Study of apoptotic deletion mediated by Bifidobacterium longum with construction of recombinant strains for Serpin encoding gene and phenotypes comparison in a pig cell model

The first part of the research project of the Co-Advisorship Ph.D Thesis was aimed to select the best Bifidobacterium longum strains suitable to set the basis of our study. We were looking for strains with the abilities to colonize the intestinal mucosa and with good adhesion capacities, so that we can test these strains to investigate their ability to induce apoptosis in “damaged” intestinal cells. Adhesion and apoptosis are the two process that we want to study to better understand the role of an adhesion protein that we have previously identified and that have top scores homologies with the recent serpin encoding gene identified in B. longum by Nestlè researchers. Bifidobacterium longum is a probiotic, known for its beneficial effects to the human gut and even for its immunomodulatory and antitumor activities. Recently, many studies have stressed out the intimate relation between probiotic bacteria and the GIT mucosa and their influence on human cellular homeostasis. We focused on the apoptotic deletion of cancer cells induced by B. longum. This has been valued in vitro, performing the incubation of three B.longum strains with enterocyte-like Caco- 2 cells, to evidence DNA fragmentation, a cornerstone of apoptosis. The three strains tested were defined for their adhesion properties using adhesion and autoaggregation assays. These features are considered necessary to select a probiotic strain. The three strains named B12, B18 and B2990 resulted respectively: “strong adherent”, “adherent” and “non adherent”. Then, bacteria were incubated with Caco-2 cells to investigate apoptotic deletion. Cocultures of Caco-2 cells with B. longum resulted positive in DNA fragmentation test, only when adherent strains were used (B12 and B18). These results indicate that the interaction with adherent B. longum can induce apoptotic deletion of Caco-2 cells, suggesting a role in cellular homeostasis of the gastrointestinal tract and in restoring the ecology of damaged colon tissues. These results were used to keep on researching and the strains tested were used as recipient of recombinant techniques aimed to originate new B.longum strains with enhanced capacity of apoptotic induction in “damaged” intestinal cells. To achieve this new goal it was decided to clone the serpin encoding gene of B. longum, so that we can understand its role in adhesion and apoptosis induction. Bifidobacterium longum has immunostimulant activity that in vitro can lead to apoptotic response of Caco-2 cell line. It secretes a hypothetical eukaryotic type serpin protein, which could be involved in this kind of deletion of damaged cells. We had previously characterised a protein that has homologies with the hypothetical serpin of B. longum (DD087853). In order to create Bifidobacterium serpin transformants, a B. longum cosmid library was screened with a PCR protocol using specific primers for serpin gene. After fragment extraction, the insert named S1 was sub-cloned into pRM2, an Escherichia coli - Bifidobacterium shuttle vector, to construct pRM3. Several protocols for B. longum transformation were performed and the best efficiency was obtained using MRS medium and raffinose. Finally bacterial cell supernatants were tested in a dotblot assay to detect antigens presence against anti-antitrypsin polyclonal antibody. The best signal was produced by one starin that has been renamed B. longum BLKS 7. Our research study was aimed to generate transformants able to over express serpin encoding gene, so that we can have the tools for a further study on bacterial apoptotic induction of Caco-2 cell line. After that we have originated new trasformants the next step to do was to test transformants abilities when exposed to an intestinal cell model. In fact, this part of the project was achieved in the Department of Biochemistry of the Medical Faculty of the University of Maribor, guest of the abroad supervisor of the Co-Advisorship Doctoral Thesis: Prof. Avrelija Cencic. In this study we examined the probiotic ability of some bacterial strains using intestinal cells from a 6 years old pig. The use of intestinal mammalian cells is essential to study this symbiosis and a functional cell model mimics a polarised epithelium in which enterocytes are separated by tight junctions. In this list of strains we have included the Bifidobacterium longum BKS7 transformant strain that we have previously originated; in order to compare its abilities. B. longum B12 wild type and B. longum BKS7 transformant and eight Lactobacillus strains of different sources were co-cultured with porcine small intestine epithelial cells (PSI C1) and porcine blood monocytes (PoM2) in Transwell filter inserts. The strains, including Lb. gasseri, Lb. fermentum, Lb. reuterii, Lb. plantarum and unidentified Lactobacillus from kenyan maasai milk and tanzanian coffee, were assayed for activation of cell lines, measuring nitric oxide by Griess reaction, H202 by tetramethylbenzidine reaction and O2 - by cytochrome C reduction. Cytotoxic effect by crystal violet staining and induction on metabolic activity by MTT cell proliferation assay were tested too. Transepithelial electrical resistance (TER) of polarised PSI C1 was measured during 48 hours co-culture. TER, used to observe epithelium permeability, decrease during pathogenesis and tissue becomes permeable to ion passive flow lowering epithelial barrier function. Probiotics can prevent or restore increased permeability. Lastly, dot-blot was achieved against Interleukin-6 of treated cells supernatants. The metabolic activity of PoM2 and PSI C1 increased slightly after co-culture not affecting mitochondrial functions. No strain was cytotoxic over PSI C1 and PoM2 and no cell activation was observed, as measured by the release of NO2, H202 and O2 - by PoM2 and PSI C1. During coculture TER of polarised PSI C1 was two-fold higher comparing with constant TER (~3000 ) of untreated cells. TER raise generated by bacteria maintains a low permeability of the epithelium. During treatment Interleukin-6 was detected in cell supernatants at several time points, confirming immunostimulant activity. All results were obtained using Lactobacillus paracasei Shirota e Carnobacterium divergens as controls. In conclusion we can state that both the list of putative probiotic bacteria and our new transformant strain of B. longum are not harmful when exposed to intestinal cells and could be selected as probiotics, because can strengthen epithelial barrier function and stimulate nonspecific immunity of intestinal cells on a pig cell model. Indeed, we have found out that none of the strains tested that have good adhesion abilities presents citotoxicity to the intestinal cells and that non of the strains tested can induce cell lines to produce high level of ROS, neither NO2. Moreover we have assayed even the capacity of producing certain citokynes that are correlated with immune response. The detection of Interleukin-6 was assayed in all our samples, including B.longum transformant BKS 7 strain, this result indicates that these bacteria can induce a non specific immune response in the intestinal cells. In fact, when we assayed the presence of Interferon-gamma in cells supernatant after bacterial exposure, we have no positive signals, that means that there is no activation of a specific immune response, thus confirming that these bacteria are not recognize as pathogen by the intestinal cells and are certainly not harmful for intestinal cells. The most important result is the measure of Trans Epithelial Electric Resistance that have shown how the intestinal barrier function get strengthen when cells are exposed to bacteria, due to a reduction of the epithelium permeability. We have now a new strain of B. longum that will be used for further studies above the mechanism of apoptotic induction to “damaged cells” and above the process of “restoring ecology”. This strain will be the basis to originate new transformant strains for Serpin encoding gene that must have better performance and shall be used one day even in clinical cases as in “gene therapy” for cancer treatment and prevention.

Produzione di virus sintetici per lo studio dei meccanismi di interazione coinvolti nell'induzione di resistenza

Beet soil-borne mosaic virus (BSBMV) and Beet necrotic yellow vein virus (BNYVV) are members of Benyvirus genus. BSBMV has been reported only in the United States while BNYVV has a worldwide distribution. Both viruses are vectored by Polymyxa betae, possess similar host ranges, particles number and morphology. Both viruses are not serologically related but have similar genomic organizations. Field isolates consist of four RNA species but some BNYVV isolates contain a fifth RNA. RNAs 1 and 2 are essential for infection and replication while RNAs 3 and 4 play important roles on plant and vector interactions, respectively. Nucleotide and amino acid analyses revealed BSBMV and BNYVV are different enough to be classified in two different species. Additionally in BNYVV/BSBMV mixed infections, a competition was previous described in sugar beet, where BNYVV infection reduces BSBMV accumulation in both susceptible and resistant cultivars. Considering all this observations we hypothesized that BNYVV and BSBMV crossed study, exploiting their similarities and divergences, can improve investigation of molecular interactions between sugar beets and Benyviruses. The main achievement of our research is the production of a cDNA biologically active clones collection of BNYVV and BSBMV RNAs, from which synthetic copies of both Benyviruses can be transcribed. Moreover, through recombination experiments we demonstrated, for the first time, the BNYVV RNA 1 and 2 capability to trans-replicate and encapsidate BSBMV RNA 3 and 4, either the BSBMV RNA 1 and 2 capability to replicate BNYVV RNA2 in planta. We also demonstrated that BSBMV RNA3 support long-distance movement of BNYVV RNA 1 and 2 in B. macrocarpa and that 85 foreign sequence as p29HA, GFP and RFP, are successfully expressed, in C. quinoa, by BSBMV RNA3 based replicon (RepIII) also produced by our research. These results confirm the close correlation among the two viruses. Interestingly, the symptoms induced by BSBMV RNA-3 on C. quinoa leaves are more similar to necrotic local lesions caused by BNYVV RNA-5 p26 than to strongly chlorotic local lesions or yellow spot induced by BNYVV RNA- 3 encoded p25. As previous reported BSBMV p29 share 23% of amino acid sequence identity with BNYVV p25 but identity increase to 43% when compared with sequence of BNYVV RNA-5 p26. Based on our results the essential sequence (Core region) for the longdistance movement of BSBMV and BNYVV in B. macrocarpa, is not only carried by RNA3s species but other regions, perhaps located on the RNA 1 and 2, could play a fundamental role in this matter. Finally a chimeric RNA, composed by the 5’ region of RNA4 and 3’ region of RNA3 of BSBMV, has been produced after 21 serial mechanically inoculation of wild type BSBMV on C. quinoa plants. Chimera seems unable to express any protein, but it is replicated and transcript in planta. It could represent an important tool to study the interactions between Benyvirus and plant host. In conclusion different tools, comprising a method to study synthetic viruses under natural conditions of inoculum through P. Betae, have been produced and new knowledge are been acquired that will allow to perform future investigation of the molecular interactions between sugar beets and Benyviruses.

Le determinanti degli investimenti diretti esteri in Italia nel settore agroalimentare

Gli investimenti diretti esteri (IDE) giocano un ruolo importante nella crescita economica e nello sviluppo territoriale. Con il notevole aumento dei flussi IDE nel settore agroalimentare a livello mondiale l’attenzione si è concentrata sul dibattito relativo alle determinanti che spingono alla scelta di un territorio piuttosto che un altro. Non esiste ancora un lavoro definitivo ed univoco sulle determinanti degli IDE. Alcune delle più frequenti analisi sui fattori che influenzano gli IDE includono: l’entità del mercato, il costo del lavoro, i tassi di interesse, le barriere protezionistiche, tassi di cambio, predisposizione all’export, struttura del mercato, distanze geografiche, stabilità politica e affinità culturale. Questo lavoro si propone di analizzare le determinanti nel settore agroalimentare italiano sia teoricamente che empiricamente. A questo scopo è stata applica come base teorica il paradigma OLI di Dunning e i principi legati agli investimenti orizzontali al settore agroalimentare regionale italiano. Sono state esaminate le determinanti degli investimenti diretti inward in questo settore. Le risultanti suggeriscono una relazione positiva tra la presenza di attività di servizi e la presenza di IDE nelle diverse Regioni. In un Paese ad economia avanzata come l’Italia, strategie territoriali e di impresa basate sui costi e sul mercato non sono caratterizzanti per attrarre multinazionali straniere, mentre la dotazione di servizi e infrastrutture rappresentano un nuovo obiettivo su cui le Regioni devono puntare per aprire i territori alle sfide della globalizzazione. Questa ricerca unisce analisi statistica ed econometria e studio bibliografico per approfondire e comprendere la materia in oggetto e fornire nuovi elementi e spunti su cui discutere.

L’impatto degli incentivi sull’efficienza delle imprese manifatturiere

Produttività ed efficienza sono termini comunemente utilizzati per caratterizzare l’abilità di un’impresa nell’utilizzazione delle risorse, sia in ambito privato che pubblico. Entrambi i concetti sono legati da una teoria della produzione che diventa essenziale per la determinazione dei criteri base con i quali confrontare i risultati dell’attività produttiva e i fattori impiegati per ottenerli. D’altronde, le imprese scelgono di produrre e di investire sulla base delle proprie prospettive di mercato e di costi dei fattori. Quest’ultimi possono essere influenzati dalle politiche dello Stato che fornisce incentivi e sussidi allo scopo di modificare le decisioni riguardanti l’allocazione e la crescita delle imprese. In questo caso le stesse imprese possono preferire di non collocarsi nell’equilibrio produttivo ottimo, massimizzando produttività ed efficienza, per poter invece utilizzare tali incentivi. In questo caso gli stessi incentivi potrebbero distorcere quindi l’allocazione delle risorse delle imprese che sono agevolate. L’obiettivo di questo lavoro è quello di valutare attraverso metodologie parametriche e non parametriche se incentivi erogati dalla L. 488/92, la principale politica regionale in Italia nelle regioni meridionali del paese nel periodo 1995-2004, hanno avuto o meno effetti sulla produttività totale dei fattori delle imprese agevolate. Si è condotta una ricognizione rispetto ai principali lavori proposti in letteratura riguardanti la TFP e l’aiuto alle imprese attraverso incentivi al capitale e (in parte) dell’efficienza. La stima della produttività totale dei fattori richiede di specificare una funzione di produzione ponendo l’attenzione su modelli di tipo parametrico che prevedono, quindi, la specificazione di una determinata forma funzionale relativa a variabili concernenti i fattori di produzione. Da questa si è ricavata la Total Factor Productivity utilizzata nell’analisi empirica che è la misura su cui viene valutata l’efficienza produttiva delle imprese. Il campione di aziende è dato dal merge tra i dati della L.488 e i dati di bilancio della banca dati AIDA. Si è provveduto alla stima del modello e si sono approfonditi diversi modelli per la stima della TFP; infine vengono descritti metodi non parametrici (tecniche di matching basate sul propensity score) e metodi parametrici (Diff-In-Diffs) per la valutazione dell’impatto dei sussidi al capitale. Si descrive l’analisi empirica condotta. Nella prima parte sono stati illustrati i passaggi cruciali e i risultati ottenuti a partire dalla elaborazione del dataset. Nella seconda parte, invece, si è descritta la stima del modello per la TFP e confrontate metodologie parametriche e non parametriche per valutare se la politica ha influenzato o meno il livello di TFP delle imprese agevolate.

La determinazione del cortisolo nel pelo per la valutazione del benessere animale

La definizione di “benessere animale” e le modalità di determinazione di tale parametro sono ancora ampiamente dibattute. C’è, però, una generale concordanza sul fatto che una condizione di malessere dia origine a variazioni fisiologiche e comportamentali che possono essere rilevate e misurate. Tra i parametri endocrini, il più studiato è, senza dubbio, il cortisolo, in quanto connesso con l’attivazione dell’asse ipotalamico-pituitario-surrenale in condizioni di stress e quindi ritenuto indicatore ideale di benessere, benché debba essere utilizzato con cautela in quanto un aumento dei livelli di questo ormone non si verifica con ogni tipo di stressor. Inoltre, si deve considerare che la raccolta del campione per effettuare le analisi, spesso implica il confinamento ed il contenimento degli animali e può essere, quindi, essa stessa un fattore stressante andando ad alterare i risultati. Alla luce delle suddette conoscenze gli obiettivi scientifici di questa ricerca, condotta sul gatto e sul cane, sono stati innanzitutto validare il metodo di dosaggio di cortisolo dal pelo e stabilire se tale dosaggio può rappresentare un indicatore, non invasivo, di benessere dell’animale (indice di “stress cronico”). In seguito, abbiamo voluto individuare i fattori di stress psico-sociale in gatti che vivono in gattile, in condizioni di alta densità, analizzando i correlati comportamentali ed ormonali dello stress e del benessere in questa condizione socio-ecologica, ricercando, in particolare, l’evidenza ormonale di uno stato di stress prolungato e la messa in atto di strategie comportamentali di contenimento dello stesso e il ruolo della marcatura visivo-feromonale, inoltre abbiamo effettuato un confronto tra oasi feline di diversa estensione spaziale per valutare come varia lo stress in rapporto allo spazio disponibile. Invece, nel cane abbiamo voluto evidenziare eventuali differenze dei livelli ormonali tra cani di proprietà e cani di canili, tra cani ospitati in diversi canili e tra cani che vivono in diverse realtà familiari; abbiamo voluto valutare gli effetti di alcuni arricchimenti sui cani di canile ed, infine, abbiamo analizzato cani sottoposti a specifici programmi si addestramento. Il primo importante ed originale risultato raggiunto, che risponde al primo obiettivo della ricerca, è stato la validazione del dosaggio radioimmunologico di cortisolo in campioni di pelo. Questo risultato, a nostro avviso, apre una nuova finestra sul campo della diagnostica endocrinologica metabolica. Attualmente, infatti, il monitoraggio ormonale viene effettuato su campioni ematici la cui raccolta prevede un elevato stress (stress da prelievo) per l’animale data l'invasività dell'operazione che modifica l’attività di ipotalamo-ipofisi-surrene e, dunque, provoca repentine alterazioni delle concentrazioni ormonali. Questa metodica offre, quindi, il vantaggio dell’estrema semplicità di raccolta del campione e, in più, il bassissimo costo del materiale utilizzato. Dalle ricerche condotte sui gatti di gattile sono scaturite preziose indicazioni per future indagini sullo stress e sul comportamento sociale felino. I risultati dell’analisi congiunta del comportamento e delle concentrazioni ormonali hanno evidenziato che la disponibilità di postazioni di marcatura visivo-feromonale ha un effetto positivo sia sugli indicatori comportamentali, sia su quelli ormonali di stress. I risultati dell’analisi delle concentrazioni di cortisolo, derivanti dal confronto tra sette oasi feline di diversa estensione spaziale hanno permesso di evidenziare un aumento dei livelli dell’ormone inversamente proporzionale allo spazio disponibile. Lo spazio disponibile, però, non è l’unico fattore da prendere in considerazione al fine di assicurare il benessere dell’animale infatti, nelle colonie che presentavano instabilità sociale e variabilità territoriale il cortisolo aveva valori elevati nonostante le notevoli disponibilità di spazio. Infine, si è potuto costatare come anche lo stare appartati, aumenti proporzionalmente con l’aumentare dello spazio. Questo comportamento risulta essere molto importante in quanto mitiga lo stress ed è da prendere in considerazione nell’allestimento di colonie feline. Infatti, nelle colonie di dimensioni ridotte dove lo stress è già alto, l’impossibilità dei soggetti di appartarsi può contribuire a peggiorare la situazione; ecco perché si dovrebbero creare luoghi artificiali per fornire ai gatti la possibilità di appartarsi, magari sfruttando gli spazi sopraelevati (tetti, alberi, ecc.). Per quanto riguarda il confronto tra cani di proprietà e cani di canile non sono state evidenziate differenze significative nei livelli di cortisolo nel pelo mentre abbiamo rilevato che quest’ultimi sono influenzati dalla disponibilità di spazio: infatti sia i cani di proprietà che vivevano in giardino, sia i cani dei canili che praticavano lo sgambamento presentavano livelli di cortisolo nel pelo più bassi rispetto, rispettivamente, ai cani di proprietà che vivevano in appartamento o appartamento/giardino e a quelli di canile che non praticavano lo sgambamento. L’arricchimento ambientale fornito ai cani di canile ha esercitato un’influenza positiva riducendo i livelli di cortisolo e migliorando la docilità dei soggetti, favorendone un’eventuale adozione. Si è inoltre messo in luce che i programmi di addestramento, eseguiti con tecniche “gentili”, non comportano situazioni stressanti per l’animale e aiutano i cani ad esprimere doti di equilibrio che rimarrebbero altrimenti celate dagli aspetti più istintivi del carattere. D’altra parte, l’impegno agonistico prima di una competizione e il livello di addestramento raggiunto dai cani, influenzano le concentrazioni di cortisolo a riposo e durante l’esercizio fisico. Questi risultati possono sicuramente dare utili suggerimenti per la gestione e la cura di gatti e cani al fine di migliorarne le condizioni di benessere.

Sviluppo della lotta autocida contro Aedes albopictus (Skuse) (Diptera: Culicidae)

SCOPO DELLA RICERCA Aedes albopictus è diventata in pochi anni dalla sua introduzione in Italia la specie di zanzara più nociva e più importante sotto il profilo sanitario. Essendo una zanzara tipicamente urbana e ad attività diurna, limita fortemente la fruizione degli spazi aperti ed incide negativamente su alcune attività economiche. Il recente episodio epidemico di Chikungunya, che ha colpito il nostro Paese, ha allarmato le autorità sanitarie nazionali ed europee che stanno attivando misure di prevenzione e contrasto per fronteggiare il rischio che il virus diventi endemico o che altri virus possano essere introdotti nelle nostre aree. Le misure di lotta contro Aedes albopictus attualmente in essere (lotta larvicida, rimozione dei microfocolai, informazione e coinvolgimento dei cittadini) non danno risultati sufficienti in termini di capacità di contenimento delle densità del vettore. Per questo è stato avviato un progetto di ricerca centrato sull'applicazione del metodo dell'autocidio a questa specie. L’attività di ricerca svolta ha avuto come scopo la messa a punto delle metodiche di allevamento massale e di sterilizzazione in grado di permettere la produzione di maschi di qualità sufficiente a garantire una buona fitness nelle condizioni di campo e competitività coi maschi selvatici nella fase di accoppiamento. Le prove condotte possono essere raggruppate sotto tre principali campi di indagine: Prove di allevamento, Prove di Irraggiamento e Prove di Competizione. 1. Prove di allevamento In questo ambito sono state esaminate nuove diete larvali al fine di ottenere una più elevata produttività in termini di pupe con tempi di impupamento e dimensioni delle pupe più omogenei. È stata inoltre valutata la possibile reazione fagostimolante dell’ATP addizionato al pasto di sangue delle femmine adulte con lo scopo di incrementare la produttività di uova prodotte dai ceppi di Ae.albopictus in allevamento. 2. Prove di irraggiamento Attraverso prove di laboratorio sono stati investigati in gabbia gli effetti sterilizzanti di diverse dosi radianti (20 - 85 Gy) sulle pupe maschio di Ae. albopictus per la valutazione dei livelli di sterilità, fertilità e fecondità indotti sulle femmine. Si sono compiute inoltre indagini per valutare eventuali alterazioni dello stato fisiologico dei maschi irraggiati e dei livelli di sterilità indotti su femmine, in funzione dell’età pupale alla quale venivano sottoposti a radiazioni. Analisi degli effetti delle radiazioni sui tempi di rotazione genitale, sulla velocità ed efficacia degli accoppiamenti e sui tempi di sfarfallamento degli adulti sono state condotte su maschi irraggiati a diverse dosi. Infine su femmine di Ae. albopictus si sono realizzate prove in gabbia per lo studio dei tempi di recettività all'accoppiamento. Prove di competizione L'effetto negativo della colonizzazione in condizioni artificiali e l'irraggiamento sono riconosciuti come i fattori principali che incidono sulla competitività dei maschi sterilizzati nei confronti di quelli fertili. Per la verifica della variazione di fitness dovuta a imbreeding ed eterosi, prove di competizione in serra (7,5 x 5 x 2,80 m) sono state realizzate impiegando ceppi allevati in laboratorio, ceppi selvatici raccolti in campo e ceppi ibridi ottenuti incrociando diversi ceppi di laboratorio. RISULTATI 1. Prove di allevamento Sono state confrontate la dieta standard (DS = 2,5 mg/larva Friskies Adult ® + 0,5 mg/larva lievito di birra) e la nuova dieta integrata addizionata di Tetramin ® (DI = DS + 0,2 mg/larva Tetramin ®) per l’alimentazione delle larve in allevamento. Le prove condotte hanno evidenziato una buona risposta nelle percentuali di impupamento e di produttività in termini di pupe per la nuova dieta senza però evidenziare miglioramenti significativi con la DS. Con la dieta integrata si ottiene un impupamento a 7 giorni del 66,6% delle larve allevate (65% con la DS) e il setacciamento a 1400 μm delle pupe ottenute produce in media il 98,3% di maschi nel setacciato (98,5% con la DS). Con la dieta standard la percentuale di maschi ottenuti sulle larve iniziali è pari a 27,2% (20-25% con la DS). Come riportato da Timmermann e Briegel (1999) la dieta delle larve va strutturata con l’obiettivo di garantire un ampio range di elementi nutritivi evitando così il rischio di carenze o sub-carenze che possano influire negativamente sulla produttività dell’allevamento e sulle condizioni di vigore dei maschi. Secondo Reisen (1980, 1982), l’influenza negativa dell’allevamento sulla competitività dei maschi nella fase di accoppiamento potrebbe essere di maggiore peso rispetto all’influenza dell’irraggiamento dei maschi. Infine le prove di laboratorio condotte per la verifica dell’efficacia fagostimolante di ATP nel pasto di sangue offerto alle femmine dell’allevamento non hanno evidenziato differenze significative in nessuno dei parametri considerati tra il campione nutrito con ATP e il testimone. Nella realizzazione di allevamenti massali per la produzione di maschi da irraggiare, si ritiene quindi opportuno mantenere la nuova dieta testata che garantisce una spettro nutritivo più ampio e completo alle larve in allevamento. L’aggiunta di ATP nel pasto di sangue delle femmine adulte non sarà impiegato in quanto troppo costoso e significativamente poco produttivo nel garantire un aumento del numero di uova prodotte. 2. Prove di irraggiamento Oltre alla sopravvivenza e alla sterilità, la scelta dello stadio di sviluppo più conveniente da irraggiare in un programma SIT dipende dalla possibilità di maneggiare in sicurezza grandi quantità di insetti senza danneggiarli durante tutte le fasi che intercorrono tra l’allevamento massale, l’irraggiamento e il lancio in campo. La fase pupale risulta sicuramente più vantaggiosa per il maggior numero di pupe irraggiabili per unità di volume e per il minimo danneggiamento arrecabile all'insetto che viene mantenuto in acqua durante tutte le procedure. La possibilità di lavorare con la minima dose radiante efficace, significa ridurre lo stress provocato inevitabilmente alle pupe maschio, che si manifesta nell’adulto con una ridotta longevità, una diminuita capacità di accoppiamento o di ricerca del partner e attraverso possibili alterazioni comportamentali che possono rendere il maschio inattivo o inefficace una volta introdotto in campo. I risultati ottenuti sottoponendo pupe maschili a irraggiamento a differenti ore dall’impupamento evidenziano come la maturità del campione influisca sia sulla mortalità delle pupe che sull’efficacia sterilizzante dell’irraggiamento. Come riportato anche da Wijeyaratne (1977) le pupe più vecchie mostrano una minore mortalità e una maggiore sensibilità alle radiazioni rispetto a quelle più giovani. In particolare si è osservato come pupe maschili di età superiore 24h fossero maggiormente sensibili all’irraggiamento riportando minore perdita di competitività rispetto alle pupe irraggiate precocemente. La minore dose impiegata per il raggiungimento della sterilità con minimi effetti sulla longevità dei maschi trattati e con livelli di fecondità e fertilità indotti sulle femmine non differenti dal testimone, corrisponde a 40Gy (Cs 137 - 2,3 Gy/min). Analizzando la sopravvivenza dei maschi, si osserva una tendenza all'aumento della mortalità in funzione dell’aumento della dose fornita per tutte le età pupali di irraggiamento testate. Per trattamenti condotti su pupe di età > 30h la longevità dei maschi non risente dell’irraggiamento fino a dosi di 40Gy. La fecondità delle femmine accoppiatesi con maschi irraggiati con dosi superiori a 40Gy mostra una tendenza alla riduzione del numero di uova prodotte con l’aumentare della dose ricevuta dal maschio. L’irraggiamento delle pupe non determina variazioni significative nei tempi di sfarfallamento degli adulti per le diverse dosi radianti fornite e per le differenti età pupali testate in rapporto al testimone. L’irraggiamento influenza al contrario i tempi di rotazione dei genitali esterni dei maschi evidenziando un ritardo proporzionale alla dose ricevuta. Resta da definire sui maschi irraggiati l’effetto combinato dei due effetti sui tempi di sfarfallamento degli adulti anche se appare chiara l’assenza di variazioni significative per la dose di irraggiamento 40Gy scelta come radiazione utile per la sterilizzazione dei maschi da lanciare in campo. Per quanto riguarda l’analisi dei tempi di accoppiamento dei maschi irraggiati si osserva in generale una minore reattività rispetto ai maschi fertili particolarmente marcata nei maschi irraggiati a dosi superiori i 40 Gy. Gli studi condotti sui tempi di accoppiamento delle femmine evidenziano una buona recettività (>80%) all’accoppiamento solo per femmine di età superiore a 42 - 48 h femmine. Prima di tale periodo la femmina realizza accoppiamenti con normale appaiamento dei due sessi ma non riceve il trasferimento degli spermi. 3. Prove di competizione Prove preliminari di competizione in tunnel svolte nel 2006 su ceppi selvatici e di allevamento avevano mostrato risultati di competitività dei maschi sterili (50 Gy) segnati da forte variabilità. Nel 2007 dopo aver condotto analisi per la verifica dei tempi di sfarfallamento, di accoppiamento e di rotazione genitale nei maschi sterilizzati, e di recettività nelle femmine, sono state realizzate nuove prove. In queste prove maschi adulti di Ae. albopictus irraggiati a 40Gy sono stati posizionati in campo, in ambiente naturale ombreggiato ed isolato, all’interno di serre (8x5x2,8 m) insieme a maschi adulti fertili e femmine vergini di Ae. albopictus con rapporto 1:1:1. Le prove preliminari 2006 erano condotte con le medesime condizioni sperimentali del 2007 ad eccezione dei tempi di inserimento delle femmine vergini passati da 1 giorno nel 2006, a 3 giorni nel 2007 dall’immissione dei maschi in tunnel. Sono state effettuate prove testando la competizione tra esemplari provenienti da ceppi di allevamento (cicli di allevamento in gabbia > 15), ceppi selvatici (da materiale raccolto in campo e con cicli di allevamento in gabbia < 5) e ceppi ibridi (ottenuti dall’incrocio di ceppi italiani di diversa provenienza geografica). I risultati ottenuti mostrano indici di competizioni medi accettabili senza evidenziare differenza fra i ceppi impiegati. L’allevamento massale quindi non deprime i ceppi allevati e gli ibridi realizzati non mostrano una vigoria superiore ne rispetto ai ceppi selvatici ne rispetto agli allevati in laboratorio.

Identificazione e valutazione delle opere incongrue in specifici contesti urbani

La ricerca si propone d’indagare sul concetto di “congruità” riferito alle trasformazioni di specifici contesti urbani, e di definire quindi un metodo “non arbitrario” per la valutazione di opere esistenti o in progetto, al fine di riconoscerne il carattere di congruità o, al contrario, d’incongruità. Interventi d’inserimento e di trasformazione, alla scala del comparto urbanistico o anche alla scala edilizia, possono presentarsi come congrui o incongrui rispetto all’identità del luogo di appartenenza (organismo a scala urbana o territoriale). Congrua risulta l’opera che non si pone in (conclamato) contrasto rispetto ai caratteri identitari del contesto. Le definizioni d’incongruità e di opera incongrua, divengono il metro di giudizio del rapporto tra un intervento ed il suo contesto, e si applicano mediante una valutazione che sia metodologicamente fondata e verificata. La valutazione di congruità-incongruità può riferirsi a opere esistenti già realizzate, oppure a progetti di nuove opere; in questo secondo approccio il metodo di valutazione si configura come linea-guida per l’orientamento del progetto stesso in termini di congruità rispetto al contesto. In una fase iniziale la ricerca ha fissato i principi di base, con la definizione di ciò che deve intendersi per congruità e per profilo di congruità. La specifica di congruità, non potendosi basare su una consolidata letteratura (il concetto nei termini descritti è stato introdotto dalla legge 16/2002 della Regione Emilia-Romagna; la Regione stessa riconosce che il concetto è in fase di precisazione tramite sperimentazioni, studi e interventi pilota), muove dallo studio dei concetti di luogo, caratteri del luogo, identità del luogo, contesto urbano, trasformazione dell’ambiente costruito, tutela del patrimonio edilizio, sviluppo tipologico, e superfetazione incongrua. Questi concetti, pur mutuati da ambiti di ricerca affini, costituiscono i presupposti per la definizione di congruità delle trasformazioni di contesti urbani, rispetto all’identità del luogo, tramite la tutela e valorizzazione dei suoi caratteri tipologici costitutivi. Successivamente, la ricerca ha affrontato l’analisi di taluni casi-tipo di opere incongrue. A tale scopo sono stati scelti quattro casi-tipo d’interventi per rimozione di opere ritenute incongrue, indagando la metodologia di valutazione di congruità in essi applicata. Inoltre è stata sperimentata l’applicazione del metodo di valutazione per “categorie di alterazioni” tramite lo studio del centro storico di Reggio Emilia, assunto come contesto urbano campione. Lo studio analitico è sviluppato attraverso l’indagine del rapporto tra edifici e caratteri del contesto, individuando e classificando gli edifici ritenuti incongrui. Qui sono emersi i limiti del metodo di individuazione delle incongruità per categorie di alterazioni; di fatto le alterazioni definite a priori rispetto al contesto, determinano un giudizio arbitrario, in quanto disancorato dai caratteri del luogo. La definizione di ciò che è congruo o incongruo deve invece riferirsi a uno specifico contesto, e le alterazioni dei caratteri che rappresentano l’identità del luogo non possono definirsi a priori generalizzandone i concetti. Completando la ricerca nella direzione del risultato proposto, si è precisato il metodo di valutazione basato sulla coincidenza dei concetti di congruità e di pertinenza di fase, in rapporto allo sviluppo tipologico del contesto. La conoscenza del contesto nei suoi caratteri tipologici, è già metodo di valutazione: nella misura in cui sia possibile effettuare un confronto fra contesto ed opera da valutare. La valutazione non si pone come vincolo all’introduzione di nuove forme che possano rappresentare un’evoluzione dell’esistente, aggiornando il processo di sviluppo tipologico in relazione alle mutazioni del quadro esigenzialeprestazionale, ma piuttosto come barriera alle trasformazioni acritiche nei confronti del contesto, che si sovrappongano o ne cancellino inconsapevolmente i segni peculiari e identitari. In ultima analisi, ai fini dell’applicabilità dei concetti esposti, la ricerca indaga sulla convergenza tra metodo proposto e possibili procedure applicative; in questo senso chiarisce come sia auspicabile definire la congruità in relazione a procedure valutative aperte. Lo strumento urbanistico, inteso come sistema di piani alle diverse scale, è l’ambito idoneo a recepire la lettura della stratificazione dei segni indentitari rilevabili in un contesto; lettura che si attua tramite processi decisionali partecipati, al fine di estendere alla collettività la definizione d’identità culturale del luogo. La valutazione specifica di opere o progetti richiede quindi una procedura aperta, similmente alla procedura di valutazione in vigore presso le soprintendenze, basandosi sul concetto di responsabilità del progettista e del valutatore, in riferimento alla responsabilità della collettività, espressa invece nello strumento urbanistico. Infatti la valutazione di tipo oggettivo, basata sul riferimento a regolamenti o schemi precostituiti, confligge con il senso della valutazione metodologicamente fondata che, al contrario, è assunto teorico basilare della ricerca.

Teoria e applicazioni sul tema della logistica urbana

Il tema della Logistica Urbana è un argomento complesso che coinvolge diverse discipline. Infatti, non è possibile affrontare la distribuzione delle merci da un solo punto di vista. Da un lato, infatti, manifesta l’esigenza della città e della società in generale di migliorare la qualità della vita anche attraverso azioni di contenimento del traffico, dell’inquinamento e degli sprechi energetici. A questo riguardo, è utile ricordare che il trasporto merci su gomma costituisce uno dei maggiori fattori di impatto su ambiente, sicurezza stradale e congestione della viabilità urbana. Dall’altro lato vi sono le esigenze di sviluppo economico e di crescita del territorio dalle quali non è possibile prescindere. In questa chiave, le applicazioni inerenti la logistica urbana si rivolgono alla ricerca di soluzioni bilanciate che possano arrecare benefici sociali ed economici al territorio anche attraverso progetti concertati tra i diversi attori coinvolti. Alla base di tali proposte di pratiche e progetti, si pone il concetto di esternalità inteso come l’insieme dei costi esterni sostenuti dalla società imputabili al trasporto, in particolare al trasporto merci su gomma. La valutazione di questi costi, che rappresentano spesso una misurazione qualitativa, è un argomento delicato in quanto, come è facile immaginare, non può essere frutto di misure dirette, ma deve essere dedotto attraverso meccanismi inferenziali. Tuttavia una corretta definizione delle esternalità definisce un importante punto di partenza per qualsiasi approccio al problema della Logistica Urbana. Tra gli altri fattori determinanti che sono stati esplorati con maggiore dettaglio nel testo integrale della tesi, va qui accennata l’importanza assunta dal cosiddetto Supply Chain Management nell’attuale assetto organizzativo industriale. Da esso dipendono approvvigionamenti di materie prime e consegne dei prodotti finiti, ma non solo. Il sistema stesso della distribuzione fa oggi parte di quei servizi che si integrano con la qualità del prodotto e dell’immagine della Azienda. L’importanza di questo settore è accentuata dal fatto che le evoluzioni del commercio e l’appiattimento dei differenziali tra i sistemi di produzione hanno portato agli estremi la competizione. In questa ottica, minimi vantaggi in termini di servizio e di qualità si traducono in enormi vantaggi in termini di competitività e di acquisizione di mercato. A questo si aggiunge una nuova logica di taglio dei costi che porta a ridurre le giacenze di magazzino accorciando la pipeline di produzione ai minimi termini in tutte le fasi di filiera. Naturalmente questo si traduce, al punto vendita in una quasi totale assenza di magazzino. Tecnicamente, il nuovo modello di approvvigionamento viene chiamato just-in-time. La ricerca che è stata sviluppata in questi tre anni di Dottorato, sotto la supervisione del Prof. Piero Secondini, ha portato ad un approfondimento di questi aspetti in una chiave di lettura ad ampio spettro. La ricerca si è quindi articolata in 5 fasi: 1. Ricognizione della letteratura italiana e straniera in materia di logistica e di logistica urbana; 2. Studio delle pratiche nazionali ed europee 3. Analisi delle esperienze realizzate e delle problematiche operative legate ai progetti sostenuti dalla Regione Emilia Romagna 4. Il caso di studio di Reggio Emilia e redazione di più proposte progettuali 5. Valutazione dei risultati e conclusioni Come prima cosa si è quindi studiata la letteratura in materia di Logistica Urbana a livello nazionale. Data la relativamente recente datazione dei primi approcci nazionali ed europei al problema, non erano presenti molti testi in lingua italiana. Per contro, la letteratura straniera si riferisce generalmente a sistemi urbani di dimensione e configurazione non confrontabili con le realtà nazionali. Ad esempio, una delle nazioni che hanno affrontato per prime tale tematica e sviluppato un certo numero di soluzioni è stata il Giappone. Naturalmente, città come Tokyo e Kyoto sono notevolmente diverse dalle città europee ed hanno necessità ed esigenze assai diverse. Pertanto, soluzioni tecnologiche e organizzative applicate in questi contesti sono per la maggior parte inattuabili nei contesti del vecchio continente. Le fonti che hanno costituito maggiore riferimento per lo sviluppo del costrutto teorico della tesi, quindi, sono state i saggi che la Regione Emilia Romagna ha prodotto in occasione dello sviluppo del progetto City Ports di cui la Regione stessa era coordinatore di numerosi partners nazionali ed europei. In ragione di questo progetto di ricerca internazionale, l’Emilia Romagna ha incluso il trattamento della logistica delle merci negli “Accordi di Programma per il miglioramento della qualità dell’aria” con le province ed i capoluoghi. In Questo modo si è posta l’attenzione sulla sensibilizzazione delle Pubbliche Amministrazioni locali verso la mobilità sostenibile anche nell’ambito di distribuzione urbana delle merci. Si noti infatti che l’impatto sulle esternalità dei veicoli leggeri per il trasporto merci, quelli cioè che si occupano del cosiddetto “ultimo miglio” sono di due ordini di grandezza superiori rispetto a quelli dei veicoli passeggeri. Nella seconda fase, la partecipazione a convegni di ambito regionale e nazionale ha permesso di arricchire le conoscenze delle best-practice attuate in Italia per lo sviluppo di strumenti finalizzati ad condividere i costi esterni della mobilità delle merci con gli operatori logistici. In questi contesti è stato possibile verificare la disponibilità di tre linee di azione sulle quali, all’interno del testo della tesi si farà riferimento molto spesso: - linea tecnologica; - linea amministrativa; - linea economico/finanziaria. Nel discutere di questa tematica, all’interno di questi contesti misti in cui partecipavano esponenti della cultura accademica, delle pubbliche amministrazioni e degli operatori, ci si è potuti confrontare con la complessità che il tema assume. La terza fase ha costituito la preparazione fondamentale allo studio del caso di studio. Come detto sopra, la Regione Emilia Romagna, all’interno degli Accordi di Programma con le Province, ha deliberato lo stanziamento di co-finanziamenti per lo sviluppo di progetti, integrati con le pratiche della mobilità, inerenti la distribuzione delle merci in città. Inizialmente, per tutti i capoluoghi di provincia, la misura 5.2 degli A.d.P. prevedeva la costruzione di un Centro di Distribuzione Urbana e l’individuazione di un gestore dei servizi resi dallo stesso. Successive considerazioni hanno poi portato a modifiche della misura lasciando una maggiore elasticità alle amministrazioni locali. Tramite una esperienza di ricerca parallela e compatibile con quella del Dottorato finanziata da un assegno di ricerca sostenuto dall’Azienda Consorziale Trasporti di Reggio Emilia, si è potuto partecipare a riunioni e seminari presentati dalla Regione Emilia Romagna in cui si è potuto prendere conoscenza delle proposte progettuali di tutte le province. L’esperienza di Reggio Emilia costituisce il caso di studio della tesi di Dottorato. Le molteplici problematiche che si sono affrontate si sono protratte per tempi lunghi che hanno visto anche modifiche consistenti nell’assetto della giunta e del consiglio comunali. Il fatto ha evidenziato l’ennesimo aspetto problematico legato al mantenimento del patrimonio conoscitivo acquisito, delle metodiche adottate e di mantenimento della coerenza dell’impostazione – in termini di finalità ed obiettivi – da parte dell’Amministrazione Pubblica. Essendo numerosi gli attori coinvolti, in un progetto di logistica urbana è determinante per la realizzazione e la riuscita del progetto che ogni fattore sia allineato e ben informato dell’evoluzione del progetto. In termini di programmazione economica e di pianificazione degli interventi, inoltre, la pubblica amministrazione deve essere estremamente coordinata internamente. Naturalmente, questi sono fattori determinanti per ogni progetto che riguarda le trasformazioni urbane e lo sviluppo delle città. In particolare, i diversi settori (assessorati) coinvolti su questa tematica, fanno o possno fare entrare in situazioni critiche e rischiose la solidità politica dello schieramento di maggioranza. Basti pensare che la distribuzione delle merci in città coinvolge gli assessorati della mobilità, del commercio, del centro storico, dell’ambiente, delle attività produttive. In funzione poi delle filiere che si ritiene di coinvolgere, anche la salute e la sicurezza posso partecipare al tavolo in quanto coinvolte rispettivamente nella distribuzione delle categorie merceologiche dei farmaci e nella security dei valori e della safety dei trasporti. L’esperienza di Reggio Emilia è stata una opportunità preziosissima da molteplici punti di vista. Innanzitutto ha dato modo di affrontare in termini pratici il problema, di constatare le difficoltà obiettive, ad esempio nella concertazione tra gli attori coinvolti, di verificare gli aspetti convergenti su questo tema. Non ultimo in termini di importanza, la relazione tra la sostenibilità economica del progetto in relazione alle esigenze degli operatori commerciali e produttivi che ne configurano gli spazi di azione. Le conclusioni del lavoro sono molteplici. Da quelle già accennate relative alla individuazione delle criticità e dei rischi a quelle dei punti di forza delle diverse soluzioni. Si sono affrontate, all’interno del testo, le problematiche più evidenti cercando di darne una lettura costruttiva. Si sono evidenziate anche le situazioni da evitare nel percorso di concertazione e si è proposto, in tal proposito, un assetto organizzativo efficiente. Si è presentato inoltre un modello di costruzione del progetto sulla base anche di una valutazione economica dei risultati per quanto riguarda il Business Plan del gestore in rapporto con gli investimenti della P.A.. Si sono descritti diversi modelli di ordinanza comunale per la regolamentazione della circolazione dei mezzi leggeri per la distribuzione delle merci in centro storico con una valutazione comparativa di meriti ed impatti negativi delle stesse. Sono inoltre state valutate alcune combinazioni di rapporto tra il risparmio in termini di costi esterni ed i possibili interventi economico finanziario. Infine si è analizzato il metodo City Ports evidenziando punti di forza e di debolezza emersi nelle esperienze applicative studiate.

Mechanisms of cell senescence: p21 and DNA damage response in aging and longevity

Theory of aging postulates that aging is a remodeling process where the body of survivors progressively adapts to internal and external damaging agents they are exposed to during several decades. Thus , stress response and adaptation mechanisms play a fundamental role in the aging process where the capability of adaptating effects, certainly, also is related the lifespan of each individual. A key gene linking aging to stress response is indeed p21, an induction of cyclin-dependent kinase inhibitor which triggers cell growth arrest associated with senescence and damage response and notably is involved in the up-regulation of multiple genes that have been associated with senescence or implicated in age-related . This PhD thesis project that has been performed in collaboration with the Roninson Lab at Ordway Research Institute in Albany, NY had two main aims: -the testing the hypothesis that p21 polymorphisms are involved in longevity -Evaluating age-associated differences in gene expression and transcriptional response to p21 and DNA damage In the first project, trough PCR-sequencing and Sequenom strategies, we we found out that there are about 30 polymorphic variants in the p21 gene. In addition, we found an haplotpype located in -5kb region of the p21 promoter whose frequency is ~ 2 fold higher in centenarians than in the general population (Large-scale analysis of haplotype frequencies is currently in progress). Functional studies I carried out on the promoter highilighted that the ―centenarian‖ haplotype doesn’t affect the basal p21 promoter activity or its response to p53. However, there are many other possible physiological conditions in which the centenarian allele of the p21 promoter may potentially show a different response (IL6, IFN,progesterone, vitamin E, Vitamin D etc). In the second part, project #2, trough Microarrays we seeked to evaluate the differences in gene expression between centenarians, elderly, young in dermal fibroblast cultures and their response to p21 and DNA damage. Microarray analysis of gene expression in dermal fibroblast cultures of individuals of different ages yielded a tentative "centenarian signature". A subset of genes that were up- or downregulated in centenarians showed the same response to ectopic expression of p21, yielding a putative "p21-centenarian" signature. Trough RQ-PCR (as well Microarrays studies whose analysis is in progress) we tested the DNA damage response of the p21-centenarian signature genes showing a correlation stress/aging in additional sets of young and old samples treated with p21-inducing drug doxorubicin thus finding for a subset of of them , a response to stress age-related.