza di pazienti in FA suddivisi secondo la modalit�� di controllo della frequenza con somministrazione di farmaci antiaritmici (gruppo FA-farm) oppure mediante controllo ablazione del NAV (gruppo FA-abl). Metodi e risultati: Sono presentati i dati di 1303 pazienti sottoposti consecutivamente ad impianto di dispositivo per la TRC e seguiti per un periodo mediano di 24 mesi. Diciotto pazienti sono stati persi durante il follow-up per cui la popolazione dello studio �� rappresentata da una popolazione totale di 1295 pazienti di cui 1042 in RS e 243 (19%) in FA permanente. Nei pazienti con FA il controllo della frequenza cardiaca �� stato effettuato mediante la somministrazione di farmaci anti-aritmici (gruppo FA-farm: 125 pazienti) oppure mediante ablazione del NAV (FA-abl: 118 pazienti). Rispetto ai pazienti in RS, i pazienti in FA permanente erano significativamente pi�� vecchi, pi�� spesso presentavano eziologia nonischemica, avevano una frazione di eiezione pi�� elevata al preimpianto, una durata del QRS minore e erano pi�� raramente trattati con un defibrillatore. Lungo un follow-up mediano di 24 mesi, 170/1042 pazienti in RS e 39/243 in FA sono deceduti (l���incidenza di mortalit�� a 1 anno era di 8,4% e 8,9%, rispettivamente). I rapporti di rischio derivanti dall���analisi multivariata con il 95% dell���intervallo di confidenza (HR, 95% CI) erano simili sia per la morte per tutte le cause che per la morte cardiaca (0.9 [0.57-1.42], p=0.64 e 1.00 [0.60-1.66] p=0.99, rispettivamente). Fra i pazienti con FA, il gruppo FA-abl presentava una durata media del QRS minore ed era meno frequentemente trattato con il defibrillatore impiantabile rispetto al gruppo FA-farm. Soli 11/118 pazienti del FA-abl sono deceduti rispetto a 28/125 nel gruppo FA-farm (mortalit�� cumulativa a 1 anno di 9,3% e 15,2% rispettivamente, p<0.001), con HR, 95% CI per FA-abl vs FA-farm di 0.15 [0.05-0.43],,p<0.001 per la mortalit�� per tutte le cause, di 0.18 [0.06-0.57], p=0.004 per la mortalit�� cardiaca, e di 0.09 [0.02-0.42], p<0.002 per la mortalit�� da scompenso cardiaco. Conclusioni: I pazienti con scompenso cardiaco e FA permanente trattati con la TRC presentano una simile sopravvivenza a lungo-termine di pazienti in RS. Nei pazienti in FA l���ablazione del NAV in aggiunta alla TRC migliora significativamente la sopravvivenza rispetto alla sola TRC; questo effetto �� ottenuto primariamente attraverso una riduzione della morte per scompenso cardiaco.

Effetti dell'acido urico sulle cellule glomerulari mesangiali: meccanismi intracellulari di trasduzione del segnale e possibili implicazioni nella progressione del danno renale e nella sindrome infiammatoria in corso di nefropatie croniche

Uric acid is a major inducer of inflammation in renal interstitium and may play a role in the progression of renal damage in hyperuricemic subjects with primary nephropathies, renal vascular disease, and essential hypertension. At the same time, UA also acts as a water-soluble scavenger of reactive oxygen species. We evaluated the cellular effects of UA on cultured HMC as a potential interstitial target for abnormally elevated levels in acute and chronic renal disease. Intracellular free Ca2+ ([Ca2+]i) was monitored by microfluorometry of fura 2-loaded cells, while oxidation of intracellularly trapped non-fluorescent 2��,7��-dichlorofluorescein diacetate (DCFHDA, 20 uM) was employed to assess the generation of reactive oxygen species during 12-hr incubations with various concentrations of UA or monosodium urate. Fluorescent metabolites of DCFH-DA in the culture media of HMC were detected at 485/530 nm excitation/emission wavelengths, respectively. UA dose-dependently lowered resting [Ca2+]i (from 102��9 nM to 95��3, 57��2, 48��6 nM at 1-100 uM UA, respectively, p <0.05), leaving responses to vasoconstrictors such as angiotensin II unaffected. The effect was not due to Ca2+/H+ exchange upon acidification of the bathing media, as acetate, glutamate, lactate and other organic acids rather increased [Ca2+]i (to max. levels of 497��42 nM with 0.1 mM acetate). The decrease of [Ca2+]i was abolished by raising extracellular Ca2+ and not due to effects on Ca2+ channels or activation of Ca2+-ATPases, since unaffected by thapsigargin. The process rather appeared sensitive to removal of extracellular Na+ in combination with blockers of Na+/Ca2+ exchange, such as 2���,4���-dichlorobenzamil, pointing to a countertransport mechanism. UA dose-dependently prompted the extracellular release of oxidised DCFH (control 37��2 relative fluorescence units (RFU)/ml, 0.1uM 47��2, 1 uM 48��2, 10 uM 51��4, 0.1 mM 53��4; positive control, 10 uM sodium nitroprusside 92��5 RFU/ml, p<0.01). In summary, UA interferes with Ca2+ transport in cultured HMC, triggering oxidative stress which may initiate a sequence of events leading to interstitial injury and possibly amplifying renal vascular damage and/or the progression of chronic disease.

Effetti del chitosano su composti polifenolici in colture cellulari di vite: aspetti molecolari e metabolici

Polyphenols, including flavonoids and stilbenes, are an essential part of human diet and constitute one of the most abundant and ubiquitous group of plant secondary metabolites. The level of these compounds is inducible by stress or fungal attack, so attempts are being made to identify likely biotic and abiotic elicitors and to better understand the underlying mechanism. Resveratrol (3,5,4���-trihydroxystilbene), which belongs to the stilbene family, is a naturally occurring polyphenol, found in several fruits, vegetables and beverages including red wine. It is one of the most important plant polyphenols with proved benefic activity on animal health. In the last two decades, the potential protective effects of resveratrol against cardiovascular and neurodegenerative diseases, as well as the chemopreventive properties against cancer, have been largely investigated. The most important source of polyphenols and in particular resveratrol for human diet is grape (Vitis vinifera). Since stilbenes and flavonoids play a very important role in plant defence responses and enviromental interactions, and their effects on human health seem promising, the aim of the research of this Thesis was to study at different levels the activation and the regulation of their biosynthetic pathways after chitosan treatment. Moreover, the polyphenol production in grape cells and the optimisation of cultural conditions bioreactor scale-up, were also investigated. Cell suspensions were obtained from cv. Barbera (Vitis vinifera L.) petioles and were treated with a biotic elicitor, chitosan (50 ��g/mL, dissolved in acetic acid) to promote phenylpropanoid metabolism. Chitosan is a D-glucosamine polymer from fungi cell wall and therefore mimes fungal pathogen attack. Liquid cultures have been monitored for 15 days, measuring cell number, cell viability, pH and grams of fresh weight. The endogenous and released amounts of 7 stilbenes (trans and cis isomers of resveratrol, piceid and resveratroloside, and piceatannol), gallic acid, 6 hydroxycinnamic acids (trans-cinnamic, p-coumaric, caffeic, ferulic, sinapic and chlorogenic acids), 5 catechines (catechin, epicatechin, epigallocatechin-gallate (EGCG), epigallocatechin and epicatechin-gallate) and other 5 flavonoids (chalcon, naringenin, kaempferol, quercetin and rutin) in cells and cultural medium, were measured by HPLC-DAD analysis and total anthocyanins were quantified by spectrophotometric analysis. Chitosan was effective in stimulating trans-resveratrol endogenous accumulation with a sharp peak at day 4 (exceeding acetic acid and water controls by 36% and 63%, respectively), while it did not influence the production of the cis-isomer. Compared to both water and acetic acid controls, chitosan decreased the release of both trans- and cis-resveratrol respect to controls. No effect was shown on the accumulation of single resveratrol mono-glucoside isomers, but considering their total amount, normalized for the relative water control, it was possible to evidence an increase in both accumulation and release of those compounds, in chitosan-treated cells, throughout the culture period and particularly during the second week. Many of the analysed flavonoids and hydroxycinnamic acids were not present or detectable in trace amounts. Catechin, epicatechin and epigallocatechin-gallate (EGCG) were detectable both inside the cells and in the culture media, but chitosan did not affect their amounts. On the contrary, total anthocyanins have been stimulated by chitosan and their level, from day 4 to 14, was about 2-fold higher than in both controls, confirming macroscopic observations that treated suspensions showed an intense brown-red color, from day 3 onwards. These elicitation results suggest that chitosan selectively up-regulates specific biosynthetic pathways, without modifying the general accumulation pattern of other flavonoids. Proteins have been extracted from cells at day 4 of culture (corresponding to the production peak of trans-resveratrol) and separated by bidimensional electrophoresis. The 73 proteins that showed a consistently changed amount between untreated, chitosan and acetic acid (chitosan solvent) treated cells, have been identified by mass spectrometry. Chitosan induced an increase in stilbene synthase (STS, the resveratrol biosynthetic enzyme), chalcone-flavanone isomerase (CHI, that switches the pathway from chalcones to flavones and anthocyanins), pathogenesis-related proteins 10 (PRs10, a large family of defence proteins), and a decrease in many proteins belonging to primary metabolisms. A train of six distinct spots of STS encoded by the same gene and increased by chitosan, was detected on the 2-D gels, and related to the different phosphorylation degree of STS spots. Northern blot analyses have been performed on RNA extracted from cells treated with chitosan and relative controls, using probes for STS, PAL (phenylalanine ammonia lyase, the first enzyme of the biosynthetic pathway), CHS (chalcone synthase, that shares with STS the same precursors), CHI and PR-10. The up-regulation of PAL, CHS and CHI transcript expression levels correlated with the accumulation of anthocyanins. The strong increase of different molecular weight PR-10 mRNAs, correlated with the 11 PR-10 protein spots identified in proteomic analyses. The sudden decrease in trans-resveratrol endogenous accumulation after day 4 of culture, could be simply explained by the diminished resveratrol biosynthetic activity due to the lower amount of biosynthetic enzymes. This might be indirectly demonstrated by northern blot expression analyses, that showed lower levels of phenylalanine ammonia lyase (PAL) and stilbene synthase (STS) mRNAs starting from day 4. Other possible explanations could be a resveratrol oxidation process and/or the formation of other different mono-, di-glucosides and resveratrol oligomers such as viniferins. Immunolocalisation experiments performed on grape protoplasts and the subsequent analyses by confocal microscope, showed that STS, and therefore the resveratrol synthetic site, is mostly associated to intracellular membranes close to the cytosolic side of plasma membrane and in a smaller amount is localized in the cytosol. STS seemed not to be present inside vacuole and nucleus. There were no differences in the STS intracellular localisation between the different treatments. Since it was shown that stilbenes are largely released in the culture medium and that STS is a soluble protein, a possible interaction of STS with a plasma membrane transporter responsible for the extrusion of stilbenes in the culture medium, might be hypothesized. Proteomic analyses performed on subcellular fractions identified in the microsomial fraction 5 proteins taking part in channel complexes or associated with channels, that significantly changed their amount after chitosan treatment. In soluble and membrane fractions respectively 3 and 4 STS and 6 and 3 PR-10 have been identified. Proteomic results obtained from subcellular fractions substantially confirmed previous result obtained from total cell protein extracts and added more information about protein localisation and co-localisation. The interesting results obtained on Barbera cell cultures with the aim to increase polyphenol (especially stilbenes) production, have encouraged scale up tests in 1 litre bioreactors. The first trial fermentation was performed in parallel with a normal time-course in 20 mL flasks, showing that the scale-up (bigger volume and different conditions) process influenced in a very relevant way stilbenes production. In order to optimise culture parameters such as medium sucrose amount, fermentation length and inoculum cell concentration, few other fermentations were performed. Chitosan treatments were also performed. The modification of each parameter brought relevant variations in stilbenes and catechins levels, so that the production of a certain compound (or class of compounds) could be hypothetically promoted by modulating one or more culture parameters. For example the catechin yield could be improved by increasing sucrose content and the time of fermentation. The best results in stilbene yield were obtained in a 800 mL fermentation inoculated with 10.8 grams of cells and supplemented with chitosan. The culture was fed with MS medium added with 30 g/L sucrose, 25 ��g/mL rifampicin and 50 ��g/mL of chitosan, and was maintained at 24��C, stirred by marine impeller at 100 rpm and supplied of air at 0.16 L/min rate. Resveratroloside was the stilbene present in the larger amount, 3-5 times more than resveratrol. Because resveratrol glucosides are similarly active and more stable than free resveratrol, their production using a bioreactor could be a great advantage in an hypothetical industrial process. In my bioreactor tests, stilbenes were mainly released in the culture medium (60-80% of the total) and this fact could be another advantage for industrial applications, because it allows recovering the products directly from the culture medium without stopping the fermentation and/or killing the cells. In my best cultural conditions, it was possible to obtain 3.95 mg/L of stilbenes at day 4 (maximum resveratrol accumulation) and 5.13 mg/L at day 14 (maximum resveratroloside production). In conclusion, chitosan effect in inducing Vitis vinifera defense mechanisms can be related to its ability to increase the intracellular content of a large spectrum of antioxidants, and in particular of resveratrol, its derivates and anthocyanins. Its effect can be observed at transcriptional, proteomic (variation of soluble and membrane protein amounts) and metabolic (polyphenols production) level. The chitosan ability to elicit specific plant matabolisms can be useful to produce large quantities of antioxidant compounds from cell culture in bioreactor.