Caracterização molecular de cepas do vírus respiratório sincicial isoladas de casos de infecção respiratória aguda na cidade de Belém, Pará, Brasil nos anos de 2000 a 2006

As doenças do trato respiratório são as principais queixas nos serviços de atendimento médico, sendo as infecções respiratórias agudas (IRA) as manifestações mais comuns, principalmente em crianças menores de cinco anos de idade. Em países em desenvolvimento as IRA constituem um sério problema de saúde pública. Em todo mundo estima-se que ocorram cerca de dois milhões de mortes devido as IRA a cada ano. Dentre os agentes causais das mesmas, destaca-se o Vírus Respiratório Sincicial (VRS), especialmente por causar doença grave em crianças menores de dois anos. Com o objetivo de gerar dados sobre a epidemiologia molecular deste vírus, foram analisadas amostras colhidas de pacientes com IRA no período de 2000 a 2006 na cidade de Belém, Pará. Foram utilizados testes de imunofluorescência indireta (IFI) para caracterização antigênica dos vírus isolados e RT-PCR para os genes codificadores das proteínas G e F, que foram em seguida parcialmente seqüenciados. Dentro do período estudado, 153 amostras positivas para VRS foram detectadas. A faixa etária de 0-4 anos foi a que concentrou maior número de casos (n=138; 90,19%). Em relação ao perfil sazonal, o pico de atividade do VRS ocorreu nos primeiros seis meses do ano, estando associado principalmente ao período de troca da estação chuvosa para um período de menor pluviosidade. Houve co-circulação dos subgrupos A e B nos anos de 2001 e 2003. Em 2000, 2005 e 2006 somente o subgrupo A circulou. Entretanto no ano de 2004 foi registrada a ocorrência somente do subgrupo B. Dentro do período estudado, genótipos distintos da proteína G do subgrupo A (GA2 e GA5) e do subgrupo B (SAB1 e SAB3) foram detectados, indicando o primeiro relato da circulação do genótipo SAB1 na América do Sul. Em 2004, um cluster diferenciado dos demais genótipos circulantes foi encontrado, sendo este denominado BRB1. A análise do gene codificador da proteína F permitiu a identificação de mutações na sequência nucleotídica resultando em trocas na cadeia aminoacídica da mesma. Este estudo representa o primeiro relato sobre dados da epidemiologia molecular do Vírus Respiratório Sincicial na região Norte do Brasil.

Caracterização morfológica e antigênica do vírus Juruaçá, isolado de morcego no estado do Pará

O vírus Juruaçá (AN 401933) foi isolado a partir de um lote de vísceras de um morcego capturado na região de Porto Trombetas, município de Oriximiná, Estado do Pará, em 1982, sendo considerado um vírus não grupado/ não classificado. O objetivo deste trabalho foi classificar o vírus Juruaçá em um táxon viral, baseando-se nas suas propriedades morfológicas, físico-químicas, antigênicas e moleculares, bem como descrever as alterações anatomo-patológicas associadas à infecção experimental. Camundongos recém-nascidos mostraram suscetibilidade à infecção pelo vírus Juruaçá por inoculação i.c., iniciando os sintomas com quatro dias p.i. e culminando com morte dos animais oito dias p.i.. O vírus não é sensível à ação do DCA e consegue aglutinar hemácias de ganso em pH 5,75. Pelos testes de IH e FC, o vírus não se relaciona com nenhum arbovírus ou outros vírus de vertebrados conhecidos testados, reagindo apenas com o seu soro homólogo. O vírus não causa ECP em linhagens de células Vero e C6/36, e IFI destas células também foi negativa. Entretanto, o vírus Juruaçá replica em cultivo primário de células do SNC de camundongo (astrócitos e microglias), confirmada por IFI com dupla marcação. Cultivos de neurônios não se mostraram susceptíveis à infecção pelo vírus Juruaçá, porém a presença do antígeno viral nestas células foi confirmada por imunohistoquímica. A microscopia eletrônica de transmissão revelou a presença de partículas esféricas, com um diâmetro médio de 23-30nm. Alterações anatomo-patológicas foram observadas principalmente no SNC de camundongos infectados experimentalmente com o vírus Juruaçá. O resultado do RT-PCR sugere que o vírus Juruaçá pode ser um novo vírus pertencente à família Picornaviridae, gênero Enterovirus.

Infecção persistente pelos flavivírus Ilhéus e Rocio em hamsters dourados jovens (Mesocricetus auratus)

Os arbovírus Ilhéus (VILH) e Rocio (VROC) são flavivirus (família Flaviviridae, gênero Flavivirus) de grande importância para a saúde pública no Brasil por estar relacionados a casos de encefalites em humanos. Sabe-se que outros flavivírus estão envolvidos com a infecção persistente in vitro, in vivo e em relatos clínicos. Deste modo, o objetivo desse trabalho foi investigar a possível ocorrência de infecção persistente in vivo dos VILH e VROC utilizando hamsters dourados jovens (Mesocricetus auratus) como modelo experimental. Os hamsters foram inoculados com suspensão de cérebros de camundongos recém-nascidos infectados com títulos de 9,8 e 9,6 DL₅₀ /0,02 mL do VROC e VILH respectivamente, pela via intraperitoneal, sendo em seguida a intervalos pré-determinados, anestesiados e sacrificados para coleta de amostras de sangue, soro, urina e órgãos durante quatro meses (120 dias) pós-inoculação (p.i.). A quantificação viral foi calculada em amostras de cérebro, fígado e sangue, pela técnica de RT-PCR em tempo real (qRT-PCR). Todas as amostras coletadas foram inoculadas em célula VERO para confirmação de replicação viral, sendo detectados antígenos virais pelo teste de imunofluorescência indireta (IFI), os níveis de anticorpos foram determinados pelo teste de inibição da hemaglutinação. Exame histopatológico por hematoxilina-eosina e detecção de antígenos virais por imunohisquímica foram avaliados nas amostras de vísceras e encéfalos coletados durante a cinética. O estudo demonstrou que hamsters dourados jovens constituem um bom modelo experimental para infecção persistente pelos flavivírus VILH e VROC. Os dois vírus induziram uma forte resposta imune, embora os níveis de anticorpos para o VILH tenham sido maior do que para o VROC; já o VROC mostrou-se mais patogênico nestes animais, sugerindo uma capacidade de neurovirulência maior que o VILH. Das amostras coletadas dos hamsters infectados e inoculadas em células VERO foi possível isolar ambos os vírus a partir de todos os órgãos, sangue, soro e urina, sendo confirmada a replicação viral por IFI. Quanto à infecção persistente, o VROC foi detectado, pela técnica de qRT PCR, por três meses p.i., no cérebro, fígado e sangue, enquanto o VILH apresentou persistência viral apenas no cérebro durante 30 dias p.i. por qRT PCR. O VROC foi capaz de produzir alterações histopatológicas e células imuno-marcadas expressando antígenos virais nas amostras de fígado, rim, pulmão e cérebro por quatro meses. Ao passo que para o VILH, as alterações histopatológicas e a expressão de antígenos virais nas amostras de fígado, rim e pulmão ocorreram por 30 dias p.i.; e no cérebro por quatro meses p.i.; Os achados deste estudo demonstraram que ambos os vírus apresentaram capacidade de causar infecção persistente em hamsters infectados por via periférica, sendo necessários mais estudos para determinar os mecanismos fisiopatológicos e a patogênese de estabelecimento dessas infecções persistentes.

Estudo epidemiológico da raiva, caracterização antigênica de cepas do vírus da raiva isoladas na Amazônia brasileira

Com o objetivo de avaliar a epidemiologia da raiva, procedimentos complementares ao diagnóstico - caracterização antigênica e genética - foram incluídos neste estudo para investigar o perfil epidemiológico da raiva animal na Amazônia brasileira, entre janeiro de 2000 e julho de 2009. Foi realizada uma revisão cuidadosa das informações de amostras do sistema nervoso central (SNC) recebidas e analisadas no Laboratório de Raiva do Instituto Evandro Chagas. Um total de 265 cepas de vírus rábico isoladas de amostras do SNC de seres humanos (n=33) e animais domésticos/silvestres (n=232) foram caracterizadas antigenicamente por imunofluorescência indireta (IFI), utilizando um painel de oito anticorpos monoclonais preparados pelo CDC contra a nucleoproteína do vírus da raiva; Além disso, 21 delas tiveram a nucleoproteína (gene N) caracterizada geneticamente por sequenciamento nucleotídico parcial seguida de análise filogenética. As sequências obtidas foram comparadas entre si e com outras sequências de vírus da raiva do Brasil e outros países das Américas, utilizando os métodos de máxima verossimilhança e bayesiano. Foi observada uma menor transmissão do vírus da raiva em áreas urbanas; detecção do ciclo rural da raiva em quase todos os estados da Amazônia; ocorrência do ciclo aéreo nos estados do Pará e Amapá; identificação da variante antigênica 2 (AgV2) do vírus da raiva, entre cães e gatos domésticos como o principal mecanismo de transmissão viral, detecção de circulação de variantes antigênicas AgV3, AgV4 e variante "Eptesicus" entre animais silvestres e, finalmente, a redução da transmissão cão-homem do vírus da raiva, que foi substituído por um aumento da transmissão morcego-homem, especialmente no estado de Pará. Em conclusão, a associação de técnicas antigênica e moleculares permitiu uma melhor compreensão da epidemiologia molecular do vírus da raiva na Amazônia Brasileira.

Prevalência da co-infecção Leishmania/HIV em pacientes atendidos em unidades de referência do município de Belém

Com o objetivo de investigar a prevalência da co-infecção Leishmania/HIV em pacientes sorologicamente positivos para o HIV, sem histórico da co-infecção, foi realizado um estudo transversal através de análise de ficha clínico-epidemiológica aplicada aos pacientes registrados nas unidades de referência para aids em belém: CASA DIA e URE - DIPE, no período de julho a outubro de 2008. Foram coletadas amostras de sangue de 377 pacientes que concordaram em participar da pesquisa, por análise de IFI e PCR e em 55 deles foi realizada a IDRM. A média de idade foi de 38,2 anos e 59% dos pacientes era do sexo feminino. A carga viral média entre os 249 pacientes que apresentaram informações completas a respeito desta variável, foi de 30952,2. A IFI foi positiva em 08 pacientes e a PCR foi positiva em 22. Um total de 214 pacientes encontrva-se em tratamento com TARV. Foram registrados 218 pacientes com episódios de doenças associados à condição HIV positivos. Cinco pacientes relataram episódio de co-infecção M. leprae/HIV, e nenhum deles apresentou resultado positivo para Leishmania pela PCR. O uso de drogas intravenosas foi relatado por 27 pacientes, porém apenas um apresentou PCR positivo, indicando que a transmissão não foi do tipo inter-humana. Dentre os pacientes que foram submetidos à IDRM, nenhum apresentou reação positiva. No presente trabalho, a técnica de PCR foi mais sensível que a reação de IFI, 6% e 2%, respectivamente.

Estudo genotípico de Trypanosoma cruzi: epidemiologia e caracterização molecular de isolados do homem, triatomíneos e mamíferos silvestres do Pará, Amapá e Maranhão

A doença de Chagas aguda (DCA) é endêmica na Amazônia Brasileira sendo a via oral a principal forma de transmissão com surtos familiares ou multifamiliares. Esta via independe da colonização de triatomíneos no domicílio e a ocorrência é regular com média de 100 casos/ano e 5% de óbitos. Apresenta distribuição espaço-temporal bem definida, colocando a enfermidade como emergência de importância em saúde pública nos estados do Pará, Amapá e Amazonas. A presença de mamíferos e triatomíneos silvestres, infectados naturalmente com o c e habitando distintos ecótopos terrestres e arbóreos, mantém um intenso ciclo enzoótico em toda a Amazônia. Perfis moleculares de linhagens de T. cruzi na região estão associados a hospedeiros mamíferos (incluindo o homem), triatomíneos, ecótopos e manifestações clínicas. Foram estudados quatro surtos de DCA ocorridos nos Municípios de Barcarena, Belém e Cachoeira do Arari no Estado do Pará e em Santana, no Estado do Amapá e abordados os aspectos epidemiológicos (parasitológico e sorológico manifestações clínicas, reservatórios e triatomíneos silvestres associados aos surtos). Foi investigado também em São Luís, Estado do Maranhão, o ciclo domiciliar e silvestre do T. cruzi, porém sem a ocorrência de casos de DCA. O estudo incluiu também a genotipagem molecular de T. cruzi pelo gene de mini-exon dos isolados (homem, mamíferos e triatomíneos silvestres) associados aos diferentes ciclos de transmissão. O diagnóstico parasitológico foi confirmado em 63 pacientes com a seguinte sensibilidade nos testes aplicados: 41,3% (26/63) pela gota espessa; 58,7% (37/63) no QBC; 79,4% (50/63) no xenodiagnóstico e 61,9% (39/63) na hemocultura. A sorologia de 2648 pessoas por hemaglutinação indireta (HAI) foi de 3,05% (81/2648) e imunofluorescência indireta IFI apresentaram respectivamente resultados de e 2,49% (66/2648) para IgG e 2,37 (63/2648) para IgM. Os resultados em São Luís foram todos negativos. Foram capturados 24 mamíferos, 13 Didelphis marsupialis, 1 Marmosa cinerea, 5 Philander opossum, 3 Metachirus nudicaudatus, 1 Oryzomys macconnelli, 1 Oecomys bicolor e 433 R. rattus. A taxa de infecção para T. cruzi foi de 7,14% (29/404). Um total de 3279 triatomíneos foi capturado sendo: Triatoma rubrofasciata (n=3008), com taxa de infecção (TI) de 30.46%, (39/128), Rhodnius robustus (n=137), com TI de 76% (79/104), R. pictipes (n=94), TI de 56,9% (49/86%), E. mucronatus (n=6) e P. geniculatus (n=12) com TI de 50% e as demais espécies sem infecção R. neglectus (n=5) e P. lignarius (n=6). As palmeiras foram os principais ecótopos dos triatomíneos silvestres. O urucurizeiro (S. martiana) apresentava infestação de 47,41% (101/213) dos triatomíneos; o “inajazeiro” (Maximiliana regia) 35,21% (75/213); o “babaçueiro” (Orbgnya. speciosa) 5,16% (11/213); o “dendezeiro” (Eleas melanoccoca) 1,87% (4/213) e a “bacabeira” (Oenocarpus bacaba) 10,32% (22/213). Para a genotipagem foram obtidos 46 isolados de tripanossomas de origem humana, 31 isolamentos de mamíferos silvestres e 74 amostras de triatomíneos. Todos os isolados foram caracterizados como da linhagem TcI de T. cruzi. Todos os casos humanos no Pará foram caracterizados como positivos por exame parasitológico. Nem todos os casos de Santana, Amapá, apresentaram casos parasitológicos positivos, pela demora do diagnóstico, mesmo assim estes foram definidos como DCA. Exames como xenodiagnóstico, hemocultura e o QBC® foram mais sensíveis do que a gota espessa. A sorologia por HAI e IFI (IgG e IgM) tiveram excelente sensibilidade para detectar os casos agudos em tempos distintos de infecção. O achado de mamíferos (D. marsupilais) e triatomíneos silvestres (R. pictipes e P. geniculatus) infectados com consideráveis taxas de infecção para T. cruzi no entorno das residências dos pacientes sustentam a importância destes hospedeiros associados à transmissão da DCA. Apesar de na Amazônia circularem vários genótipos de T. cruzi nos diferentes hospedeiros, neste trabalho foi identificada somente a linhagem TCI de T. cruzi, a mais predominante na Região. Em São Luís, Maranhão, embora sem registro de casos de DCA apresenta um ciclo domiciliar associados ao rato doméstico e o triatomíneo da espécie T. rubrofasciata, e um ciclo silvestre mantido por didelfídeos. Nos dois ciclos circulam a linhagem TCI de T. cruzi. Estudos com marcadores de maior resolução com isolados de T. cruzi regionais podem ajudar a esclarecer os ciclos de transmissão, as rotas de contaminação e os hospedeiros envolvidos em casos de DCA na Amazônia.