Cinética da enzima alfa-galactosidase a e investigação de doença de fabry em pacientes hemodialisados

A Alfa-galactosidase A (α-Gal A) humana é uma enzima lisossômica que quando deficiente causa a doença de Fabry. A doença de Fabry é uma esfingolipidose cuja principal causa de morbi-mortalidade é a insuficiência renal crônica (IRC). O objetivo deste estudo foi a implantação de um protocolo laboratorial que permita o diagnóstico da doença de Fabry em plasma e leucócitos, além da análise das características cinéticas da enzima α-Gal A em plasma e busca ativa da doença em 25 indivíduos com IRC de causa desconhecida. Também foram avaliadas a reprodutibilidade e a estabilidade do método enzimático. A padronização dos ensaios foi realizada com o substrato fluorescente 4-metilumbeliferil-α-Dgalactopiranosídeo. A reprodutibilidade foi avaliada utilizando amostras de plasma aliquotadas a 4ºC, -20ºC e -70ºC, analisadas uma vez ao mês por 6 meses e a estabilidade da fluorescência por até 24 horas após o término do ensaio enzimático. A padronização permitiu a implantação de valores de referência da α-Gal A para o estado do Pará, de 4 a 28 nmoles/h/mL (plasma) e de 20 a 96 nmoles/h/mg proteína (leucócitos). A enzima α-Gal A se mostrou termolábil, visto que com apenas 1 minuto de pré-incubação das amostras a 60ºC, sua atividade decaiu 71,09%. Com relação ao tempo de incubação, a atividade enzimática apresentou uma disposição linear crescente entre 15 a 180 minutos de incubação. A α-Gal A apresentou maior atividade no pH 4,8, o Km encontrado para a α-Gal A foi de 1,007 mM e a Vmáx foi 30,9 nmoles/h/mL. A melhor temperatura de armazenamento de plasma até o ensaio enzimático é -20ºC, onde foi observada menor variação em um período máximo de 6 meses. O método enzimático utilizado é estável, mesmo após 24 horas do término do ensaio, em temperatura ambiente. Com relação aos pacientes com IRC de causa desconhecida, todos apresentaram valor de atividade da α-Gal A dentro dos parâmetros de referência e, portanto, nenhum foi diagnosticado com doença de Fabry. O entendimento da cinética da α-Gal A e do seu comportamento in vitro possibilita um melhor diagnóstico laboratorial da doença de Fabry gerando dados para futuras comparações com indivíduos afetados por mutações nesta enzima

Inibição da atividade da Tirosinase por análogos do ácido Kójico

A tirosinase é uma enzima chave para a biossíntese de melanina. É uma enzima “cobre-dependente” que pode existir em três estados intermediários: desoxi (Cu¹⁺ -Cu¹⁺), oxi (Cu ²⁺ - O² -Cu²⁺) e met (Cu²⁺) - Cu²⁺). Apresenta atividade bifuncional, pois oxida fenóis ou catecóis em seus o-difenóis correspondentes, sendo que o processo de oxidação de fenóis pode ser descrito por cinética de Michaelis-Menten. Distúrbios na tirosinase estão associados com hiperpigmentação e escurecimento enzimático de frutas e fungos. Assim a busca por substâncias de origem natural ou sintética capazes de regular o comportamento desta enzima é fator chave para o tratamento de tais desordens. Nesta perspectiva, no presente trabalho buscou-se analisar bioquimicamente a atividade anti-tirosinase de análogos do ácido kójico derivados de 4H- pironas (S-01, S-02, S-03 e S-04) e derivados de diidropirano [3, 2-b] cromenodionas (S-05, S-06, S-07 e S-08), quimicamente planejadas por modelagem molecular no LPDF, do ICEN da UFPA. A cinética das substâncias S-02, S-04, S-06, S-07 e S-08 apresentaram inibição do tipo competitiva, semelhante ao padrão de inibição do ácido kójico, com valores de Ki de 145,0 ± 20,0 μM; 64,0 ± 10,0 μM; 4,0 ± 0,0 μM; 6,0 ± 0,0 μM; 9,0 ± 0,0 μM, respectivamente, e de 5,0 ± 0,0 μM para o ácido kójico, enquanto a substância S-01 apresentou uma inibição do tipo mista (Ki = 999,0 ± 150,0 μM). Já as substâncias S-03 e S-05 não apresentaram atividade inibitória. As substâncias testadas demonstraram alto grau de segurança tanto na integridade de membrana de eritrócitos em teste de hemólise, quanto na viabilidade em teste com MTT em culturas de fibroblasto MRC5, em cultura de células nervosas de retina de embrião de galinha e em melanoma B16F10. Assim, demonstrou-se que as substâncias S-02, S-04, S-06, S-07 e S-08 apresentam atividade como potentes inibidores de tirosinase, podendo ser candidatos no tratamento de desordens de pigmentação.