Un approccio innovativo alla pianificazione della mobilità ciclabile

L’approccio innovativo di questa tesi alla pianificazione ciclabile consiste nell’integrare le linee guida per la redazione di un biciplan con aspetti, metodologie e strumenti nuovi, per rendere più efficace la programmazione di interventi. I limiti del biciplan risiedono nella fase di pianificazione e di monitoraggio, quindi, nel 1° capitolo, vengono esaminate le differenze esistenti tra la normativa americana (AASHTO) e quella italiana (D.P.R. 557/99). Nel 2° capitolo vengono analizzati gli indicatori usati nella fase di monitoraggio e la loro evoluzione fino alla definizione degli attuali indici per la determinazione del LOS delle infrastrutture ciclabili: BLOS e BCI. L’analisi è integrata con le nuove applicazioni di questi indici e con lo studio del LOS de HCM 2010. BCI e BISI sono stati applicati alla rete di Bologna per risolvere problemi di pianificazione e per capire se esistessero problemi di trasferibilità. Gli indici analizzati prendono in considerazione solo il lato offerta del sistema di trasporto ciclabile; manca un giudizio sui flussi, per verificare l’efficacia delle policy. Perciò il 3° capitolo è dedicato alla metodologia sul monitoraggio dei flussi, mediante l’utilizzo di comuni traffic counter per le rilevazioni dei flussi veicolari. Dal monitoraggio è possibile ricavare informazioni sul numero di passaggi, periodi di punta, esistenza di percorsi preferiti, influenza delle condizioni climatiche, utili ai progettisti; si possono creare serie storiche di dati per controllare l’evoluzione della mobilità ciclabile e determinare l’esistenza di criticità dell’infrastruttura. L’efficacia della pianificazione ciclabile è legata al grado di soddisfazione dell’utente e all’appetibilità delle infrastrutture, perciò il progettista deve conoscere degli elementi che influenzano le scelte del ciclista. Nel 4° capitolo sono analizzate le tecniche e gli studi sulle scelte dell’itinerario dei ciclisti, e lo studio pilota fatto a Bologna per definire le variabili che influenzano le scelte dei ciclisti e il loro peso.

Ruolo della fosfolipasi C-β1 nel differenziamento miogenico: identificazione di nuovi target nucleari

The expression of phospholipase C-β1 (PLC-β1) and cyclin D3 is highly induced during skeletal myoblast differentiation. We have previously shown that PLC-β1 activates cyclin D3 promoter during the differentiation of myoblasts to myotubes, indicating that PLC-β1 is a crucial regulator of mouse cyclin D3 gene. Here we report that PLC-β1 catalytic activity plays a role in the increase of cyclin D3 levels and in the induction of differentiation of C2C12 skeletal muscle cells. PLC-β1 mutational analysis revealed the importance of His331 and His378 for the catalytic activity. We show that following insulin administration, cyclin D3 mRNA levels are lower in cells overexpressing the PLC-β1 catalytically inactive form, as compared to wild type cells. We describe a novel signaling pathway elicited by PLC-β1 that modulates Activator Protein-1 (AP-1) activity. Indeed, gel mobility shift assays indicate that there is a c-jun binding site located in cyclin D3 promoter region specifically regulated by PLC-β1 and that c-jun binding activity is significantly increased by insulin stimulation and PLC-β1 overexpression. Moreover, mutation of c-jun/AP-1 binding site decreases the basal cyclin D3 promoter activity and eliminates its induction by insulin and PLC-β1 overexpression. Interestingly, we observed that the ectopic expression of the Inositol Polyphosphate Multikinase (IPMK) in C2C12 myoblasts enhances cyclin D3 gene expression and that the mutation of c-jun site in cyclin D3 promoter determines an impairment of IPMK-dependent promoter induction. These results indicate that PLC-β1 activates a c-jun/AP-1 target gene, i.e. cyclin D3, during myogenic differentiation through IPMK signaling.

Rapporto tra struttura e funzione della cistatina B e dei suoi mutanti in relazione all'epilessia mioclonica progressiva di tipo 1 (EPM1)

This work shows for the first time that native CSTB polymerizes on addition of Cu2+ and DnaK (Hsp70). Cysteines are involved in the polymerization process and in particular at least one cysteine is necessary. We propose that Cu2+ interacts with the thiol group of cysteine and oxidize it. The oxidized cysteine modifies the CSTB structure allowing interaction with DnaK/Hsp70 to occur. Thus, Cu2+ binding to CSTB exposes a site for DnaK and such interaction allows the polymerization of CSTB. The polymers generated from native CSTB monomers, are DTT sensitive and they may represent physiological polymers. Denatured CSTB does not require Cu2+ and polymerizes simply on addition of DnaK. The polymers generated from denatured CSTB do not respond to DTT. They have characteristics similar to those of the CSTB toxic aggregates described in vivo in eukaryotic cells following CSTB over-expression. Interaction between CSTB and Hsp70 is shown by IP experiments. The interaction occurs with WT CSTB and not with the cys mutant. This suggests that disulphur bonds are involved. Methal-cathalyzed oxidation of proteins involves reduction of the metal ion(s) bound to the protein itself and oxidation of neighboring ammino acid residues resulting in structural modification and de-stabilization of the molecule. In this work we propose that the cysteine thyol residue of CSTB in the presence of Cu2+ is oxidized, and cathalyzes the formation of disulphide bonds with Hsp70, that, once bound to CSTB, mediates its polymerization. In vivo this molecular mechanism of CSTB polymerization could be regulated by redox environment through the cysteine residue. This may imply that CSTB physiological polymers have a specific cellular function, different from that of the protease inhibitor known for the CSTB monomer. This hypothesis is interesting in relation to Progressive Myoclonus Epilepsy of type 1 (EPM1). This pathology is usually caused by mutations in the CSTB gene. CSTB is a ubiquitous protein, but EPM1 patients have problems only in the central nervous system. Maybe physiological CSTB polymers have a specific function altered in people affected by EPM1.

Studio di espressione e funzione della PLCβ1 nucleare in modelli murini ed umani di cellule ematopoietiche mieloidi e linfoidi

The aims of this work were to investigate the role of nuclear Phospholipase C beta 1 (PI-PLCβ1) in human and mouse cell lines and to identify new binding partners of nuclear PI-PLCβ1 to further understand the functional network in which the enzyme acts. The intracellular distribution of PI-PLCβ1 was further investigated in human leukaemia cell lines (NB4, HL60, THP1, CEM, Jurkat, K562). With the exception of HL60, a high endogenous level of PI-PLCβ1 was detected in purified nuclei in each of the cell lines. We found that also in Ba/F3 pro-B cells overexpressing PI-PLCβ1b the protein localize within the nucleus. Although our data demonstrated that PI-PLCβ1b was not involved in cell proliferation and IGF-1 response as shown in other cell lines (FELC and Swiss 3T3), there was an effect on apoptosis. Activation of early apoptotic markers caspase-3 and PARP was delayed in PI-PLCβ1b overexpressing Ba/F3 cells treated with 5 gr/ml mitomycin C for 24h. We performed an antibody-specific immunoprecipitation on nuclear lysates from FELC-PLCβ1b cells. Mass spectrometry analysis (nano-ESI-Q-TOF) of co-immunoprecipitated proteins allowed for identification of 92 potential nuclear PI-PLCβ1b interactors. Among these, several already documented PI-PLCβ1b interacting partners (Srp20, LaminB, EF1α2) were identified, further validating our data. All the identified proteins were nuclear, mostly localized within the nuclear speckles. This evidence is particularly relevant as PI-PLCβ1 is known to localize in the same domains. Many of the identified proteins are involved in cell cycle, proliferation and transcriptional control. In particular, many of the proteins are components of the spliceosome multi-complex, strengthening the idea that PI-PLCβ1b is involved in mRNA processing and maturation. Future work will aim to better characterize the regulatory role of PI-PLCβ1b in mRNA splicing.

Funzioni della subunità θ e del dominio PHP della subunità α nel core catalitico della DNA polimerasi III di Escherichia coli

Il core catalitico della DNA polimerasi III, composto dalle tre subunità α, ε e θ, è il complesso minimo responsabile della replicazione del DNA cromosomiale in Escherichia coli. Nell'oloenzima, α ed ε possiedono rispettivamente un'attività 5'-3' polimerasica ed un'attività 3'-5' esonucleasica, mentre θ non ha funzioni enzimatiche. Il presente studio si è concentrato sulle regioni del core che interagiscono direttamente con ε, ovvero θ (interagente all'estremità N-terminale di ε) e il dominio PHP di α (interagente all'estremità C-terminale di ε), delle quali non è stato sinora identificato il ruolo. Al fine di assegnare loro una funzione sono state seguite tre linee di ricerca parallele. Innanzitutto il ruolo di θ è stato studiato utilizzando approcci ex-vivo ed in vivo. I risultati presentati in questo studio mostrano che θ incrementa significativamente la stabilità della subunità ε, intrinsecamente labile. Durante gli esperimenti condotti è stata anche identificata una nuova forma dimerica di ε. Per quanto la funzione del dimero non sia definita, si è dimostrato che esso è attivamente dissociato da θ, che potrebbe quindi fungere da suo regolatore. Inoltre, è stato ritrovato e caratterizzato il primo fenotipo di θ associato alla crescita. Per quanto concerne il dominio PHP, si è dimostrato che esso possiede un'attività pirofosfatasica utilizzando un nuovo saggio, progettato per seguire le cinetiche di reazione catalizzate da enzimi rilascianti fosfato o pirofosfato. L'idrolisi del pirofosfato catalizzata dal PHP è stata dimostrata in grado di sostenere l'attività polimerasica di α in vitro, il che suggerisce il suo possibile ruolo in vivo durante la replicazione del DNA. Infine, è stata messa a punto una nuova procedura per la coespressione e purificazione del complesso α-ε-θ

RNA non-codificanti indotti da danno al DNA regolano il fattore di trascrizione HIF-1α

Recenti analisi sull’intero trascrittoma hanno rivelato una estensiva trascrizione di RNA non codificanti (ncRNA), le quali funzioni sono tuttavia in gran parte sconosciute. In questo lavoro è stato dimostrato che alte dosi di camptotecina (CPT), un farmaco antitumorale inibitore della Top1, aumentano la trascrizione di due ncRNA antisenso in 5’ e 3’ (5'aHIF-1α e 3'aHIF-1α rispettivamente) al locus genico di HIF-1α e diminuiscono i livelli dell’mRNA di HIF-1α stesso. Gli effetti del trattamento sono Top1-dipendenti, mentre non dipendono dal danno al DNA alla forca di replicazione o dai checkpoint attivati dal danno al DNA. I ncRNA vengono attivati in risposta a diversi tipi di stress, il 5'aHIF-1α è lungo circa 10 kb e possiede sia il CAP in 5’ sia poliadenilazione in 3’ (in letteratura è noto che il 3'aHIF-1α è un trascritto di 1,7 kb, senza 5’CAP né poliadenilazione). Analisi di localizzazione intracellulare hanno dimostrato che entrambi sono trascritti nucleari. In particolare 5'aHIF-1α co-localizza con proteine del complesso del poro nucleare, suggerendo un suo possibile ruolo come mediatore degli scambi della membrana nucleare. È stata dimostrata inoltre la trascrizione dei due ncRNA in tessuti di tumore umano del rene, evidenziandone possibili ruoli nello sviluppo del cancro. È anche noto in letteratura che basse dosi di CPT in condizioni di ipossia diminuiscono i livelli di proteina di HIF-1α. Dopo aver dimostrato su diverse linee cellulari che i due ncRNA sopracitati non potessero essere implicati in tale effetto, abbiamo studiato le variazioni dell’intero miRnoma alle nuove condizioni sperimentali. In tal modo abbiamo scoperto che il miR-X sembra essere il mediatore molecolare dell’abbattimento di HIF-1α dopo trattamento con basse dosi di CPT in ipossia. Complessivamente, questi risultati suggeriscono che il fattore di trascrizione HIF-1α venga finemente regolato da RNA non-codificanti indotti da danno al DNA.

Ultrasuoni focalizzati guidati da imaging di risonanza magnetica: studio delle potenziali applicazioni in campo scheletrico, esempio n.1 - osteoma osteoide

La chirurgia con ultrasuoni focalizzati guidati da MRI (MR-g-FUS) è un trattamento di minima invasività, guidato dal più sofisticato strumento di imaging a disposizione, che utilizza a scopo diagnostico e terapeutico forme di energia non ionizzante. Le sue caratteristiche portano a pensare un suo possibile e promettente utilizzo in numerose aree della patologia umana, in particolare scheletrica. L'osteoma osteoide affligge frequentemente pazienti di giovane età, è una patologia benigna, con origine ed evoluzione non chiare, e trova nella termoablazione con radiofrequenza continua sotto guida CT (CT-g-RFA) il suo trattamento di elezione. Questo lavoro ha valutato l’efficacia, gli effetti e la sicurezza del trattamento dell’osteoma osteoide con MR-g-FUS. Sono stati presi in considerazione pazienti arruolati per MR-g-FUS e, come gruppo di controllo, pazienti sottoposti a CT-g-RFA, che hanno raggiunto un follow-up minimo di 18 mesi (rispettivamente 6 e 24 pazienti). Due pazienti erano stati esclusi dal trattamento MR-g-FUS per claustrofobia (2/8). Tutti i trattamenti sono stati portati a termine con successo tecnico e clinico. Non sono state registrate complicanze o eventi avversi correlati all’anestesia o alle procedure di trattamento, e tutti i pazienti sono stati dimessi regolarmente dopo 12-24 ore. La durata media dei trattamenti di MR-g-FUS è stata di 40±21 min. Da valori di score VAS pre-trattamento oscillanti tra 6 e 10 (su scala 0-10), i trattamenti hanno condotto tutti i pazienti a VAS 0 (senza integrazioni farmacologiche). Nessun paziente ha manifestato segni di persistenza di malattia o di recidiva al follow-up. Nonostante la neurolisi e la risoluzione dei sintomi, la perfusione del nidus è stata ritrovata ancora presente in oltre il 70% dei casi sottoposti a MR-g-FUS (4/6 pazienti). I risultati derivati da un'analisi estesa a pazienti più recentemente arruolati confermano questi dati. Il trattamento con MR-g-FUS sembra essere efficace e sicuro nel risolvere la sintomatologia dell'osteoma osteoide.

Valutazione del ruolo dell'espressione di IRS-1 nel differenziamento osteoblastico di cellule di osteosarcoma ed MSCs

L’osteosarcoma (OS) è il tumore primitivo dell’osso più comune in età pediatrica e adolescenziale. L’OS è stato recentemente riconsiderato come una patologia da de-differenziamento, legata all’interruzione del processo cui vanno incontro i precursori osteoblastici, quali le cellule staminali mesenchimali (MSCs), per trasformarsi in osteoblasti maturi. Il sistema IGF è coinvolto nella regolazione della proliferazione e del differenziamento di cellule di OS. IRS-1 è un mediatore critico di tale via di segnalazione e il suo livello di espressione modula il differenziamento di cellule ematopoietiche. Lo scopo di questa tesi è stato quello di definire il ruolo di IRS-1 nel differenziamento osteoblastico di MSCs e cellule di OS. Il potenziale differenziativo di cellule di OS umano e murino e di MSCs derivate da midollo osseo è stato valutato tramite Alizarin Red staining e Real Time-PCR. Dai dati ottenuti è emerso come i livelli di espressione di IRS-1 diminuiscano durante il differenziamento osteoblastico. Conseguentemente, i livelli di espressione di IRS-1 sono stati manipolati utilizzando shRNA per down-regolare l’espressione della proteina o un plasmide per sovra-esprimerla. Sia la down-regolazione sia la sovra-espressione di IRS-1 hanno inibito il differenziamento osteoblastico delle linee cellulari considerate. Allo scopo di valutare il contributo di IRS-1 nella via di segnalazione di IGF-1R è stato utilizzato l’inibitore di tale recettore, αIR-3. Anche in questo caso è stata osservata una riduzione della capacità differenziativa. L’inibitore del proteasoma MG-132 ha portato ad un aumento dei livelli di IRS-1, portando nuovamente all’inibizione del differenziamento osteoblastico e suggerendo che l’ubiquitinazione di questa proteina potrebbe avere un ruolo importante nel mantenimento di appropriati livelli di espressione di IRS-1. I risultati ottenuti indicano la criticità dei livelli di espressione di IRS-1 nella determinazione della capacità differenziativa sia di cellule di OS umano e murino, sia delle MSCs.

Studio della patogenesi di HIV-1 nel compartimento osseo: effetti della terapia antiretrovirale convenzionale e nuovi approcci all'eradicazione

L’obiettivo della tesi è studiare il virus HIV-1 in relazione alle alterazioni sistemiche, riscontrate nel paziente HIV-infetto, in particolare alterazioni a carico del sistema scheletrico, indotte dal virus o dall’azione dei farmaci utilizzati nella terapia antiretrovirale (HAART). L’incidenza dell’osteoporosi nei pazienti HIV-positivi è drammaticamente elevata rispetto alla popolazione sana. Studi clinici hanno evidenziato come alcuni farmaci, ad esempio inibitori della proteasi virale, portino alla compromissione dell’omeostasi ossea, con aumento del rischio fratturativo. Il nostro studio prevede un follow-up di 12 mesi dall’inizio della HAART in una coorte di pazienti naïve, monitorando diversi markers ossei. I risultati ottenuti mostrano un incremento dei markers metabolici del turnover osseo, confermando l’impatto della HAART sull’omeostasi ossea. Successivamente abbiamo focalizzato la nostra attenzione sugli osteoblasti, il citotipo che regola la sintesi di nuova matrice ossea. Gli esperimenti condotti sulla linea HOBIT mettono in evidenza come il trattamento, in particolare con inibitori della proteasi, porti ad apoptosi nel caso in cui vi sia una concentrazione di farmaco maggiore di quella fisiologica. Tuttavia, anche concentrazioni fisiologiche di farmaci possono regolare negativamente alcuni marker ossei, come ALP e osteocalcina. Infine esiste la problematica dell’eradicazione di HIV-1 dai reservoirs virali. La HAART riesce a controllare i livelli viremici, ciononostante diversi studi propongono alcuni citotipi come potenziali reservoir di infezione, vanificando l’effetto della terapia. Abbiamo, perciò, sviluppato un nuovo approccio molecolare all’eradicazione: sfruttare l’enzima virale integrasi per riconoscere in modo selettivo le sequenze LTR virali per colpire il virus integrato. Fondendo integrasi e l’endonucleasi FokI, abbiamo generato diversi cloni. Questi sono stati transfettati stabilmente in cellule Jurkat, suscettibili all’infezione. Una volta infettate, abbiamo ottenuto una significativa riduzione dei markers di infezione. Successivamente la transfezione nella linea linfoblastica 8E5/LAV, che porta integrata nel genoma una copia di HIV, ha dato risultati molto incoraggianti, come la forte riduzione del DNA virale integrato.

Studio dell'interazione di HIV-1 sulle cellule progenitrici ematopoietiche CD34+ (HPCs)

Oltre alla progressiva perdita dei linfociti T CD4, i pazienti HIV-infetti presentano diverse citopenie periferiche. In particolare l’anemia si riscontra nel 10% dei pazienti asintomatici e nel 92% di quelli con AIDS e la terapia cART non è in grado di risolvere tale problematica. I meccanismi patogenetici alla base di questa citopenia si ritiene che possano riguardare la deregolazione citochinica, il danno alle HPCs, alle cellule in differenziamento e alle cellule stromali. Le cellule progenitrici ematopoietiche CD34+, dopo essere state separate da sangue cordonale e differenziate verso la linea eritroide, sono state trattate con HIV-1 attivo, inattivato al calore e gp120. In prima istanza è stata messa in luce la mancata suscettibilità all’infezione e l’aumento dell’ apoptosi dovuto al legame gp120-CD4/CXCR4 e mediato dal TGF-β1 nelle cellule progenitrici indifferenziate. L’aspetto innovativo di questo studio però si evidenzia esaminando l’effetto di gp120 durante il differenziamento verso la filiera eritrocitaria. Sono stati utilizzati due protocolli sperimentali: nel primo le cellule sono inizialmente trattate per 24 ore con gp120 (o con HIV-1 inattivato al calore) e poi indotte in differenziamento, nel secondo vengono prima differenziate e poi trattate con gp120. Il “priming” negativo determina una apoptosi gp120-indotta molto marcata già dopo 48 ore dal trattamento ed una riduzione del differenziamento. Se tali cellule vengono invece prima differenziate per 24 ore e poi trattate con gp120, nei primi 5 giorni dal trattamento, è presente un aumento di proliferazione e differenziamento, a cui segue un brusco arresto che culmina con una apoptosi molto marcata (anch’essa dipendente dal legame gp120-CD4 e CXCR4 e TGF-β1 dipendente) e con una drastica riduzione del differenziamento. L’insieme dei risultati ha permesso di definire in modo consistente la complessità della genesi dell’anemia in questi pazienti e di poter suggerire nuovi target terapeutici in questi soggetti, già sottoposti a cART.