Controllo molecolare del differenziamento osteoblestico per applicazioni nel campo della rigenerazione del tessuto osseo

The aim of the study was to identify expression signatures unique for specific stages of osteoblast differentiation in order to improve our knowledge of the molecular mechanisms underlying bone repair and regeneration. We performed a microarray analysis on the whole transcriptome of human mesenchymal stem cells (hMSCs) obtained from the femoral canal of patients undergoing hip replacement. By defining different time-points within the differentiation and mineralization phases of hMSCs, temporal gene expression changes were visualised. Importantly, the gene expression of adherent bone marrow mononuclear cells, being the undifferentiated progenitors of bone cells, was used as reference. In addition, only the cultures able to form mineral nodules at the final time-point were considered for the gene expression analyses. To obtain the genes of our interest, we only focused on genes: i) whose expression was significantly upregulated; ii) which are involved in pathways or biological processes relevant to proliferation, differentiation and functions of bone cells; iii) which changed considerably during the different steps of differentiation and/or mineralization. Among the 213 genes identified as differentially expressed by microarray analysis, we selected 65 molecular markers related to specific steps of osteogenic differentiation. These markers are grouped into various gene clusters according to their involvement in processes which play a key role in bone cell biology such as angiogenesis, ossification, cell communication, development and in pathways like TGF beta and Wnt signaling pathways. Taken together, these results allow us to monitor hMSC cultures and to distinguish between different stages of differentiation and mineralization. The signatures represent a useful tool to analyse a broad spectrum of functions of hMSCs cultured on scaffolds, especially when the constructs are conceived for releasing growth factors or other signals to promote bone regeneration. Morover, this work will enhance our understanding of bone development and will enable us to recognize molecular defects that compromise normal bone function as occurs in pathological conditions.

Impiego di cellule staminali in terapia veterinaria

Over the past few years, in veterinary medicine there has been an increased interest in understanding the biology of mesenchymal stem cells (MSCs). This interest comes from their potential clinical use especially in wound repair, tissue engineering and application in therapeutics fields, including regenerative surgery. MSCs can be isolated directly from bone marrow aspirates, adipose tissue, umbilical cord and various foetal tissues. In this study, mesenchymal stem cells were isolated from equine bone marrow, adipose tissue, cord blood, Wharton’s Jelly and, for the first time, amniotic fluid. All these cell lines underwent in vitro differentiation in chondrocytes, osteocytes and adipocytes. After molecular characterization, cells resulted positive for mesenchymal markers such as CD90, CD105, CD44 and negative for CD45, CD14, CD34 and CD73. Adipose tissue and bone marrow mesenchymal stem cells were successfully applied in the treatment of tendinitis in race horses. Furthermore, for the first time in the horse, skin wounds of septicemic foal, were treated applying amniotic stem cells. Finally, results never reported have been obtained in the present study, isolating mesenchymal stem cells from domestic cat foetal fluid and membranes. All cell lines underwent in vitro differentiation and expressed mesenchymal molecular markers.

Studio del ruolo della Protein chinasi B/Akt nella migrazione di Cellule Staminali Mesenchimali umane

Le cellule staminali/stromali mesenchimali umane (hMSC) sono attualmente applicate in diversi studi clinici e la loro efficacia è spesso legata alla loro capacità di raggiungere il sito d’interesse. Poco si sa sul loro comportamento migratorio e i meccanismi che ne sono alla base. Perciò, questo studio è stato progettato per comprendere il comportamento migratorio delle hMSC e il coinvolgimento di Akt, nota anche come proteina chinasi B. L’espressione e la fosforilazione della proteinchinasi Akt è stata studiata mediante Western blotting. Oltre al time-lapse in vivo imaging, il movimento cellulare è stato monitorato sia mediante saggi tridimensionali, con l’uso di transwell, che mediante saggi bidimensionali, attraverso la tecnica del wound healing. Le prove effettuate hanno rivelato che le hMSC hanno una buona capacità migratoria. E’ stato osservato che la proteinchinasi B/Akt ha elevati livelli basali di fosforilazione in queste cellule. Inoltre, la caratterizzazione delle principali proteine di regolazione ed effettrici, a monte e a valle di Akt, ha permesso di concludere che la cascata di reazioni della via di segnale anche nelle hMSC segue un andamento canonico. Specifici inibitori farmacologici sono stati utilizzati per determinare il potenziale meccanismo coinvolto nella migrazione cellulare e nell'invasione. L’inibizione della via PI3K/Akt determina una significativa riduzione della migrazione. L’utilizzo di inibitori farmacologici specifici per le singole isoforme di Akt ha permesso di discriminare il ruolo diverso di Akt1 e Akt2 nella migrazione delle hMSC. E’ stato infatti dimostrato che l'inattivazione di Akt2, ma non quella di Akt1, diminuisce significativamente la migrazione cellulare. Nel complesso i risultati ottenuti indicano che l'attivazione di Akt2 svolge un ruolo critico nella migrazione della hMSC; ulteriori studi sono necessari per approfondire la comprensione del fenomeno. La dimostrazione che l’isoforma Akt2 è necessaria per la chemiotassi diretta delle hMSC, rende questa chinasi un potenziale bersaglio farmacologico per modulare la loro migrazione.

Sistemi endorfinergici e modulazione di segnali molecolari e profili trascrizionali coinvolti in processi di protezione e autoriparazione del miocardio danneggiato

Con il termine IPC (precondizionamento ischemico) si indica un fenomeno per il quale, esponendo il cuore a brevi cicli di ischemie subletali prima di un danno ischemico prolungato, si conferisce una profonda resistenza all’infarto, una delle principali cause di invalidità e mortalità a livello mondiale. Studi recenti hanno suggerito che l’IPC sia in grado di migliorare la sopravvivenza, la mobilizzazione e l’integrazione di cellule staminali in aree ischemiche e che possa fornire una nuova strategia per potenziare l’efficacia della terapia cellulare cardiaca, un’area della ricerca in continuo sviluppo. L’IPC è difficilmente trasferibile nella pratica clinica ma, da anni, è ben documentato che gli oppioidi e i loro recettori hanno un ruolo cardioprotettivo e che attivano le vie di segnale coinvolte nell’IPC: sono quindi candidati ideali per una possibile terapia farmacologica alternativa all’IPC. Il trattamento di cardiomiociti con gli agonisti dei recettori oppioidi Dinorfina B, DADLE e Met-Encefalina potrebbe proteggere, quindi, le cellule dall’apoptosi causata da un ambiente ischemico ma potrebbe anche indurle a produrre fattori che richiamino elementi staminali. Per testare quest’ipotesi è stato messo a punto un modello di “microambiente ischemico” in vitro sui cardiomioblasti di ratto H9c2 ed è stato dimostrato che precondizionando le cellule in modo “continuativo” (ventiquattro ore di precondizionamento con oppioidi e successivamente ventiquattro ore di induzione del danno, continuando a somministrare i peptidi oppioidi) con Dinorfina B e DADLE si verifica una protezione diretta dall’apoptosi. Successivamente, saggi di migrazione e adesione hanno mostrato che DADLE agisce sulle H9c2 “ischemiche” spronandole a creare un microambiente capace di attirare cellule staminali mesenchimali umane (FMhMSC) e di potenziare le capacità adesive delle FMhMSC. I dati ottenuti suggeriscono, inoltre, che la capacità del microambiente ischemico trattato con DADLE di attirare le cellule staminali possa essere imputabile alla maggiore espressione di chemochine da parte delle H9c2.

Analisi dei meccanismi patogenetici alla base del danno vascolare Hiv-indotto

L'infezione da HIV-1 resta ancora oggi una delle principali problematiche nell'ambito della sanità mondiale, con circa 35 milioni di individui infetti in tutto il mondo. L'introduzione della terapia antiretrovirale combinata (cART) ha drasticamente modificato l’evoluzione di questa infezione, che da patologia a sviluppo terminale dopo alcuni anni dalla trasmissione, è diventata una patologia cronica con una lunga aspettativa di vita per i pazienti. Tuttavia, la cART non è in grado di eradicare l’infezione e nei pazienti HIV-infetti trattati è possibile notare un aumento della comparsa di comorbidità, tra le quali le più frequentemente riscontrate sono lesioni al sistema nervoso centrale, ai reni, al tessuto osseo, al fegato e al sistema cardiovascolare. I danni al sistema cardiocircolatorio derivano da una serie di concause virologiche, comportamentali, ambientali e farmacologiche che alterano la parete vascolare, il metabolismo dei lipidi e la regolazione della coagulazione, inducendo la formazione di lesioni strutturali di tipo aterosclerotico che sono alla base dell’aumentata incidenza di infarti, ictus e alterazioni del circolo osservabili nei pazienti HIV-positivi. Dalla recente letteratura è emerso come l’omeostasi del tessuto endoteliale sia regolata anche a livello delle cellule staminali mesenchimali (MSC) presenti nella parete vascolare. Per questo abbiamo voluto analizzare possibili effetti dell’infezione di HIV, delle sue proteine e di alcune molecole antiretrovirali sulla vitalità e sul differenziamento delle MSC purificate dalla parete arteriosa umana. I risultati ottenuti indicano come l’infezione da HIV e l’azione delle proteine gp120 e Tat attivino il meccanismo di apoptosi nelle MSC e una profonda alterazione nel differenziamento verso la filiera adipocitaria e verso quella endoteliale. Inoltre, alcune molecole ad azione antiretrovirale (in particolare specifici inibitori della proteasi virale) sono in grado bloccare il differenziamento delle MSC verso le cellule endoteliali. Dall’insieme di queste osservazioni emergono nuovi meccanismi patogenetici correlati al danno cardiovascolare riscontrato nei pazienti HIV-positivi.

Ricerca di nuove strategie differenziative: Analisi degli effetti di stimoli fisici e molecolari su cellule mesenchimali umane isolate da tessuto adiposo

Introduzione. Le cellule mesenchimali derivate dal tessuto adiposo (hASC) rappresentano un importante strumento per la terapia cellulare, in quanto derivano da un tessuto adulto abbondante e facilmente reperibile. Con il dispositivo medico Lipogems l’isolamento di tali cellule è eseguito esclusivamente mediante sollecitazioni meccaniche. Il prodotto ottenuto è quindi minimamente manipolato e subito utilizzabile. Ad oggi, il condizionamento pro-differenziativo delle staminali è per lo più attuato mediante molecole di sintesi. Tuttavia, altri fattori possono modulare la fisiologia cellulare, come gli stimoli fisici e molecole naturali. Onde elettromagnetiche hanno indotto in modelli cellulari staminali l’espressione di alcuni marcatori di differenziamento e, in cellule adulte, una riprogrammazione, mentre estratti embrionali di Zebrafish sono risultati antiproliferativi sia in vitro che in vivo. Metodi. La ricerca di nuove strategie differenziative sia di natura fisica che molecolare, nel particolare onde acustiche ed estratti embrionali di Zebrafish, è stata condotta utilizzando come modello cellulare le hASC isolate con Lipogems. Onde acustiche sono state somministrate mediante l’utilizzo di due apparati di trasduzione, un generatore di onde meccaniche e il Cell Exciter . I trattamenti con gli estratti embrionali sono stati effettuati utilizzando diverse concentrazioni e diversi tempi sperimentali. Gli effetti sull’espressione dei marcatori di staminalità e differenziamento relativi ai trattamenti sono stati saggiati in RT-PCR quantitativa relativa e/o in qPCR. Per i trattamenti di tipo molecolare è stata valutata anche la proliferazione. Risultati e conclusioni. La meta-analisi dei dati delle colture di controllo mostra la stabilità d’espressione genica del modello. I trattamenti con i suoni inducono variazioni dell’espressione genica, suggerendo un ruolo regolatorio di tali stimoli, in particolare del processo di commitment cardiovascolare. Due degli estratti embrionali di Zebrafish testati inibiscono la proliferazione alle 72 ore dalla somministrazione. L’analisi d’espressione associata ai trattamenti antiproliferativi suggerisce che tale effetto abbia basi molecolari simili ai processi di differenziamento.

Cell death mechanisms triggered by monoclonal antibodies against CD99 in Ewing sarcoma: Cross-talk between MDM2, IGF-1R and Ras/MAPK

CD99 is a 32 kDa transmembrane protein whose high expression characterizes Ewing sarcoma (ES), a very aggressive pediatric bone tumor. In addition to its diagnostic value, CD99 has therapeutic potential since it leads to rapid and massive ES cell death when engaged with specific antibodies. Here a novel mechanism of cell death triggered via CD99 is shown, leading, ultimately, to the appearance of macropinocytotic vescicles. Anti-CD99 mAb 0662 induces MDM2 ubiquitination and degradation, which causes not only a p53 reactivation but also the IGF-1R induction and its subsequent internalization; CD99 results internalized together with IGF-1R inside endosomes, but then the two molecules display a different sorting: CD99 is degraded, while IGF-1R is recycled on the surface, causing, as a final step, the up-regulation of RAS-MAPK. High-expressing CD99 mesenchymal stem cells show mild Ras induction but no p53 activation and escape cell death, but in presence of EWS/FLI1 mesenchymal stem cells expressing CD99 show a stronger Ras induction and a p53 reactivation, leading to a significant cell death rate. We propose that CD99 triggering in a EWS/FLI1-driven oncogenetic context creates a synergy between RAS upregulation and p53 activation in ES cells, leading to cell death. Moreover, our data rule out possible concerns on toxicity related to the broad CD99 expression in normal tissues and provide the rationale for the therapeutic use of anti-CD99 MAbs in the clinic.

Allestimento di modello sperimentale su animali di tessuto osseo ingegnerizzato

Questo studio ha valutato l'efficacia di un approccio rigenerativo utilizzando cellule staminali mesenchimali (MSC) e uno scaffold di idrossiapatite pura e porosa (HA) progettata con tecnologia CAD-CAM per sostituire il condilo dell'articolazione temporomandibolare (ATM). Metodi.Uno scaffolds di HA con porosità totale del 70% è stato prototipato per sostituire i due condili temporomandibolari (sinistro e destro) dello stesso animale. MSC sono state ottenute dalla cresta iliaca ed espanse in coltura. Guide chirurgiche su misura sono state create e utilizzate per esportare la pianificazione virtuale delle linee di taglio dell'osso nell'ambiente chirurgico. Sei pecore sono state sacrificate a 4 mesi dopo l'intervento.Gli scaffold sono stati espiantati, campioni istologici sono stati preparati, ed è stata eseguota l'analisi istomorfometrica. Risultati.L'analisi della riduzione di porosità per apposizione di osso neoformato mostrata una differenza statisticamente significativa tra la formazione ossea nei condili carichi di MSC rispetto ai condili senza (

Microenvironment and prognostic factors in bone tumors: IDH mutations in chondrosarcoma

Microenvironment in bone tumors is a dynamic entity composed of cells from different origins (immune cells, stromal cells, mesenchymal stem cells, endothelial cells, pericytes) and vascular structures surrounded by a matrix of different nature (bone, cartilage, myxoid). Interactions between cancer cells and tumor microenvironment (TME) are complex and can change as tumor progress, but are also crucial in determining response to cancer therapies. Chondrosarcoma is the second most frequent bone cancer in adult age, but its treatment still represents a challenge, for the intrinsic resistance to conventional chemotherapy and radiation therapy. This resistance is mainly due to pathological features, as dense matrix, scarce mitoses and poor vascularization, sustained by biological mechanisms only partially delucidated. Somatic mutation in the Krebs cycle enzyme isocytrate dehydrogenase (IDH) have been described in gliomas, acute myeloid leukemia, cholangiocarcinoma, melanoma, colorectal, prostate cancer, thyroid carcinoma and other cancers. In mesenchymal tumors IDH mutations are present in about 50% of central chondrosarcoma. IDH mutations are an early event in chondrosarcoma-genesis, and contribute to the acquisition of malignancy through the block of cellular differentiation, hypoxia induction through HIF stabilization, DNA methylation and alteration of cellular red-ox balance. While in gliomas IDH mutations confers a good prognosis, in chondrosarcoma IDH prognostic role is controversial in different reported series. First aim of this project is to define the prevalence and the prognostic role of IDH mutation in high grade central conventional chondrosarcoma patients treated at Istituto Ortopedico Rizzoli. Second aim is the critical revision of scientific literature to understand better how a genomic event in cancer cell can trigger alteration in the TME, through immune infiltrate reshaping, angiogenesis induction, metabolic and methylation rewiring. Third aim is to screen other sarcoma histotypes for the presence of IDH mutation.

Studio degli effetti di citochine a basso dosaggio (LOW DOSE) su cellule di origine animale (3T3-L1) ed umana (hASC)

Nella sindrome metabolica l’insulino-resistenza e l’obesità rappresentano i fattori chiave nello sviluppo di tale patologia, ma il principale player risulta un’infiammazione cronica di basso grado (Chronic Low Grade Inflammation) a carico del tessuto adiposo. Lo scopo di questo progetto di ricerca è quindi stato quello di testare citochine a basso dosaggio come possibile trattamento dell’infiammazione cronica. Le citochine utilizzate (GUNA®-Interleukin 4 (IL-4), GUNA®-Interleukin 10 (IL-10), GUNA®-Melatonin, GUNA®-Melatonin+GUNA®-IL-4.) sono state fornite dall’azienda GUNA S.p.a. Poiché l’infiammazione cronica a basso grado inizia in seguito ad un aumento eccessivo del tessuto adiposo, inizialmente si è valutato l’effetto su una linea di preadipociti murini (3T3-L1). Questa prima parte dello studio ha messo in evidenza come le citochine a basso dosaggio non modificano la vitalità cellulare, anche se agiscono sull’espressione e la localizzazione di vimentina e E-caderina. Inoltre IL-4 e IL-10 sembrano avere una parziale attività inibitoria, non significativa, sull’adipogenesi ad eccezione dell’espressione dell’adiponectina che appare significativamente aumentata. In ultimo i trattamenti con IL-4 e IL-10 hanno mostrato una diminuzione del contenuto di ROS e una ridotta attività antiinfiammatoria dovuta alla diminuzione di IL-6 secreto. Un’altra popolazione cellulare principale nel tessuto adiposo è rappresentata dalle ASC (Adipose Stem Cell). Per tale motivo si è proseguito valutando l’effetto che le citochine low-dose su questo citotipo, evidenziando che il trattamento con le citochine non risulta essere tossico, anche se sembrerebbe rallentare la crescita cellulare, e determina un’inibizione del processo adipogenico. Inoltre il trattamento con IL-10 sembra stimolare le ASC a produrre fattori che inducono una maggiore vasculogenesi e le induce a produrre fattori chemiotattici che determinano una maggiore capacità di rigenerazione tissutale da parte di MSC da derma. Infine, il trattamento con IL-4 e IL-10 stimola probabilmente una minore produzione di citochine pro-infiammatorie che inducono in maniera significativa una minore mobilità di cellule MSC.

Ions and Small Molecules as Modulators of F1FO-ATPase, Mitochondrial Bioenergetics and Cell Metabolism

The properties of the mitochondrial F1FO-ATPase activated by the natural cofactor Mg2+ or by Ca2+, were studied, mainly on heart mitochondria from swine, widely used in translational medicine. The Ca2+ driven conformational changes in the F1FO-ATPase form the mitochondrial permeability transition pore (mPTP), which triggers regulated cell death and is involved in severe pathologies. The Ca2+-activated F1FO-ATPase hydrolyzes ATP with kinetics slightly different from those of the Mg2+-ATPase. Known F1-ATPase inhibitors inhibit both the Ca2+-activated F1FO-ATPase and the mPTP formation strengthening the molecular link between them. The different Gd3+ effects on the Ca2+- and Mg2+-activated F1FO-ATPases confirm their difference as also phenylglyoxal which preferentially inhibits the Ca2+-activated F1FO-ATPase. The effects of phenylarsine and dibromobimane, which interact with differently distant Cys thiols, show that mPTP opening is ruled by nearby or distant dithiols. Bergamot polyphenols and melatonin inhibit the mPTP and ROS formation. H2S, a known cardiovascular protector, unaffects the F1FO-ATPase, but inhibits Ca2+ absorption and indirectly the mPTP, both in swine heart and mussel midgut gland mitochondria. New generation triazoles inhibit the Ca2+-activated F1FO-ATPase and the mPTP, but unaffect the Mg2+-activated F1FOATPase. In parallel, the energy metabolism was investigated in mammalian cells. In boar sperm ATP is mainly produced by mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS), even if it decreases over time because of less active mitochondria. Insufficient ATP may induce sperm dysfunction. Also, canine mesenchymal stem cells rely on OXPHOS; those from umbilical cord which produce more ATP than those from adipose tissue, seem preferable for transplant studies. The intestinal porcine enterocyte cell line IPEC-J2, used for human gut research, responds to different fetal bovine serum concentrations by remodeling OXPHOS without altering the bioenergetic parameters. The IPEC-J2 bioenergetics is modulated by Vitamin K vitamers. These data shoulder cell bioenergetics as precious tool for medical research.

In vitro characterisation and expansion of human regulatory T cells for their in vivo application in the induction of tolerance in haematopoietic stem cell and solid organ transplantation

Solid organ transplantation (SOT) is considered the treatment of choice for many end-stage organ diseases. Thus far, short term results are excellent, with patient survival rates greater than 90% one year post-surgery, but there are several problems with the long term acceptance and use of immunosuppressive drugs. Hematopoietic Stem Cells Transplantation (HSCT) concerns the infusion of haematopoietic stem cells to re-establish acquired and congenital disorders of the hematopoietic system. The main side effect is the Graft versus Host Disease (GvHD) where donor T cells can cause pathology involving the damage of host tissues. Patients undergoing acute or chronic GvHD receive immunosuppressive regimen that is responsible for several side effects. The use of immunosuppressive drugs in the setting of SOT and GvHD has markedly reduced the incidence of acute rejection and the tissue damage in GvHD however, the numerous adverse side effects observed boost the development of alternative strategies to improve the long-term outcome. To this effect, the use of CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells (Treg) as a cellular therapy is an attractive approach for autoimmunity disease, GvHD and limiting immune responses to allograft after transplantation. Treg have a pivotal role in maintaining peripheral immunological tolerance, by preventing autoimmunity and chronic inflammation. Results of my thesis provide the characterization and cell processing of Tregs from healthy controls and patients in waiting list for liver transplantation, followed by the development of an efficient expansion-protocol and the investigation of the impact of the main immunosuppressive drugs on viability, proliferative capacity and function of expanded cells after expansion. The conclusion is that ex vivo expansion is necessary to infuse a high Treg dose and although many other factors in vivo can contribute to the success of Treg therapy, the infusion of Tregs during the administration of the highest dose of immunosuppressants should be carefully considered.