GABA and glutamate transporters: new events and function in the vertebrate retina

The neural retina is a highly complex tissue composed of excitatory and inhibitory neurons and glial cells. Glutamate, the main excitatory neurotransmitter, mediates information transfer from photoreceptors, bipolar cells, and ganglion cells, whereas interneurons, mainly amacrine and horizontal cells, use ��-aminobutyric acid (GABA), the main inhibitory neurotransmitter. In this review we place an emphasis on glutamate and GABA transporters as highly regulated molecules that play fundamental roles in neurotransmitter clearance, neurotransmitter release, and oxidative stress. We pharmacologically characterized glutamate transporters in chicken retina cells and identified two glutamate transporters: one Na+-dependent transporter and one Na+-independent transporter. The Na+-dependent uptake system presented characteristics related to the high-affinity xAG- system (EAAT1), and the Na+-independent uptake system presented characteristics related to the xCG- system, which highly contributes to glutamate transport in the retina. Glutamate shares the xCG- system with another amino acid, L-cysteine, suggesting the possible involvement of glutathione. Both transporter proteins are present mainly in M��ller glial cells. GABA transporters (GATs) mediate high-affinity GABA uptake from the extracellular space and terminate the synaptic action of GABA in the central nervous system. GABA transporters can be modulated by molecules that act on specific sites to promote transporter phosphorylation and dephosphorylation. In addition to a role in the clearance of GABA, GATs may also release GABA through a reverse transport mechanism. In the chicken retina, a GAT-1 blocker, but not GAT2/3 blocker, was shown to inhibit GABA uptake, suggesting that GABA release from retina cells is mainly mediated by a GAT-1-like transporter.

Caracteriza����o da cin��tica de capta����o de glutamato por cromatografia l��quida de alta efici��ncia em tecido retiniano

O presente estudo descreve um m��todo eficiente e simples utilizando cromatografia l��quida de alta efici��ncia (CLAE) acoplada a detector de fluoresc��ncia para determina����o dos par��metros cin��ticos da capta����o de glutamato (glu) no sistema nervoso central (SNC). O tecido retiniano embrion��rio de ave com sete dias de desenvolvimento foi incubado com concentra����es conhecidas de glu (50-500 ��M) por dez minutos. Os n��veis do amino��cido derivado a partir de ortoftalde��do (OPA) no meio de incuba����o foram mensurados. Ap��s avaliar a diferen��a entre a concentra����o de glu inicial e a final no meio, foi determinada a satura����o do mecanismo de capta����o (Km = 8,2 e Vmax = 9,8 nmol/mg prote��na/minuto). Estas determina����es foram dependentes e independentes de s��dio e temperatura, indicando que o mecanismo que regula a diminui����o dos n��veis de glu no SNC, �� a capta����o via transportadores de alta afinidade. Al��m disso, o cloreto de zinco (ZnCl) (um inibidor do transportador glu/aspartato) foi utilizado em diversas concentra����es e evocou diminui����o da capta����o de glu. Com isto, destaca-se a elevada aplicabilidade desta metodologia. Al��m deste trabalho caracterizar metodologia alternativa para avaliar capta����o de glu no SNC usando CLAE, tamb��m pode ser importante ferramenta para estudos relacionados �� caracteriza����o do transporte do neurotransmissor durante inj��rias no SNC.

Altera����es neuroqu��micas no tecido retiniano murino em modelo de mal��ria cerebral induzida pela infec����o por Plasmodium berghei (ANKA)

A Mal��ria Cerebral (MC) apresenta-se como uma severa complica����o resultante da infec����o por Plasmodium falciparum. Esta condi����o encontra-se comumente associada a disfun����es cognitivas, comportamentais e motoras, sendo a retinopatia uma das mais graves conseq����ncias da doen��a. Diversos modelos experimentais j�� foram descritos no intuito de elucidar os mecanismos fisiopatol��gicos relacionados a esta s��ndrome, no entanto, estes ainda permanecem pouco compreendidos. Dentro deste contexto, o presente trabalho procurou investigar as altera����es neuroqu��micas envolvidas na patologia da MC. Os camundongos C57Bl/6 (f��meas e machos) inoculados com ���106 eritr��citos parasitados (PbA) apresentaram baixa parasitemia (15-20%) com sinais cl��nicos evidentes como: defici��ncia respirat��ria, ataxia, hemiplegia e coma seguido de morte, condizentes com o quadro de MC. A an��lise no tecido retiniano demonstrou uma diminui����o nos n��veis de GSH com 2 dias ap��s a inocula����o. Entretanto, essa diminui����o n��o foi t��o evidente com o decorrer da infec����o (4�� e 6�� dias ap��s infec����o). Concomitante a este aumento durante o processo infeccioso, observamos um progressivo aumento na capta����o de 3H-glutamato (4�� e 6�� dia ap��s infec����o) por um sistema independente de Na+, sugerindo que o quadro de MC �� respons��vel por um aumento na atividade de uma prote��na transportadora. Dados obtidos com a imunofluoresc��ncia demonstram que al��m de aumentar a atividade do sistema de transporte, o quadro de MC tamb��m estimula o aumento na express��o do sistema xCG - no tecido retiniano. O presente trabalho demonstra ainda que estes eventos neuroqu��micos no tecido retiniano s��o independentes de ativa����o inflamat��ria, visto que os n��veis de TNF-�� e express��o de NOS-2, apresentam-se alterados somente no tecido retiniano.

An��lise prote��mica da resposta ao ars��nio e do exoproteoma de Chromobacterium violaceum

A Chromobacterium violaceum �� uma beta-proteobact��ria Gram-negativa comum da microbiota tropical e um pat��geno oportunista para animais e humanos. A infec����o causada pela C. violaceum apresenta alta taxa de mortalidade, mas os mecanismos da patogenicidade ainda n��o foram caracterizados. Como outros microorganismos ambientais, essa bact��ria est�� exposta a condi����es externas muito vari��veis, que exigem grande adaptabilidade e sistemas de prote����o eficientes. Entre esses sistemas encontra-se um operon arsRBC de resist��ncia ao ars��nio, metaloide danoso �� sa��de humana associado a les��es de pele, doen��as neurol��gicas e c��ncer. O objetivo deste trabalho foi investigar as altera����es na express��o proteica de C. violaceum ATCC 12472 na presen��a do arsenito e caracterizar as diversas prote��nas secretadas pela bact��ria. As prote��nas da C. violaceum foram analisadas por eletroforese bidimensional e espectrometria de massas. A an��lise prote��mica revelou que o arsenito induz um aumento na quantidade das prote��nas envolvidas na resposta ao estresse oxidativo, reparo do DNA e metabolismo energ��tico. Entre as prote��nas secretadas, foram identificados fatores de virul��ncia (metalopeptidases, colagenase e toxinas), transportadores, prote��nas de prote����o contra estresses e com potencial aplica����o biotecnol��gica. Os resultados mostraram que a C. violaceum possui um arsenal molecular de adapta����o que a torna capaz de conservar suas atividades celulares e provocar les��es em outros organismos.

Avalia����o pr��-cl��nica da duloxetina em modelo de convuls��o: an��lise comportamental, eletroencefalogr��fica e influ��ncia no estresse oxidativo

O transtorno epil��ptico apresenta alta preval��ncia e severidade. Al��m da gravidade da epilepsia per se, este dist��rbio pode ser acompanhado de v��rias comorbidades, sendo a depress��o a principal comorbidade psiqui��trica. Os mecanismos envolvidos na rela����o epilepsia/depress��o ainda n��o est��o bem esclarecidos, e sabe-se que o tratamento de ambos os dist��rbios pode ser problem��tico, j�� que alguns anticonvulsivantes podem causar ou aumentar sintomas depressivos, enquanto alguns antidepressivos parecem aumentar a susceptibilidade a convuls��es. Por outro lado, estudos t��m demonstrado que alguns antidepressivos, al��m de seguros, tamb��m possuem atividade anticonvulsivante como a venlafaxina, um inibidor da recapta����o de serotonina e noradrenalina (IRSN). Considerando que a duloxetina, outro IRSN, apresenta uma inibi����o mais potente sobre transportados monoamin��rgicos e que n��o existe nada na literatura a respeito de sua influ��ncia sobre convuls��es apesar de que est�� sendo aplicado atualmente na cl��nica, o objetivo do nosso estudo �� verificar o poss��vel efeito anticonvulsivante da duloxetina atrav��s do modelo de convuls��es induzidas pelo pentilenotetrazol (PTZ) em camundongos. Para tal, camundongos foram pr��-tratados com duloxetina (10, 20, 40 mg/kg/i.p.) e trinta minutos ap��s receberam uma inje����o intraperitoneal de PTZ (60 mg/kg). Por vinte minutos os animais foram monitorados para a avalia����o dos tempos de lat��ncia para o primeiro espasmo miocl��nico e a primeira crise t��nico-cl��nica, como tamb��m o tempo de dura����o das convuls��es e de sobrevida. A an��lise eletroencefalogr��fica foi utilizada para avaliar a severidade das crises (aumento da amplitude das ondas). Ap��s esse per��odo os animais foram sacrificados, o c��rtex cerebral dissecado e an��lises bioqu��micas (atividade da super��xido desmutase (SOD), catalase (CAT), n��veis de nitritos e peroxida����o lip��dica) foram feitas para investiga����o dos mecanismos pelos quais a droga influencia as convuls��es. Os resultados preliminares demonstraram que a duloxetina apresenta atividade anticonvulsivante, sendo capaz de aumentar significativamente o tempo de lat��ncia tanto para o primeiro espasmo cl��nico, como para a primeira convuls��o t��nico-cl��nica induzidas pelo pentilenotetrazol. Ainda a avalia����o eletroencefalogr��fica demonstrou que a duloxetina na dose de 20 mg/kg diminuiu significativamente a amplitude das ondas enquanto a dose de 40 mg/kg aumentou significativamente a amplitude em compara����o a todos os tratamentos. Quanto �� avalia����o da influ��ncia no estresse oxidativo, animais tratados apenas com PTZ apresentaram um aumento significativo do n��vel de peroxida����o lip��dica, e diminui����o da atividade da SOD e da CAT. Quanto ao n��vel de nitritos n��o houve nenhuma altera����o significativa entre os tratamentos. A duloxetina na dose de 20 mg/kg se mostrou efetiva para evitar as altera����es induzidas pelo PTZ nos par��metros de estresse oxidativo avaliados. A atividade anticonvulsivante da duloxetina (20 mg/kg) colabora com a teoria que tem sido apresentada nos ��ltimos ano de que a modula����o da neurotransmiss��o seroton��rgica e noradren��rgica pode ter efeito anticonvulsivante. Ainda, a capacidade da duloxetina de inibir a exacerba����o do estresse oxidativo envolvido nas convuls��es induzidas pelo PTZ corrobora com estudos que demonstram que algumas subst��ncias anticonvulsivantes podem modular as convuls��es pelo menos em parte por sua atividade antioxidante. Portanto conclu��mos que a duloxetine �� um adjuvante promissor para o tratamento de pacientes que apresentam a comorbidade epilepsia e depress��o.

Papel da serotonina no comportamento defensivo do paulistinha (Danio rerio Hamilton 1822) adulto: Diferen��as entre modelos comportamentais, linhagens, e efeitos do estresse predat��rio agudo

Os transtornos de ansiedade apresentam a maior incid��ncia na popula����o mundial dentre os transtornos psiqui��tricos, e a efic��cia cl��nica das drogas ansiol��ticas �� baixa, em parte devido ao desconhecimento acerca das bases neuroqu��micas desses transtornos. Para uma compreens��o mais ampla e evolutivamente substanciada desses fen��menos, a utiliza����o de esp��cies filogeneticamente mais antigas pode ser uma aproxima����o interessante no campo da modelagem comportamental; assim, sugerimos o uso do paulistinha (Danio rerio Hamilton 1822) na tentativa de compreender a modula����o de comportamentos tipo-ansiedade pelo sistema seroton��rgico. Demonstramos que os n��veis extracelulares de serotonina no enc��falo de paulistinhas adultos expostos ao teste de prefer��ncia claro/escuro [PCE] (mas n��o ao teste de distribui����o vertical eliciada pela novidade [DVN]) apresentam-se elevados em rela����o a animais manipulados mas n��o expostos aos aparatos. Al��m disso, os n��veis teciduais de serotonina no rombenc��falo e no prosenc��falo s��o elevados pela exposi����o ao PCE, enquanto no mesenc��falo s��o elevados pela exposi����o ao DVN. Os n��veis extracelulares de serotonina est��o correlacionados negativamente com a geotaxia no DVN, e positivamente com a escototaxia, tigmotaxia e a avalia����o de risco no PCE. O tratamento agudo com uma dose baixa de fluoxetina (2,5 mg/kg) aumenta a escototaxia, a tigmotaxia e a avalia����o de risco no PCE, diminui a geotaxia e o congelamento e facilita a habitua����o no DVN. O tratamento com buspirona diminui a escototaxia, a tigmotaxia e o congelamento nas doses de 25 e 50 mg/kg no PCE, e diminui a avalia����o de risco na dose de 50 mg/kg; no DVN, ambas as doses diminuem a geotaxia, enquanto somente a maior dose diminui o congelamento e facilita a habitua����o. O tratamento com WAY 100635 diminui a escototaxia nas doses de 0,003 e 0,03 mg/kg, enquanto somente a dose de 0,03 mg/kg diminui a tigmotaxia e a avalia����o de risco no PCE. No DVN, ambas as doses diminuem a geotaxia, enquanto somente a menor dose facilita a habitua����o e aumenta o tempo em uma ���base��� (���homebase���). O tratamento com SB 224289 n��o produziu efeitos sobre a escototaxia, mas aumentou a avalia����o de risco na dose de 2,5 mg/kg; no DVN, essa droga diminuiu a geotaxia e o nado err��tico nas doses de 2,5 e 5 mg/kg, enquanto a dose de 2,5 mg/kg aumentou a forma����o de ���bases���. O tratamento com DL-para-clorofenilalanina (2 inje����es de 300 mg/kg, separadas por 24 horas) diminuiu a escototaxia, a tigmotaxia e a avalia����o de risco no PCE, aumentou a geotaxia e a forma����o de bases e diminuiu a habitua����o no DVN. Quando os animais s��o pr��-expostos a uma ���subst��ncia de alarme��� co-espec��fica, observa-se um aumento nos n��veis extracelulares de serotonina associados a um aumento na escototaxia, congelamento e nado err��tico no PCE; os efeitos comportamentais e neuroqu��micos foram bloqueados pelo pr�� tratamento com fluoxetina (2,5 mg/kg), mas n��o pelo pr��-tratamento com WAY 100,635 (0,003 mg/kg). Animais da linhagem leopard apresentam maior escototaxia e avalia����o de risco no PCE, assim como n��veis teciduais elevados de serotonina no enc��falo; o fen��tipo comportamental �� resgatado pelo tratamento com fluoxetina (5 mg/kg). Esses dados sugerem que o sistema seroton��rgico dessa esp��cie modula o comportamento no DVN e no PCE de forma oposta; que a resposta de medo produzida pela subst��ncia de alarme tamb��m parece aumentar a atividade do sistema seroton��rgico, um efeito possivelmente mediado pelos transportadores de serotonina, e ao menos um fen��tipo mutante de alta ansiedade tamb��m est�� associado a esses transportadores. Sugere-se que, de um ponto de vista funcional, a serotonina aumenta a ansiedade e diminui o medo em paulistinhas.