Molecular phylogenies, chromosomes and dispersion in Brazilian akodontines (Rodentia, Sigmodontinae)

Uma nova filogenia molecular para roedores akodontinos do Brasil é proposta. A árvore filogenética foi enriquecida com a área de ocorrência e com informações sobre o cariótipo das amostras. Baseado nisto, e com a metodologia descrita, foram propostas hipóteses sobre as características do cariótipo e sobre a área de ocorrência dos ancestrais de cada clado. Assim, foi possível discutir hipóteses sobre evolução cromossômica do grupo, e sobre eventos de dispersão a partir da área de diferenciação original dos akodontinos nos Andes. A evolução cromossômica começou com números diplóides altos (2n=52) e mostrou uma tendência a redução (até 2n=14 em clados mais recentes). Ramos independentes da árvore mostraram redução do 2n e num caso aumentou o numero diplóide. Foram propostos pelo menos quatro eventos de dispersão dos Andes até o Brasil Sul-Oriental. Os resultados indicam a direção de novos estudos em cariologia comparada.

Sistemática molecular e filogeografia do gênero Phoenicircus Swainson, 1832 (Aves: Cotingidae)

Muitas hipóteses já foram propostas na tentativa de explicar a origem e manutenção da grande biodiversidade encontrada na Amazônia, entretanto poucas são passíveis de serem testadas sob um ponto de vista filogeográfico. Nós avaliamos padrões de diversificação temporal e espacial de duas espécies de aves endêmicas da região amazônica, as quais apresentam populações alopátricas restritas a diferentes áreas de endemismo e limitadas pelos principais rios da bacia Amazônica. Sequências de dois genes mitocondriais (ND2 e Cytb) e dois nucleares (βf7 e G3PDH intron 11) foram obtidas a partir de 30 indivíduos, abrangendo a área de distribuição total do gênero Phoenicircus e incluindo as duas espécies atualmente válidas P. carnifex e P. nigricollis. A utilização de ferramentas da filogeografia, aliadas a métodos de genética populacional e de datação molecular, nos permitiu reconstruir os contextos espacial e temporal do processo de diversificação destes táxons na região Amazônica, bem como fazer predições sobre sua história geográfica e ambiental. Nossos dados revelaram a existência de quatro grupos geneticamente distintos, evidenciando o status parafilético de P. carnifex e a monofilia recíproca entre as duas populações alopátricas de P. nigricollis, e sugeriram, portanto, alterações na taxonomia atualmente aplicada ao gênero Phoenicircus. A história de evolução de Phoenicircus parece ter sido delineada por dois tipos de eventos vicariantes, inicialmente pela formação dos principais rios da Amazônia, durante os períodos Plio-Pleistoceno, e mais recentemente por eventos de captura de drenagem resultantes da atividade de placas neotectônicas localizadas na região central amazônica, destacando a importância de processos históricos como estes na modelagem da biota Amazônica atual.

Epidemiologia molecular das infecções por rotavírus G2 ao longo de 16 anos (1992 a 2008) na região amazônica, Brasil

No Brasil, estima-se que os rotavírus causem 3.352.053 episódios de diarreia, 655.853 ambulatoriais, 92.453 hospitalizações e 850 mortes envolvendo crianças menores de 5 anos de idade. Os rotavírus pertencem à família Reoviridae, gênero Rotavirus. A partícula viral é constituída por três camadas proteicas concêntricas e pelo genoma viral reunindo 11 segmentos de RNA com dupla fita. Reconhecem-se 23 genótipos G e 31 genótipos P. Dentre os genótipos G detectados até o momento, o G2 atua como um dos mais importantes, estando geralmente associado ao genótipo P[4]. Nos últimos três anos se tem observado em larga escala global a reemergência do genótipo G2, sendo um dos mais detectados nos anos que sucederam a implantação da vacina contra rotavírus, particularmente no Brasil. Este estudo teve como objetivo a caracterização molecular de amostras do tipo G2 obtidas de crianças participantes de estudos em gastroenterites virais na região amazônica, Brasil, no período de 1992 a 2008. Foram selecionadas 53 amostras positivas para rotavírus genótipo G2 que foram sequenciadas para VP7 e 38 para VP4. Inicialmente, as amostras foram genotipadas por RT-PCR e seus produtos purificados, quantificados e sequenciados. As amostras também foram testadas quanto ao perfil de migração dos segmentos de RNA. As sequências obtidas dos genes VP4 e VP7 foram alinhadas e editadas no programa Bioedit (v.6.05) e comparadas a outras sequências de RV registradas no banco de genes utilizando o programa BLAST. A árvore filogenética foi feita utilizando o programa Mega 2.1. Do total de 53 amostras sequenciadas para o gene VP7, a análise filogenética revelou a existência de duas linhagens (II e III) e três sublinhagens (IIa, IIc, IId) que circularam em períodos diferentes na população. Amostras das sub-linhagem IIa e IIc apresentaram mutação na posição no aminoácido da posição 96 (Asp/ Asn) . Essa modificação pode resultar em uma alteração conformacional dos epítopos reconhecidos por anticorpos neutralizantes. As linhagens de G2 que circularam em Belém foram idênticas àquelas de outros Estados da região amazônica envolvidos no estudo. O gene VP[4] foi sequenciado na região da VP8*, sendo 36 pertencentes do genótipo P[4] e 3 ao P[6]. No genótipo P[4] foi identificada a circulação de duas linhagens, P[4]-4 ocorrendo nos anos de 1998-2000, e P[4]-5 que circulou nos períodos de 1993-1994 e 2006-2008. Nossos resultados reforçam dados de ocorrência continental que evidenciam a reemergência do genótipo G2 com a variante gênica IIc, a qual se estabeleceu na população em associação com o genótipo P[4]-5. A grande homologia entre as cepas de G2 que circularam entre os diferentes estados envolvidos no estudo sugere que as mutações registradas ultrapassaram barreiras geográficas e temporais.

Detecção molecular do Papilomavirus humano (HPV) em amostras teciduais de tumores da mama

A neoplasia maligna da mama é uma das principais causa de mortalidade feminina, considerada como problema de saúde pública. Neste trabalho pesquisamos a presença do Papilomavírus Humano (HPV) nos tumores mamários benignos e malignos e em amostras de tecido mamário normal. Foi utilizada a técnica da Reação em Cadeia de Polimerase (PCR) para detecção molecular do DNA HPV em 63 pacientes, assim distribuídas: 28 tumores malignos, 17 tumores benignos e 18 amostras de tecido retro areolar de mamas normais. Os nossos resultados revelaram positividade para a seqüência do DNA HPV em 11 amostras, todas pertencentes às portadoras de tumores malignos: 17,4% de todas as amostras e 39,2% dos tumores malignos. Todos os tumores positivos revelaram DNA HPV para os tipos oncogênicos 16 e/ou 18, não foi detectado DNA HPV 06 e 11. Os resultados demonstraram elevada positividade para os receptores hormonais nas amostras positivas examinadas e apresentaram um seguimento com prevalência de eventos desfavoráveis como recidivas loco-regionais, metástases e óbito nas portadoras de DNA HPV. Os achados ratificam os dados encontrados na literatura, mostrando uma possível participação deste vírus no desenvolvimento do câncer de mama e possível contribuição desfavorável na evolução clínica.

Caracterização molecular e relação filogenética do genoma completo dos arbovírus Bussuquara, Iguape, Ilhéus e Rocio (Família Flaviviridae, Gênero Flavivirus)

Os flavivírus são conhecidos por seu complexo ciclo biológico e importância na saúde pública e na economia mundial. Os aspectos ecológicos e quadros clínicos estão estreitamente relacionados à filogenia e evolução dos flavivírus. Este trabalho objetiva a caracterização molecular dos genomas dos flavivírus Bussuquara (VBSQ), Iguape (VIGU), Ilhéus (VILH) e Rocio (VROC), determinando relações filogenéticas com os demais integrantes do gênero Flavivirus. Foi realizado o seqüenciamento completo da região codificadora (ORF) e regiões não codificantes (RNC) 5’ e 3’; análise da estrutura secundária do RNA viral e das sequências conservadas da 3’RNC; determinação dos sítios de clivagem, glicosilação, resíduos Cis e motivos conservados na poliproteína; e as análises de similaridade e filogenética. Os genomas dos VBSQ, VIGU, VILH e VROC apresentaram a mesma organização que os demais flavivírus, medindo 10.815 nt, 10.922 nt, 10.775 nt, 10.794 nt, respectivamente. O padrão das sequências conservadas da 3’RNC do VBSQ foi RCS2-CS2-CS1, enquanto que para os VIGU, VILH e VROC foram CS3-RCS2-CS2-CS1. As características das estruturas secundárias do RNAs dos flavivírus em estudo foram similares aos demais flavivírus. O número dos sítios de glicosilação das proteínas PrM, E e NS1 foi distinto entre os flavivírus brasileiros, porém o padrão 6,12,12 dos resíduos de Cis e do sítios de clivagem permaneceram conservados. Na proteína E, alterações aminoacídicas pontuais foram observadas no peptídeo de fusão dos VBSQ, VIGU e VROC, e a sequência do tripepídeo RGD foi distinta para os quatro vírus em estudo. Os motivos determinantes das atividades de MTase-SAM da NS5, bem como da helicase e protease da NS3, permanecem conservados. Dentre os oito motivos da polimerase viral (NS5), somente os motivos V, VI e VII possuem alguma substituição nucleotídica para o VILH e VROC. As análises de similaridade mostram que VBSQ apresenta maior relação com VIGU enquanto que o VILH e VROC são mais relacionados entre si, porém sendo consideradas espécies virais distintas. Com base nas análises filogenéticas, características moleculares do genoma e biológicas, propõem-se a formação de três grupos genéticos: o grupo Rocio, que agrupa VROC e VILH; o grupo Bussuquara formado pelos VBSQ e Vírus naranjal e o grupo Aroa que inclui o Vírus Aroa e VIGU.

Estudo genotípico de Trypanosoma cruzi: epidemiologia e caracterização molecular de isolados do homem, triatomíneos e mamíferos silvestres do Pará, Amapá e Maranhão

A doença de Chagas aguda (DCA) é endêmica na Amazônia Brasileira sendo a via oral a principal forma de transmissão com surtos familiares ou multifamiliares. Esta via independe da colonização de triatomíneos no domicílio e a ocorrência é regular com média de 100 casos/ano e 5% de óbitos. Apresenta distribuição espaço-temporal bem definida, colocando a enfermidade como emergência de importância em saúde pública nos estados do Pará, Amapá e Amazonas. A presença de mamíferos e triatomíneos silvestres, infectados naturalmente com o c e habitando distintos ecótopos terrestres e arbóreos, mantém um intenso ciclo enzoótico em toda a Amazônia. Perfis moleculares de linhagens de T. cruzi na região estão associados a hospedeiros mamíferos (incluindo o homem), triatomíneos, ecótopos e manifestações clínicas. Foram estudados quatro surtos de DCA ocorridos nos Municípios de Barcarena, Belém e Cachoeira do Arari no Estado do Pará e em Santana, no Estado do Amapá e abordados os aspectos epidemiológicos (parasitológico e sorológico manifestações clínicas, reservatórios e triatomíneos silvestres associados aos surtos). Foi investigado também em São Luís, Estado do Maranhão, o ciclo domiciliar e silvestre do T. cruzi, porém sem a ocorrência de casos de DCA. O estudo incluiu também a genotipagem molecular de T. cruzi pelo gene de mini-exon dos isolados (homem, mamíferos e triatomíneos silvestres) associados aos diferentes ciclos de transmissão. O diagnóstico parasitológico foi confirmado em 63 pacientes com a seguinte sensibilidade nos testes aplicados: 41,3% (26/63) pela gota espessa; 58,7% (37/63) no QBC; 79,4% (50/63) no xenodiagnóstico e 61,9% (39/63) na hemocultura. A sorologia de 2648 pessoas por hemaglutinação indireta (HAI) foi de 3,05% (81/2648) e imunofluorescência indireta IFI apresentaram respectivamente resultados de e 2,49% (66/2648) para IgG e 2,37 (63/2648) para IgM. Os resultados em São Luís foram todos negativos. Foram capturados 24 mamíferos, 13 Didelphis marsupialis, 1 Marmosa cinerea, 5 Philander opossum, 3 Metachirus nudicaudatus, 1 Oryzomys macconnelli, 1 Oecomys bicolor e 433 R. rattus. A taxa de infecção para T. cruzi foi de 7,14% (29/404). Um total de 3279 triatomíneos foi capturado sendo: Triatoma rubrofasciata (n=3008), com taxa de infecção (TI) de 30.46%, (39/128), Rhodnius robustus (n=137), com TI de 76% (79/104), R. pictipes (n=94), TI de 56,9% (49/86%), E. mucronatus (n=6) e P. geniculatus (n=12) com TI de 50% e as demais espécies sem infecção R. neglectus (n=5) e P. lignarius (n=6). As palmeiras foram os principais ecótopos dos triatomíneos silvestres. O urucurizeiro (S. martiana) apresentava infestação de 47,41% (101/213) dos triatomíneos; o “inajazeiro” (Maximiliana regia) 35,21% (75/213); o “babaçueiro” (Orbgnya. speciosa) 5,16% (11/213); o “dendezeiro” (Eleas melanoccoca) 1,87% (4/213) e a “bacabeira” (Oenocarpus bacaba) 10,32% (22/213). Para a genotipagem foram obtidos 46 isolados de tripanossomas de origem humana, 31 isolamentos de mamíferos silvestres e 74 amostras de triatomíneos. Todos os isolados foram caracterizados como da linhagem TcI de T. cruzi. Todos os casos humanos no Pará foram caracterizados como positivos por exame parasitológico. Nem todos os casos de Santana, Amapá, apresentaram casos parasitológicos positivos, pela demora do diagnóstico, mesmo assim estes foram definidos como DCA. Exames como xenodiagnóstico, hemocultura e o QBC® foram mais sensíveis do que a gota espessa. A sorologia por HAI e IFI (IgG e IgM) tiveram excelente sensibilidade para detectar os casos agudos em tempos distintos de infecção. O achado de mamíferos (D. marsupilais) e triatomíneos silvestres (R. pictipes e P. geniculatus) infectados com consideráveis taxas de infecção para T. cruzi no entorno das residências dos pacientes sustentam a importância destes hospedeiros associados à transmissão da DCA. Apesar de na Amazônia circularem vários genótipos de T. cruzi nos diferentes hospedeiros, neste trabalho foi identificada somente a linhagem TCI de T. cruzi, a mais predominante na Região. Em São Luís, Maranhão, embora sem registro de casos de DCA apresenta um ciclo domiciliar associados ao rato doméstico e o triatomíneo da espécie T. rubrofasciata, e um ciclo silvestre mantido por didelfídeos. Nos dois ciclos circulam a linhagem TCI de T. cruzi. Estudos com marcadores de maior resolução com isolados de T. cruzi regionais podem ajudar a esclarecer os ciclos de transmissão, as rotas de contaminação e os hospedeiros envolvidos em casos de DCA na Amazônia.

Epidemiologia molecular do Vírus Oropouche (Bunyaviridae: Orthobunyavirus) na Amazônia brasileira

O Virus Oropouche (VORO; Bunyaviridae, Orthobunyavirus) é um dos mais importantes arbovírus que infecta humanos na Amazônia brasileira, e é causador da febre do Oropouche. Entre 1961 e 2009, um grande número de epidemias foi registrado em diferentes centros urbanos dos Estados Brasileiros do Acre, Amapá, Amazonas, Maranhão, Pará, Rondônia e Tocantins, e também no Panamá, Peru e Trinidad & Tobago. Este trabalho teve por objetivo desenvolver um estudo retrospectivo dos aspectos epidemiológicos e moleculares do VORO enfatizando sua distribuição, a dinâmica das epidemias ocorridas no período, bem como a dispersão de diferentes genótipos na América Latina e no Brasil como contribuição à epidemiologia molecular do VORO. Para tanto 66 isolamentos do VORO pertencentes ao acervo do Instituto Evandro Chagas foram propagados em camundongos e em cultura de células VERO, seguida da extração do RNA viral e obtenção do cDNA por RTPCR; os amplicons foram purificados e submetidos ao sequenciamento nucleotídico para análises moleculares e evolução, incluindo o rearranjo genético, estudo de relógio molecular e análise de dispersão viral. Foi demonstrada a presença de quatro linhagens distintas do VORO na Amazônia brasileira (genótipos I, II, III e IV), sendo os genótipos I e II, respectivamente os mais frequentemente encontrados em áreas da Amazônia ocidental e oriental. Esses e o genótipo III estão constantemente evoluindo, mediante o mecanismo “boom and boost” que resulta na emergência seguida de substituição das sublinhagens (subgenótipos) circulantes por outras mais recentes. O genótipo III do VORO, previamente encontrado somente no Panamá, foi descrito na Amazônia e Sudeste do Brasil. Os dados obtidos pela análise filogenética comparativa das topologias para os segmentos PRNA e MRNA sugerem que o VORO utiliza o rearranjo genético como mecanismo de geração de biodiversidade viral, sendo o genótipo I o mais estável e o II o mais instável e, portanto, mais sensível às pressões evolutivas; foi reconhecido um novo genótipo do VORO neste estudo em amostras isoladas em Manaus no ano de 1980, que foi denominado de genótipo IV. O estudo do relógio molecular mostrou que a emergência do VORO se deu no Estado do Pará provavelmente há 223 anos e daí ao longo dos anos se dispersou pela PanAmazônia bem como para o Caribe, sendo que o genótipo I foi o que originou os demais genótipos do VORO.

Divergent evolution and purifying selection of the H (FUT1) gene in New World monkeys (Primates, Platyrrhini)

In the present study, the coding region of the H gene was sequenced and analyzed in fourteen genera of New World primates (Alouatta, Aotus, Ateles, Brachyteles, Cacajao, Callicebus, Callithrix, Cebus, Chiropotes, Lagothrix, Leontopithecus, Pithecia, Saguinus, and Saimiri), in order to investigate the evolution of the gene. The analyses revealed that this coding region contains 1,101 nucleotides, with the exception of Brachyteles, the callitrichines (Callithrix, Leontopithecus, and Saguinus) and one species of Callicebus (moloch), in which one codon was deleted. In the primates studied, the high GC content (63%), the nonrandom distribution of codons and the low evolution rate of the gene (0.513 substitutions/site/MA in the order Primates) suggest the action of a purifying type of selective pressure, confirmed by the Z-test. Our analyses did not identify mutations equivalent to those responsible for the H-deficient phenotypes found in humans, nor any other alteration that might explain the lack of expression of the gene in the erythrocytes of Neotropical monkeys. The phylogenetic trees obtained for the H gene and the distance matrix data suggest the occurrence of divergent evolution in the primates.

Perfil genotípico de resistência do vírus Influenza A (H1N1) pandêmico aos inibidores da neuraminidase em pacientes procedentes da mesorregião de Belém no período de maio de 2009 a maio de 2012

O vírus Influenza é o responsável pela gripe, uma doença que ocasiona milhões de mortes e hospitalizações todos os anos. Nas infecções severas, especialmente em pessoas com risco para complicações, os antivirais tornam-se os principais meios para o manejo clínico, merecendo especial destaque os inibidores da neuraminidase (INAs). De fato, na pandemia de 2009 a Organização Mundial da Saúde (OMS) recomendou o uso do oseltamivir para o tratamento dos doentes. Porém, devido à evolução genética viral, surgiram cepas com mutações no gene codificador da neuraminidase (NA) responsáveis por substituições aminoacídicas que levam à resistência aos fármacos INAs. Assim, a OMS passou a recomendar a vigilância de resistência genotípica para os vírus Influenza. Este trabalho teve como objetivos verificar a ocorrência de mutações no gene codificador da NA dos vírus Influenza A (H1N1) pandêmico que possam estar relacionadas à resistência aos INAs em cepas circulantes na mesorregião metropolitana de Belém no período de maio de 2009 a maio de 2012 e analisar, através da modelagem de proteínas, as substituições aminoacídicas da NA que possam estar influenciando na conformação protéica. Durante o período de estudo, foram recebidas no Laboratório de Vírus Respiratórios 2619 amostras clínicas de pacientes que apresentavam sinais e sintomas de infecção respiratória aguda com até cinco dias de evolução. Para a detecção do genoma viral foi feita a extração do RNA viral, seguida de RT-PCR em tempo real utilizando marcadores específicos para Influenza A H1N1pdm, resultando em 744 (28,4%) positivas. Parte das amostras positivas foram então inoculadas em células MDCK. Para as amostras isoladas em cultura de células, foi feita uma nova extração do RNA viral seguida de uma RT-PCR e semi-nested (PCR) utilizando iniciadores específicos para o gene NA, e posterior análise em sequenciador automático ABI Prism 3130xl (Applied Biosystems). A modelagem molecular da NA foi realizada através dos softwares SWISS-MODEL, MODELLER 9.10, PROCHECK, VERIFY3D e PYMOL. A análise parcial das sequências da neuraminidase nas amostras sequenciadas mostrou que não houve a circulação de cepas de vírus H1N1pdm com a mutação H275Y, a principal envolvida na resistência ao oseltamivir. Porém, em duas amostras foi identificada a substituição D199N que já foi relatada em vários estudos mostrando uma possível associação com o aumento da resistência ao oseltamivir. As amostras de 2012 apresentaram duas substituições (V241I e N369K) que estão relacionadas com um possível papel na compensação dos efeitos negativos causados pela mutação H275Y. A modelagem molecular mostrou que na mutação D199N houve uma alteração na estrutura da proteína NA próxima ao sítio de ligação ao antiviral. A análise filogenética revelou que as amostras de 2012 formaram um cluster isolado, demonstrando uma variação muito mais temporal do que geográfica. Este representa o primeiro estudo de resistência dos vírus Influenza H1N1pdm na mesorregião metropolitana de Belém, representando um importante instrumento para que os profissionais de saúde adotem estratégias mais eficazes no manejo da doença e no desenvolvimento de novos fármacos anti-influenza.

Karyotypic evolution of ribosomal sites in buffalo subspecies and their crossbreed

Domestic buffaloes are divided into two group based on cytogenetic characteristics and habitats: the “river buffaloes” with 2n = 50 and the “swamp buffaloes”, 2n = 48. Nevertheless, their hybrids are viable, fertile and identified by a 2n = 49. In order to have a better characterization of these different cytotypes of buffaloes, and considering that NOR-bearing chromosomes are involved in the rearrangements responsible for the karyotypic differences, we applied silver staining (Ag-NOR) and performed fluorescent in situ hybridization (FISH) experiments using 18S rDNA as probe. Metaphases were obtained through blood lymphocyte culture of 21 individuals, including river, swamp and hybrid cytotypes. Ag-NOR staining revealed active NORs on six chromosome pairs (3p, 4p, 6, 21, 23, 24) in the river buffaloes, whereas the swamp buffaloes presented only five NOR-bearing pairs (4p, 6, 20, 22, 23). The F1 crossbreed had 11 chromosomes with active NORs, indicating expression of both parental chromosomes. FISH analysis confirmed the numerical divergence identified with Ag-NOR. This result is explained by the loss of the NOR located on chromosome 4p in the river buffalo, which is involved in the tandem fusion with chromosome 9 in this subspecies. A comparison with the ancestral cattle karyotype suggests that the NOR found on the 3p of the river buffalo may have originated from a duplication of ribosomal genes, resulting in the formation of new NOR sites in this subspecies.